課件《禽病學(xué)》授課用禽病學(xué)實驗指導(dǎo)

課件《禽病學(xué)》授課用_禽病學(xué)實驗指導(dǎo)1課件《禽病學(xué)》授課用_禽病學(xué)實驗指導(dǎo)2實驗一新城疫血凝與血凝抑制試驗?zāi)康囊饬x：掌握血凝試驗（HA）與血凝抑制試驗（HAI）的基本方法；體會HA與HAI在新城疫病毒及其它病毒診斷和鑒定中的應(yīng)用?；驹恚?/p>

許多病毒表面具血凝素，具有凝集某些動物或人紅細胞的特性，稱為血凝現(xiàn)象，可用于鑒定病毒。血凝現(xiàn)象可以被特異性抗體所抑制，稱為血凝抑制現(xiàn)象，利用這種特性可進行血清學(xué)試驗，稱為血凝抑制試驗。實驗一新城疫血凝與血凝抑制試驗?zāi)康囊饬x：3器材及試劑:待檢病毒:雞新城疫病毒雞胚尿囊液；待檢血清：抗雞新城疫病病毒陽性血清；生理鹽水、1%雞紅細胞、96孔V形微量血凝板、加樣器等。器材及試劑:4（一）血凝試驗（HA）：取96孔板，按以下步驟操作：1、第一排1-12孔各加生理鹽水50ul，第二排1-12孔加生理鹽水50ul為紅細胞對照；2、吸50ul病毒液于第一排第1孔，混勻后取50ul至第2孔，依次稀釋至第12孔，棄去50ul，各孔經(jīng)倍比稀釋后稀釋度依次為2-1~2-12。實驗步驟（一）血凝試驗（HA）：取96孔板，按以下步實驗步驟53、第一排1-12孔及第二排1-12孔各加1%雞紅細胞50ul，微型震蕩器震蕩2min混勻。4、室溫靜置10-30分，觀察結(jié)果。5、結(jié)果判定：紅細胞對照組紅細胞完全沉降，以試驗排中能使等量紅細胞發(fā)生完全凝集的病毒最高稀釋倍數(shù)，作為病毒的血凝價，即HI效價，用2n表示。3、第一排1-12孔及第二排1-12孔各加1%雞紅細6血凝試驗流程圖血凝試驗流程圖7（二）血凝抑制試驗（HAI）：取一96孔板，按以下步驟操作：1、4個單位抗原的制備：按HA試驗測出的病毒血凝價除以4即為4個單位血凝素的稀釋度。2、待檢血清的稀釋：第一、二、三排1-12孔各加生理鹽水50ul，于第一排第1孔中加入50ul待檢血清，反復(fù)吹吸3-5次混勻后，取50ul至第2孔混勻，吸取50ul至第3孔……，依次稀釋至第12孔，棄去50ul，經(jīng)倍比稀釋，血清的稀釋倍數(shù)為21~212。（二）血凝抑制試驗（HAI）：取一96孔板，按以下步驟操作：83、第一、二排1-12孔各加4個單位血凝素50ul，微量震蕩器震蕩2min混勻；4、室溫靜置20min；5、第一、二、三排1-12孔各加1%雞紅細胞50ul，微量震蕩器震蕩2min混勻混勻。6、室溫靜置10-30分，觀察結(jié)果；3、第一、二排1-12孔各加4個單位血凝素50ul，微量震蕩97、結(jié)果判定：第二排為抗原對照，紅細胞應(yīng)全部凝集，第三排為紅細胞對照，紅細胞應(yīng)全部沉降。以待檢血清能完全抑制病毒凝集紅細胞的最高稀釋倍數(shù)為血清的HAI效價，用2n表示。7、結(jié)果判定：第二排為抗原對照，紅細胞應(yīng)全部凝集，第三排為紅10血凝抑制試驗流程血凝抑制試驗流程11實驗二病毒的雞胚培養(yǎng)目的意義：

了解禽源病毒雞胚培養(yǎng)的意義及用途掌握病毒雞胚培養(yǎng)的基本方法基本原理：

雞胚培養(yǎng)是培養(yǎng)某些病毒常用方法,此方法可用于某些病毒的分離、增殖、毒力滴定、中和試驗及生產(chǎn)疫苗等。病毒接種雞胚的途徑有多種，主要有卵黃囊接種、絨毛尿囊腔接種、絨毛尿囊膜接種、羊膜腔接種途徑等，應(yīng)根據(jù)需要選擇適當?shù)耐緩健嶒灦《镜碾u胚培養(yǎng)目的意義：12卵黃囊胚體羊膜囊絨毛尿囊腔氣室雞胚結(jié)構(gòu)模式圖卵黃囊胚體羊膜囊絨毛尿囊腔氣室雞胚結(jié)構(gòu)模式圖13器材及試劑:病毒：雞新城疫病毒弱毒疫苗；雞胚：9-11日齡白殼受精卵；孵卵箱、檢卵燈、鋼針、注射器、2.5%碘酒、75%乙醇、固體石蠟、眼科剪、眼科鑷等。器材及試劑:14實驗步驟:1.準備雞胚：接種前用檢卵燈觀察是否為受精卵及其活力。2接種（絨毛尿囊腔途經(jīng)）：（1）在檢卵燈下，用鉛筆勾出氣室及胚胎的位置，并在尿囊膜血管較少的地方作記號。（2）消毒：用碘酒消毒氣室蛋殼，酒精脫碘，用滅菌鋼針在記號處打一孔。實驗步驟:15（3）接種病毒：用18mm針頭的1ml注射器吸取雞新城疫病毒，針頭通過打出的孔進針，刺入尿囊腔，注入0.1ml。（4）用融化的石蠟封閉小孔，39℃孵化器中孵化72h。（3）接種病毒：用18mm針頭的1ml注射器吸163收獲：接種后每4小時照蛋一次，棄去24h內(nèi)死亡胚。（1）雞胚放入普通冰箱內(nèi)冷藏12h，使胎血凝固。（2）分別用碘酒和酒精消毒卵殼，用滅菌剪刀除去氣室卵殼及殼膜，撕開下面的尿囊膜。（3）將雞胚稍傾向一側(cè)，用滅菌吸管吸出尿囊液待檢。（4）觀察雞胚的發(fā)育及是否有無病變。3收獲：17實驗三雞白痢平板凝集試驗?zāi)康囊饬x：

了解平板凝集試驗在雞白痢診斷及監(jiān)測中的應(yīng)用學(xué)習雞白痢平板凝集試驗的操作方法?；驹恚?/p>

細菌等顆粒性抗原與特異性抗體結(jié)合后，在有電解質(zhì)的情況下，會出現(xiàn)肉眼可見的凝集塊，稱為凝集反應(yīng)。直接凝集反應(yīng)可分為玻片凝集與試管凝集。凝集試驗是疾病診斷及體內(nèi)抗體水平測定的常用方法。實驗三雞白痢平板凝集試驗?zāi)康囊饬x：18課件《禽病學(xué)》授課用_禽病學(xué)實驗指導(dǎo)19器材及試劑:抗原和血清：雞白痢凝集抗原、雞白痢標準陽性血清、陰血清、待檢血清生理鹽水、玻片、加液槍（20-200ul）、接種環(huán)等。實驗步驟:1.取一潔凈玻片，用蠟筆劃成方可格，編號2.各方格分別加被檢血清0.08、0.04、0.02、0.01ml。3.將凝集抗原搖勻，重直滴一滴于各格血清上。4.用火柴棒混勻，攤開直徑1cm左右。器材及試劑:205.靜置3-4分，再拿起玻板輕輕轉(zhuǎn)動，按下列標準記反應(yīng)結(jié)果：++++：出現(xiàn)大片凝集，液體完全透明，即100%凝集+++：有明顯凝集片和顆粒，液體幾乎完全透明，即75%凝集++：有可見的凝集片和顆粒，液體不甚透明，即50%凝集+：僅僅可以看見顆粒，液體混濁，即25%凝集-：液體均勻混濁，無凝集現(xiàn)象（同時應(yīng)設(shè)陽性、陰性血清及抗原對照）6.結(jié)果判定：5.靜置3-4分，再拿起玻板輕輕轉(zhuǎn)動，按下列標準記反應(yīng)結(jié)21實驗四雞傳染性法氏囊病瓊脂擴散試驗

目的意義：

掌握瓊脂免疫擴散試驗的操作技術(shù)體會其在雞傳染性法氏囊病診斷及監(jiān)測中的意義基本原理：

雞傳染性法氏囊病病毒抗原與相應(yīng)抗體在適當電解質(zhì)存在下結(jié)合，在半固體瓊脂中擴散,經(jīng)過一定時間形成肉眼可見的沉淀物，據(jù)此判斷是否存在相應(yīng)的抗原或抗體，作為診斷雞傳染性法氏囊病的依據(jù)之一。實驗四雞傳染性法氏囊病瓊脂擴散試驗?zāi)康囊饬x：22器材及試劑:生理鹽水、瓊脂糖、硫柳汞、平皿、打孔器、移液器、吸頭等。實驗步驟:1、制板:加融化的1%瓊脂于潔凈玻片或培養(yǎng)皿內(nèi)，厚2.5-3.0mm。2、打孔：待瓊脂凝固后打孔，多為梅花形，一般孔徑3-4mm，孔距4-5mm。3、加樣：于中央孔加入標準沉淀抗原，周圍1、4孔內(nèi)加陽性血清對照，2、3、5、6孔為待檢血清。器材及試劑:234、加樣完后，將瓊脂板置于濕盒中，37℃擴散24-48h。5、結(jié)果判定：若待檢血清與抗原孔之間出現(xiàn)白色沉淀線，則表示陽性，若不出現(xiàn)沉淀線，為陰性。若用于檢測血清效價，則以出現(xiàn)沉淀線的血清最高稀釋倍數(shù)表示（2n）。用于兩種抗原比較時，沉淀線有多種情形，應(yīng)具體分析。4、加樣完后，將瓊脂板置于濕盒中，37℃擴散24-48h。24課件《禽病學(xué)》授課用_禽病學(xué)實驗指導(dǎo)25制板打孔封底加樣置濕盒中擴散瓊脂擴散試驗流程圖制板打孔封底加樣置濕盒中擴散瓊脂擴散試驗流程圖26實驗五禽霍亂的診斷目的意義：

認識禽霍亂病原巴氏桿菌兩極染色的特性熟悉禽霍亂的診斷方法和步驟認識病原菌分離鑒定在禽病診斷中的作用基本原理：

禽巴氏桿菌病又稱為禽霍亂，主要表現(xiàn)為敗血癥，即實質(zhì)器官的出血、腫大與壞死。巴氏桿菌在病禽組織內(nèi)呈典型的兩極著色，純培養(yǎng)物呈卵圓形或短桿狀；在血或血清瓊脂上生長良好，呈露珠樣小菌落并有不同顏色的熒光；能發(fā)酵多種糖；多殺性巴氏桿菌能致死小白鼠、家兔等。故常依據(jù)形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、生化特性和動物實驗等來鑒定。實驗五禽霍亂的診斷目的意義：27器材及試劑:病料：患病鴨組織（肝、脾、肺）或體液（血、胸腹腔滲出液）；培養(yǎng)基：5-10%兔血瓊脂平板；動物：小白鼠或成年健康家兔；無菌生理鹽水、吸管、注射器、針頭、酒精燈等。器材及試劑:28實驗步驟:（一）形態(tài)學(xué)檢查：病料或心血涂片，瑞氏染色。（二）培養(yǎng)特性檢查：將病料接種于血瓊脂平板37℃培養(yǎng)24h。（三）生化鑒定：實驗步驟:29

鴨霍亂心血涂片中的多殺性巴氏桿菌鴨霍亂心血涂片中的多殺性巴氏桿菌30（四）動物回歸實驗：將病料剪碎并研磨，用滅菌生理鹽水制成1:10懸液，也可將血瓊脂平板培養(yǎng)物制成懸液，皮下注射小白鼠，0.1-0.3ml/只。注意觀察小鼠的表現(xiàn)，待發(fā)病死亡后，即行解剖，觀察小鼠病變，用肝、脾觸片或心血涂片，瑞氏染色鏡檢，應(yīng)有兩極濃染的球桿菌。同時上述病料接種血瓊脂平板，次日觀察細菌生長情況和菌落特征。（四）動物回歸實驗：將病料剪碎并研磨，用滅菌生理鹽水制成1:31臨床癥狀病理變化觸片染色鏡檢培養(yǎng)特性生化特性血清學(xué)試驗初步診斷動物回歸試驗確診流行病學(xué)調(diào)查臨床癥狀病理變化觸片染色鏡檢培養(yǎng)特性生化特性血清學(xué)試驗初步診32課件《禽病學(xué)》授課用_禽病學(xué)實驗指導(dǎo)33課件《禽病學(xué)》授課用_禽病學(xué)實驗指導(dǎo)34實驗一新城疫血凝與血凝抑制試驗?zāi)康囊饬x：掌握血凝試驗（HA）與血凝抑制試驗（HAI）的基本方法；體會HA與HAI在新城疫病毒及其它病毒診斷和鑒定中的應(yīng)用?；驹恚?/p>

許多病毒表面具血凝素，具有凝集某些動物或人紅細胞的特性，稱為血凝現(xiàn)象，可用于鑒定病毒。血凝現(xiàn)象可以被特異性抗體所抑制，稱為血凝抑制現(xiàn)象，利用這種特性可進行血清學(xué)試驗，稱為血凝抑制試驗。實驗一新城疫血凝與血凝抑制試驗?zāi)康囊饬x：35器材及試劑:待檢病毒:雞新城疫病毒雞胚尿囊液；待檢血清：抗雞新城疫病病毒陽性血清；生理鹽水、1%雞紅細胞、96孔V形微量血凝板、加樣器等。器材及試劑:36（一）血凝試驗（HA）：取96孔板，按以下步驟操作：1、第一排1-12孔各加生理鹽水50ul，第二排1-12孔加生理鹽水50ul為紅細胞對照；2、吸50ul病毒液于第一排第1孔，混勻后取50ul至第2孔，依次稀釋至第12孔，棄去50ul，各孔經(jīng)倍比稀釋后稀釋度依次為2-1~2-12。實驗步驟（一）血凝試驗（HA）：取96孔板，按以下步實驗步驟373、第一排1-12孔及第二排1-12孔各加1%雞紅細胞50ul，微型震蕩器震蕩2min混勻。4、室溫靜置10-30分，觀察結(jié)果。5、結(jié)果判定：紅細胞對照組紅細胞完全沉降，以試驗排中能使等量紅細胞發(fā)生完全凝集的病毒最高稀釋倍數(shù)，作為病毒的血凝價，即HI效價，用2n表示。3、第一排1-12孔及第二排1-12孔各加1%雞紅細38血凝試驗流程圖血凝試驗流程圖39（二）血凝抑制試驗（HAI）：取一96孔板，按以下步驟操作：1、4個單位抗原的制備：按HA試驗測出的病毒血凝價除以4即為4個單位血凝素的稀釋度。2、待檢血清的稀釋：第一、二、三排1-12孔各加生理鹽水50ul，于第一排第1孔中加入50ul待檢血清，反復(fù)吹吸3-5次混勻后，取50ul至第2孔混勻，吸取50ul至第3孔……，依次稀釋至第12孔，棄去50ul，經(jīng)倍比稀釋，血清的稀釋倍數(shù)為21~212。（二）血凝抑制試驗（HAI）：取一96孔板，按以下步驟操作：403、第一、二排1-12孔各加4個單位血凝素50ul，微量震蕩器震蕩2min混勻；4、室溫靜置20min；5、第一、二、三排1-12孔各加1%雞紅細胞50ul，微量震蕩器震蕩2min混勻混勻。6、室溫靜置10-30分，觀察結(jié)果；3、第一、二排1-12孔各加4個單位血凝素50ul，微量震蕩417、結(jié)果判定：第二排為抗原對照，紅細胞應(yīng)全部凝集，第三排為紅細胞對照，紅細胞應(yīng)全部沉降。以待檢血清能完全抑制病毒凝集紅細胞的最高稀釋倍數(shù)為血清的HAI效價，用2n表示。7、結(jié)果判定：第二排為抗原對照，紅細胞應(yīng)全部凝集，第三排為紅42血凝抑制試驗流程血凝抑制試驗流程43實驗二病毒的雞胚培養(yǎng)目的意義：

了解禽源病毒雞胚培養(yǎng)的意義及用途掌握病毒雞胚培養(yǎng)的基本方法基本原理：

雞胚培養(yǎng)是培養(yǎng)某些病毒常用方法,此方法可用于某些病毒的分離、增殖、毒力滴定、中和試驗及生產(chǎn)疫苗等。病毒接種雞胚的途徑有多種，主要有卵黃囊接種、絨毛尿囊腔接種、絨毛尿囊膜接種、羊膜腔接種途徑等，應(yīng)根據(jù)需要選擇適當?shù)耐緩健嶒灦《镜碾u胚培養(yǎng)目的意義：44卵黃囊胚體羊膜囊絨毛尿囊腔氣室雞胚結(jié)構(gòu)模式圖卵黃囊胚體羊膜囊絨毛尿囊腔氣室雞胚結(jié)構(gòu)模式圖45器材及試劑:病毒：雞新城疫病毒弱毒疫苗；雞胚：9-11日齡白殼受精卵；孵卵箱、檢卵燈、鋼針、注射器、2.5%碘酒、75%乙醇、固體石蠟、眼科剪、眼科鑷等。器材及試劑:46實驗步驟:1.準備雞胚：接種前用檢卵燈觀察是否為受精卵及其活力。2接種（絨毛尿囊腔途經(jīng)）：（1）在檢卵燈下，用鉛筆勾出氣室及胚胎的位置，并在尿囊膜血管較少的地方作記號。（2）消毒：用碘酒消毒氣室蛋殼，酒精脫碘，用滅菌鋼針在記號處打一孔。實驗步驟:47（3）接種病毒：用18mm針頭的1ml注射器吸取雞新城疫病毒，針頭通過打出的孔進針，刺入尿囊腔，注入0.1ml。（4）用融化的石蠟封閉小孔，39℃孵化器中孵化72h。（3）接種病毒：用18mm針頭的1ml注射器吸483收獲：接種后每4小時照蛋一次，棄去24h內(nèi)死亡胚。（1）雞胚放入普通冰箱內(nèi)冷藏12h，使胎血凝固。（2）分別用碘酒和酒精消毒卵殼，用滅菌剪刀除去氣室卵殼及殼膜，撕開下面的尿囊膜。（3）將雞胚稍傾向一側(cè)，用滅菌吸管吸出尿囊液待檢。（4）觀察雞胚的發(fā)育及是否有無病變。3收獲：49實驗三雞白痢平板凝集試驗?zāi)康囊饬x：

了解平板凝集試驗在雞白痢診斷及監(jiān)測中的應(yīng)用學(xué)習雞白痢平板凝集試驗的操作方法?；驹恚?/p>

細菌等顆粒性抗原與特異性抗體結(jié)合后，在有電解質(zhì)的情況下，會出現(xiàn)肉眼可見的凝集塊，稱為凝集反應(yīng)。直接凝集反應(yīng)可分為玻片凝集與試管凝集。凝集試驗是疾病診斷及體內(nèi)抗體水平測定的常用方法。實驗三雞白痢平板凝集試驗?zāi)康囊饬x：50課件《禽病學(xué)》授課用_禽病學(xué)實驗指導(dǎo)51器材及試劑:抗原和血清：雞白痢凝集抗原、雞白痢標準陽性血清、陰血清、待檢血清生理鹽水、玻片、加液槍（20-200ul）、接種環(huán)等。實驗步驟:1.取一潔凈玻片，用蠟筆劃成方可格，編號2.各方格分別加被檢血清0.08、0.04、0.02、0.01ml。3.將凝集抗原搖勻，重直滴一滴于各格血清上。4.用火柴棒混勻，攤開直徑1cm左右。器材及試劑:525.靜置3-4分，再拿起玻板輕輕轉(zhuǎn)動，按下列標準記反應(yīng)結(jié)果：++++：出現(xiàn)大片凝集，液體完全透明，即100%凝集+++：有明顯凝集片和顆粒，液體幾乎完全透明，即75%凝集++：有可見的凝集片和顆粒，液體不甚透明，即50%凝集+：僅僅可以看見顆粒，液體混濁，即25%凝集-：液體均勻混濁，無凝集現(xiàn)象（同時應(yīng)設(shè)陽性、陰性血清及抗原對照）6.結(jié)果判定：5.靜置3-4分，再拿起玻板輕輕轉(zhuǎn)動，按下列標準記反應(yīng)結(jié)53實驗四雞傳染性法氏囊病瓊脂擴散試驗

目的意義：

掌握瓊脂免疫擴散試驗的操作技術(shù)體會其在雞傳染性法氏囊病診斷及監(jiān)測中的意義基本原理：

雞傳染性法氏囊病病毒抗原與相應(yīng)抗體在適當電解質(zhì)存在下結(jié)合，在半固體瓊脂中擴散,經(jīng)過一定時間形成肉眼可見的沉淀物，據(jù)此判斷是否存在相應(yīng)的抗原或抗體，作為診斷雞傳染性法氏囊病的依據(jù)之一。實驗四雞傳染性法氏囊病瓊脂擴散試驗?zāi)康囊饬x：54器材及試劑:生理鹽水、瓊脂糖、硫柳汞、平皿、打孔器、移液器、吸頭等。實驗步驟:1、制板:加融化的1%瓊脂于潔凈玻片或培養(yǎng)皿內(nèi)，厚2.5-3.0mm。2、打孔：待瓊脂凝固后打孔，多為梅花形，一般孔徑3-4mm，孔距4-5mm。3、加樣：于中央孔加入標準沉淀抗原，周圍1、4孔內(nèi)加陽性血清對照，2、3、5、6孔為待檢血清。器材及試劑:554、加樣完后，將瓊脂板置于濕盒中，37℃擴散24-48h。5、結(jié)果判定：若待檢血清與抗原孔之間出現(xiàn)白色沉淀線，則表示陽性，若不出現(xiàn)沉淀線，為陰性。若用于檢測血清效價，則以出現(xiàn)沉淀線的血清最高稀釋倍數(shù)表示（2n）。用于兩種抗原比較時，沉淀線有多種情形，應(yīng)具體分析。4、加樣完后，將瓊脂板置于濕盒中，37℃擴散24-48h。56課件《禽病學(xué)》授課用_禽病學(xué)實驗指導(dǎo)57制板打孔封底加樣置濕盒中擴散瓊脂擴散試驗流