真菌感染與實(shí)驗(yàn)室診斷進(jìn)展課件

1、真菌感染與實(shí)驗(yàn)室診斷進(jìn)展真菌感染與實(shí)驗(yàn)室診斷進(jìn)展真菌感染與實(shí)驗(yàn)室診斷進(jìn)展侵襲性真菌感染發(fā)展趨勢(shì) 患者年齡的增高 廣譜抗生素的應(yīng)用 更多、更復(fù)雜的醫(yī)療手段（如移植等） 高強(qiáng)度細(xì)胞毒性治療的應(yīng)用 免疫抑制劑的應(yīng)用 其它病因死亡率相對(duì)降低2Candida條件致病菌Aspergillus機(jī)會(huì)來了！念珠菌曲霉菌3條件致病真菌感染危險(xiǎn)因素國外：血液系統(tǒng)腫瘤病人 粒細(xì)胞減少 _骨髓移植器官移植ICUHIV感染 國內(nèi):廣譜抗生素應(yīng)用ICU皮質(zhì)激素糖尿病靜脈插管4膿毒血癥的發(fā)病率+600%+300%+300%Martin et al, NEJM 2003;348:154657879808182838485868

2、7888990919202468Aspergillus spp.Candida spp.All otherPrevalence at Autopsy %Groll et al, J Infect 1996;33:23-32.經(jīng)尸檢證實(shí)的侵襲性真菌感染6國內(nèi)侵襲性真菌感染的發(fā)病情況中華醫(yī)學(xué)雜志2003年3月第83卷第5期72004-2008年中國5家中心的念珠菌分布百分比（）真菌8侵襲性曲霉患者在血液科和ICU最為常見流行病學(xué)1994-1999年法國一項(xiàng)前瞻性調(diào)查結(jié)果Cornet m et al. J Hosp infect. 2002;514:288-2969混合型真菌感染的發(fā)病率也逐年上升念

3、珠菌/曲霉混合感染81112尸檢檢出率(%)1989-1993年1994-1998年1999-2003年Chamilos G,et al.Haematological.2006;91:986-989一項(xiàng)對(duì)三級(jí)腫瘤監(jiān)護(hù)中心血液腫瘤患者的尸檢結(jié)果顯示10新近出現(xiàn)少見真菌尸檢檢出率也有所上升足放線菌鐮刀菌0.20.90.40.70.71.4尸檢檢出率(%)1989-1993年1994-1998年1999-2003年Chamilos G,et al.Haematological.2006;91:986-989一項(xiàng)對(duì)三級(jí)腫瘤監(jiān)護(hù)中心血液腫瘤患者的尸檢結(jié)果顯示11Epidemiology and Outc

4、omes of Candidemia in 2019 PatientsClinical Infectious Diseases 2009; 48:1695703美國PATH網(wǎng)絡(luò)：侵襲性真菌病數(shù)據(jù)庫念珠菌血癥2019例 (2004-2008)念珠菌血癥菌種比例大部分患者為非粒缺患者(占92.7%)12Epidemiology and Outcome of Invasive Fungal Infection in Adult Hematopoietic Stem Cell Transplant RecipientsClinical Infectious Diseases 2009; 48:2657

5、3John Bartlett.2009 ICAAC.美國PATH網(wǎng)絡(luò)：侵襲性真菌病數(shù)據(jù)庫成人HSCT患者的侵襲性真菌病 (2004-2007)共234例患者發(fā)生250次侵襲性真菌感染(確診或臨床診斷)13真菌感染流行特點(diǎn) 危險(xiǎn)因素不斷增多，發(fā)生率逐年增高 白念珠菌仍然是最常見的致病菌 非白念珠菌和霉菌不斷增加 曲霉已成為重要的致死真菌14曲霉感染: 日益嚴(yán)重的問題曲霉是繼念珠菌之后的第二常見真菌病原體雖然經(jīng)過治療，免疫抑制患者的死亡率仍達(dá)90%Andriole VT. J Antimicrob Chemother 1999;44:151-162; Groll AH et al. Adv Pha

6、rmacol 1998;44:343-500; Denning DW. Clin Infect Dis 1998;26:781-805; Andriole VT. Curr Clin Top Infect Dis 1998;18:19-36; Lin S-J et al. Clin Infect Dis 2001;32:358-366; Paterson DL, Singh N. Medicine (Baltimore) 1999;78:123-138.15深部真菌感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)EORTC/MSG 2008修訂版宿主因素臨床特征病原學(xué)真菌鏡檢真菌培養(yǎng)組織病理學(xué)檢查血清學(xué)檢查方法（間接證據(jù)） C

7、SF隱球菌抗原陽性確診 GM-test, G-test臨床診斷Clinical Infectious Diseases 2008; 4616臨床希望能鑒別念珠菌或絲狀真菌白色念珠菌或非白念曲霉菌或毛霉菌是否卡氏肺囊蟲17 微生物實(shí)驗(yàn)室檢查真菌鏡檢真菌培養(yǎng)組織病理生理生化血清學(xué)方法分子生物學(xué) 18 真菌標(biāo)本鏡檢 最簡(jiǎn)單也是最有用的實(shí)驗(yàn)室診斷方法優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、快速，陽性結(jié)果可確定真菌感染，陰性結(jié)果不能排除診斷。采用不染色濕片如KOH涂片或Gram染色涂片。如在無菌體液的直接鏡檢中發(fā)現(xiàn)真菌，?？纱_立深部真菌病的診斷。19真菌直接涂片的診斷價(jià)值 有意義的涂片結(jié)果 機(jī)體內(nèi)部標(biāo)本如血液、腹水、CSF、膿腫穿

8、刺液等 新鮮尿液見到大量菌絲及孢子 組織真菌涂片 直接鏡檢患者痰、喉或氣管分泌物陽性率為10%到30%20真菌直接涂片的診斷價(jià)值診斷陽性率高BALF培養(yǎng)陽性率40，涂片64，涂片培養(yǎng)67(Ann Intern Med 1997, 29: 535; Respir Med 1992, 86:243)快速:2-4hr可以報(bào)告結(jié)果有助于鑒別感染類型有隔菌絲：曲霉菌屬唑類抗真菌藥（伊曲康唑、伏立康唑）有效無隔菌絲： 根毛霉屬、根霉屬、毛霉屬、犁頭霉屬、小克銀漢霉屬 兩性霉素B敏感The lancet, 2003, 3: 230-24021真菌直接涂片的診斷價(jià)值肺毛霉菌病：真菌培養(yǎng)的陽性率不高怕“冷”組織

9、勻漿可能會(huì)破壞毛霉菌，“假陰性”有時(shí)，直接涂片是唯一診斷手段診斷肺毛霉菌病的治療價(jià)值首選肺葉切除次選兩性霉素B（唑類抗真菌藥無效）卡氏肺孢子菌：無法體外培養(yǎng)The lancet, 2003, 3: 230-24022 微生物培養(yǎng)技術(shù)有意義的真菌培養(yǎng)標(biāo)本非經(jīng)口痰標(biāo)本非插管尿標(biāo)本血液或其他無菌體液、(膽汁、胸腹水、腦脊液）23 微生物培養(yǎng)技術(shù)無菌部位采集的標(biāo)本(如血,CSF、胸腹水、關(guān)節(jié)液等)中分離的任何酵母都必須鑒定到種，均有診斷意義。同一部位反復(fù)分離出同一菌種也具重要意義。從非無菌部位(糞、痰、咽拭等)分離到的條件致病菌(如白念珠菌)，如直接鏡檢大量菌絲(+)，須結(jié)合臨床認(rèn)定具致病性。24培養(yǎng)

10、陽性率最高的絲狀真菌曲霉菌屬：185種，約20種被報(bào)道過，其中煙曲霉、黃曲霉是常見的致病菌可從痰、支氣管灌洗液、血、腦脊液、角膜刮出物、外耳道、鼻竇、腹膜液、玻璃體中分離到煙曲霉黃曲霉25重要的真菌感染的表現(xiàn)表現(xiàn)念珠菌曲霉菌發(fā)熱多發(fā)性關(guān)節(jié)炎血脲素氮皮膚損害肝損害罕見竇道呼吸系統(tǒng)中樞系統(tǒng) 稀少John R. Wingard，IDSA， 200526合理判斷實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果在無菌條件下獲取的體液，如檢測(cè)出真菌，應(yīng)考慮到有侵入性真菌感染，可作為臨床開始治療真菌的充分依據(jù)。在腹腔中分離到既有細(xì)菌又有念珠菌時(shí)，只有當(dāng)抗細(xì)菌治療無效時(shí)才考慮抗真菌治療。（高?；颊邉t需要給予抗真菌治療）。 27合理判斷實(shí)驗(yàn)室的結(jié)

11、果 尿液：未進(jìn)行過泌尿系統(tǒng)操作，沒有留置過尿管的病人，出現(xiàn)明顯念珠菌尿，提示有血源性的腎感染。 注意：無糖尿病、泌尿生殖系統(tǒng)異?；驔]有腎移植的病人，如導(dǎo)尿管中出現(xiàn)念珠菌尿，但無臨床癥狀，不治療，應(yīng)盡量除去假體材料或?qū)Ч堋?8合理判斷實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果白色念珠菌是正常寄植菌，其臨床意義及監(jiān)測(cè)部位及集落形成的數(shù)量有關(guān)。糞白色念珠菌計(jì)數(shù)105cfu/g或尿105cfu/ml為致病性。其他念珠菌、隱球菌、曲霉菌等不屬于正常菌群，一旦陽性并排除污染后即有意義。兩個(gè)或兩個(gè)以上非相鄰解剖部位的播散性念珠菌感染較菌血癥的危險(xiǎn)性和死亡率均高。29呼吸道標(biāo)本分離到真菌有意義嗎?這是困擾臨床醫(yī)生的一個(gè)難題。分析該真菌的臨

12、床價(jià)值應(yīng)該由臨床醫(yī)生和微生物專家共同完成，應(yīng)結(jié)合病人基礎(chǔ)病進(jìn)行分析。30氣道分泌物中分離出假絲酵母菌意義 人類口腔正常定植菌，正常人2055痰中可分離出假絲酵母菌屬 假絲酵母菌肺炎少見 發(fā)病率大約0.234.5 25例ICU患者的尸體解剖研究： 10例（40）假絲酵母菌培養(yǎng)陽性 只有2例（8）是真正的假絲酵母菌肺炎 用肺泡灌洗液或毛刷作真菌計(jì)數(shù),在24例103cfu/ml無一例是念珠菌感染 實(shí)驗(yàn)室報(bào)告會(huì)增加唑類藥物的應(yīng)用和耐藥性。31痰和BAL檢查的診斷意義 上氣道念珠菌定植常見，氣道分泌物（痰和BALF）培養(yǎng)陽性不能作為侵襲性感染的證據(jù)。 EORTC/MSG定義： 痰和BALF中絲狀真菌和隱

13、球菌鏡檢和培養(yǎng)陽性作為感染的微生物學(xué)證據(jù)，而念珠菌培養(yǎng)陽性（無論3次還是更多）只是定植。32鏡檢和培養(yǎng)方法敏感性低 血培養(yǎng)：在腫瘤和血液病病人中，50%尸檢證實(shí)深部念珠菌感染的病例血培養(yǎng)陰性。培養(yǎng)結(jié)果陽性僅表示存在某種真菌，區(qū)分定植和感染困難 培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng) 有些標(biāo)本采集困難33近年來診斷的進(jìn)展？胸部CT掃描 Pulmonary CT scan非培養(yǎng)微生物檢查技術(shù) Non-culture based34非培養(yǎng)診斷的方法簡(jiǎn)介真菌細(xì)胞壁成分 （1-3）- D-葡聚糖檢測(cè)（G試驗(yàn)） 真菌抗原檢查 半乳甘露聚糖（galactomannan) 抗原（GM) 甘露聚糖(mannan)抗原 隱球菌莢膜多糖抗原（

14、乳膠凝集試驗(yàn)） 真菌特異的代謝產(chǎn)物（D-阿拉伯糖醇） 真菌DNA的檢測(cè)35曲霉菌半乳甘露聚（GM）曲霉菌細(xì)胞壁上一種多聚糖抗原可以從血清、腦脊液、胸水、BALF檢測(cè)到方法：ELISA（BioRad）：敏感性高 1ng/mlLatex agglutination： 15ng/ml36半乳甘露聚糖檢測(cè)診斷侵襲性曲霉病(GM試驗(yàn))Diagnosis of invasive aspergillosis using a galactomannan assay-a meta-analysis. Clin Infect Dis, 2006; 42:141727O Marchetti. New Develop

15、ments and Challenges in Diagnostics of Invasive Fungal Infections. 4th Trends in Medical Mycology.1996-2005年27項(xiàng)研究的Meta分析患者類型樣本量敏感度(95%CI)特異度(95%CI)惡性血液病296070% (62-77%)92%(90-93%)異基因HSCT90382% (70-90%)86%(83-88%)實(shí)體器官移植22422%-40% (3-60%)84%(78-88%)37支氣管肺泡灌洗液半乳甘露聚糖檢測(cè)O Marchetti. New Developments and C

16、hallenges in Diagnostics of Invasive Fungal Infections. 4th Trends in Medical Mycology.Galactomannan in bronchoalveolar lavage fluid-a tool for diagnosing aspergillosis in ICU patients. Am J Resp Crit Care Med, 2008; 177: 27-34ICU曲霉病患者診斷的有效工具BAL GM閾值0.5敏感度 88%特異度 87%血GM閾值0.5敏感度 42%特異度 78%110例ICU患者納入

17、分析，其中中性粒細(xì)胞減少患者僅占22%38合適的判定折點(diǎn)：1.0, 0.8,0.5?在兒童的應(yīng)用價(jià)值？食物中的GM可以被吸收，假陽性？哌拉西林/他唑巴坦治療，假陽性？非血液病患者應(yīng)用不多抗真菌治療對(duì)結(jié)果的影響？半乳甘露聚糖(GM)檢測(cè)存在的問題39酵母菌、絲狀真菌細(xì)胞壁成分不僅檢測(cè)曲霉菌，還可以檢測(cè)念珠菌、鐮刀菌、毛孢子菌、支頂孢屬不能檢測(cè)：隱球菌和接合菌美國FDA已批準(zhǔn)，歐洲部分國家已注冊(cè)敏感性、特異性：90左右D葡聚糖（G試驗(yàn)）的價(jià)值40美國大多數(shù)研究限于念珠菌菌血癥其他真菌感染（侵襲性曲霉菌?。┑难芯抠Y料少假陽性：血液透析；接受血制品治療（免疫球蛋白）抗生素對(duì)結(jié)果的影響？D葡聚糖（G試驗(yàn)

18、）的價(jià)值411. Senn et al. 1,3-Beta-D-glucan antigenemia for early diagnosis of IFIs in neutropenic patients with acute leukemia. Clinical Infectious Diseases 2008; 46:878852. Ostrosky-Zeichner et al. Multicenter clinical evaluation of the (1-3) beta-D-glucan assay as an aid to diagnosis of FIs. Clinical

19、Infectious Diseases 2005; 41:6549O Marchetti. New Developments and Challenges in Diagnostics of Invasive Fungal Infections. 4th Trends in Medical Mycology.Ostrosky-Zeichner等2, 6中心Fungitell試劑盒(一次 60ug/ml)Senn等1, 單中心WAKO試劑盒(兩次連續(xù)7pg/ml)真菌病類型主要為念珠菌病(確診+臨床診斷)非粒缺患者n = 107念珠菌病+曲霉病(確診+臨床)粒缺患者 n = 30敏感度89%63

20、%特異度80%96%陽性預(yù)測(cè)值 87%79%陰性預(yù)測(cè)值81%91%1,3-D葡聚糖檢測(cè)診斷侵襲性真菌感染(G試驗(yàn))42Ostrosky-Zeichner et al. Multicenter clinical evaluation of the (1-3) beta-D-glucan assay as an aid to diagnosis of IFIs.Clinical Infectious Diseases 2005; 41:65491,3-D葡聚糖檢測(cè)診斷侵襲性真菌感染(G試驗(yàn))全部念珠菌n=92白念n=36近平滑n=18熱帶n=11光滑n=26克柔n=3敏感度%82.683.372.

21、290.980.8100.0G試驗(yàn)檢測(cè)不同念珠菌屬的敏感度近似（60pg/ml,近平滑念珠菌稍低）G試驗(yàn)檢測(cè)不同念珠菌屬的敏感度（60pg/ml）念珠菌n=92曲霉菌n=10隱球菌n=12鐮刀菌n=3接合菌n=3敏感度%82.680.025.0100.0043兩種試驗(yàn)敏感性、特異性相當(dāng)都可以在早期診斷侵襲性曲霉病，但是D葡聚糖可能出現(xiàn)更早兩者結(jié)合，可以互補(bǔ)彌補(bǔ)GM假陰性可能同樣在粒細(xì)胞缺乏患者用的多，其他患者有待研究半乳甘露聚糖(GM)及D葡聚糖（G試驗(yàn)）比較44PCRPCR技術(shù)用于診斷種特異-PCR非特異 PCR雜交Standart singlenestedPCR-EIAReal-time標(biāo)本全血血漿血清BAL最低檢測(cè)范圍4-10 cfu/ml25-100 fg DNA原位雜交目的基因多拷貝基因45PCR過篩試驗(yàn)診斷IA每周監(jiān)測(cè)2次通用引物;確定采用