無(wú)菌檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

1、 無(wú)菌檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程持有部門(mén)：感染管理科 制定部門(mén)：中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)院感染管理科執(zhí)行時(shí)間： 一、目的 無(wú)菌檢驗(yàn)是指檢查經(jīng)滅菌方法處理后的醫(yī)療器械(具)、植入物品、敷料等是否達(dá)到無(wú)菌標(biāo)準(zhǔn)的一種方法。臨床部門(mén)不應(yīng)常規(guī)進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)，如有需要，可聯(lián)系當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制中心派專(zhuān)人來(lái)采樣檢測(cè)。 二、試驗(yàn)前準(zhǔn)備 1無(wú)菌檢驗(yàn)應(yīng)在潔凈度為100級(jí)以上的潔凈實(shí)驗(yàn)室內(nèi)實(shí)施，并證實(shí)該實(shí)驗(yàn)室各項(xiàng)指標(biāo)符合GB 500732001潔凈廠房設(shè)計(jì)規(guī)范、GBT 16292162941996醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測(cè)試方法等相關(guān)要求，且在有效期范圍之內(nèi)。 2按衛(wèi)生部消毒技術(shù)規(guī)范(2002年版)制備無(wú)菌檢驗(yàn)用洗脫液、

2、需氧一厭氧培養(yǎng)基與真菌培養(yǎng)基(見(jiàn)附)。 3在無(wú)菌檢驗(yàn)前三日，分別在需氧一厭氧培養(yǎng)基與真菌培養(yǎng)基內(nèi)各接種1 ml洗脫液，分別置3035與2025：培養(yǎng)72 h，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。 4陽(yáng)性對(duì)照管菌液制備： (1)在檢驗(yàn)前一天取金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003的普通瓊脂斜面新鮮培養(yǎng)物，接種一環(huán)至需氧一厭氧培養(yǎng)基內(nèi)，在3035培養(yǎng)1618 h后，用09無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋至10100 cfuml(可通過(guò)比濁法或稀釋后用1 m1接種平板來(lái)確認(rèn))。 (2)取生孢梭菌CMCC(B)64941的需氧菌、厭氧菌培養(yǎng)基新鮮培養(yǎng)物一接種環(huán)種于相同培養(yǎng)基內(nèi)，于3035培養(yǎng)1824h后，用0.85無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋至10

3、100cfuml。 (3)取白念珠菌CMCC(F)98001真菌瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物一接種環(huán)種于相同培養(yǎng)基內(nèi)，于2025培養(yǎng)24 h后，用085無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋至10100 cfuml。 三、樣本制備 根據(jù)檢樣的類(lèi)型與大小，以及帶孔(腔)與否，可以按照以下不同的方法進(jìn)行制備。 1敷料類(lèi)等非管道類(lèi)樣品：取2個(gè)包裝內(nèi)的樣本，剪成約10 mm30 mm大小的樣片21片，接種需氧一厭氧菌培養(yǎng)管5管與真菌培養(yǎng)管2管。每培養(yǎng)管含培養(yǎng)基40 m1，各接種3片樣片。 2注射針、針灸針、縫合針、棉簽等小樣本：可直接接種需氧一厭氧菌培養(yǎng)管5管與真菌培養(yǎng)管2管。每管含培養(yǎng)基15 ml。 3對(duì)不能用破壞性方法取

4、樣的特殊醫(yī)療用品可用浸有洗脫液的無(wú)菌棉拭子涂抹采樣，被采表面100 cm。時(shí)采樣全部表面，被采表面100 cm。時(shí)采樣面積為100 cm。 4輸液(血)器等導(dǎo)管類(lèi)樣本：選7支樣本，以無(wú)菌注射器吸取5.O10.O ml無(wú)菌洗脫液注入管內(nèi)往返搖蕩5次。將樣本洗脫液分別接種需氧一厭氧菌培養(yǎng)管5管與真菌培養(yǎng)管2管。培養(yǎng)管含培養(yǎng)基15 ml，每管接種樣本洗脫液1.0 ml。5注射器樣本：選7支樣本，吸取洗脫液2.O10.0 ml，將芯桿抽取至全程刻度，振搖5次。將各管洗脫液分別接種需氧一厭氧菌培養(yǎng)管5管與真菌培養(yǎng)管2管。其中洗脫液接種量分別為：1 ml注射器0.5 ml；2 ml注射器1.0 m1；51

5、0 m1注射器2.0 ml；2050 ml注射器5.0 m1。培養(yǎng)基含量按以下標(biāo)準(zhǔn)選擇：洗脫液接種量在2 m1以下者，每管為15 ml；接種量在5 ml者，每管為40 ml。 6其他樣本：不能用上述方法處理的，可用浸有洗脫液的無(wú)菌棉拭子涂抹法采樣。每個(gè)樣本涂采面積不得少于25c。采樣后將棉簽直接剪人培養(yǎng)管中。每次檢測(cè)7個(gè)樣本，分別接種需氧一厭氧菌培養(yǎng)管5管與真菌培養(yǎng)管2管，每支培養(yǎng)管含培養(yǎng)基15 m1。 四、樣本培養(yǎng) 在不同樣本制備過(guò)程中，都必須在其中一支加有樣本的需氧一厭氧菌培養(yǎng)管中接種預(yù)先準(zhǔn)備的1：1 000稀釋的金黃色葡萄球菌1 ml，以作為陽(yáng)性對(duì)照管。將含有檢樣的需氧一厭氧培養(yǎng)管以及陽(yáng)

6、性與陰性對(duì)照管均于3035培養(yǎng)5日；含有檢樣的真菌培養(yǎng)管與陰性對(duì)照管于2025培養(yǎng)7日。培養(yǎng)期間逐日檢查是否有菌生長(zhǎng)，如加入檢樣的培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁或沉淀，經(jīng)培養(yǎng)后不能從外觀上判斷時(shí)，可取培養(yǎng)液轉(zhuǎn)種人另一支相同的培養(yǎng)基中或斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)4872 h后，觀察是否再現(xiàn)渾濁或在斜面上有無(wú)菌落生長(zhǎng)，并在轉(zhuǎn)種的同時(shí)，取培養(yǎng)液少量，涂片染色，用顯微鏡觀察是否有菌生長(zhǎng)。 五、結(jié)果判定 陽(yáng)性對(duì)照在24 h內(nèi)應(yīng)有菌生長(zhǎng)，陰性對(duì)照在培養(yǎng)期間應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)，如需氧一厭氧菌及真菌培養(yǎng)管內(nèi)均為澄清或雖顯渾濁但經(jīng)證明無(wú)菌生長(zhǎng)(接種管內(nèi)液體到相應(yīng)的培養(yǎng)皿，以證實(shí)是否有菌生長(zhǎng)，培養(yǎng)時(shí)間不得少于48 h)，判為滅菌合格；如在7支需

7、一厭氧菌及真菌培養(yǎng)管中，任何1支顯示出渾濁現(xiàn)象，并證實(shí)有菌生長(zhǎng)，應(yīng)重新取樣，分別用同樣方法復(fù)試2次。除陽(yáng)性對(duì)照外，其他各管均不得有菌生長(zhǎng)，否則判為滅菌不合格。 無(wú)菌試驗(yàn)結(jié)果為合格，應(yīng)報(bào)告：未檢出需氧一厭氧菌及真菌；不合格報(bào)告，則報(bào)告為：檢出需氧一厭氧菌或(及)真菌。 六、注意事項(xiàng) 1提倡“四手操作”，嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作。凡有塑料、紙塑、紙袋等包裝的物品，打開(kāi)前應(yīng)采用75乙醇棉球在開(kāi)口處擦拭3遍(每一次更換1個(gè)乙醇棉球)。操作中所使用的血管鉗、鑷子等應(yīng)先浸蘸乙醇溶液，再過(guò)酒精燈消毒，反復(fù)消毒3次后方可使用；當(dāng)操作不同物品時(shí)應(yīng)重復(fù)上述消毒方法。 2實(shí)驗(yàn)前操作者應(yīng)嚴(yán)格手衛(wèi)生，必要時(shí)應(yīng)佩戴無(wú)菌乳膠手套。

8、操作者應(yīng)穿戴滅菌帽子、口罩與隔離衣。在整個(gè)操作過(guò)程中，操作者的肢體動(dòng)作幅度不應(yīng)過(guò)大；被檢物品一旦與污染物品表面接觸，應(yīng)立即終止操作，該件樣本制備作廢，重選另一件未被污染的物品進(jìn)行采樣。 3在實(shí)施樣本制備前，應(yīng)先取需氧一厭氧菌及真菌培養(yǎng)管各1支，打開(kāi)培養(yǎng)管的蓋子(塞子)，置高效過(guò)濾器下方的臺(tái)面，直接暴露于空氣中直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，旋上蓋子(塞回塞子)后，作為陰性對(duì)照與樣本一起培養(yǎng)。4若滅菌因子為化學(xué)滅菌劑，采樣液中應(yīng)加入相應(yīng)的中和劑。 附 無(wú)菌檢驗(yàn)用試劑與培養(yǎng)基配方 1無(wú)菌檢驗(yàn)用洗脫液： 吐溫-80 1 g 蛋白胨 10 g 氯化鈉 8.5 g 蒸餾水 1000 ml 將各成分加入到1000 ml 0

9、.03molL PBS液中，加熱溶解后用NaOH或鹽酸調(diào)pH至7274，于121壓力蒸汽滅菌20 min備用。 2需氧一厭氧菌瓊脂培養(yǎng)基： 酪胨(胰酶水解) 15 g 牛肉膏 3 g 葡萄糖 5 g 氯化鈉 25 g L一胱氨酸 05 g 硫乙醇酸鈉 05 g 酵母浸出粉 5 g 新鮮配制的01刃天青溶液(或新 10 ml(05 m1) 配制的02亞甲藍(lán)溶液) 瓊脂 050. 7 g 蒸餾水 1 000 ml 除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分加入蒸餾水中，微溫溶解后，調(diào)pH至弱堿性，煮沸、濾清，加入葡萄糖和刃天青溶液，搖勻，用NaOH或鹽酸調(diào)pH至6973，分裝，于115：壓力蒸汽滅菌：30 min。 3無(wú)菌檢驗(yàn)用真菌培養(yǎng)基： 磷酸二氫鉀(KH2PO4)