低氧促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞中Lin28A mRNA表達(dá)的體外實(shí)驗(yàn)研究

低氧促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞中Lin28AmRNA表達(dá)的體外實(shí)驗(yàn)研究〔〕:

摘要：目的研究體外低氧條件下結(jié)腸癌細(xì)胞中Lin28AmRNA表達(dá)增高的情況。方法2022年6月至2022年12月我院展開(kāi)的三項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究的資料進(jìn)展回憶性分析，從而驗(yàn)證"低氧誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞中Lin28A表達(dá)增加";的假說(shuō)。結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞隨著腫瘤的生長(zhǎng)逐漸處于低氧狀態(tài)，Lin28A會(huì)因?yàn)槟[瘤細(xì)胞被誘導(dǎo)，表達(dá)出轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA表達(dá)。結(jié)論低氧誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞中Lin28A表達(dá)增加。

關(guān)鍵詞：結(jié)腸癌細(xì)胞；低氧狀態(tài)；Lin28AmRNA表達(dá)；體外實(shí)驗(yàn)；基因轉(zhuǎn)錄

本文引用格式：李永立,劉鵬,苗晶,等.低氧促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞中Lin28AmRNA表達(dá)的體外實(shí)驗(yàn)研究[J].世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘,2022,19(77):31,33.

0引言

結(jié)腸癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，美國(guó)的結(jié)腸癌新發(fā)及死亡病例均居第三位【1】。我國(guó)結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率近年來(lái)呈上升趨勢(shì)，發(fā)病率高、治愈率低是目前我國(guó)結(jié)腸癌的主要特征【2】。因此，提醒結(jié)腸癌演進(jìn)的機(jī)制，對(duì)于探究新的、有效的結(jié)腸癌防治策略意義重大。至此筆者在展開(kāi)一系列研究后，獲得一定結(jié)論，詳細(xì)整理報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

2022年6月至2022年12月我院展開(kāi)的三項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究的資料進(jìn)展回憶性分析，從而驗(yàn)證"低氧誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞中Lin28A表達(dá)增加";的假說(shuō)，說(shuō)明低氧誘導(dǎo)Lin28A表達(dá)的分子機(jī)制。

1.2方法

本次驗(yàn)證假說(shuō)的詳細(xì)體外實(shí)驗(yàn)研究?jī)?nèi)容如下。

1.2.1研究低氧對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞中Lin28AmRNA表達(dá)的體外實(shí)驗(yàn)

體外實(shí)驗(yàn)：以HCT116、SW620、DLD1和SW1116四個(gè)結(jié)腸癌細(xì)胞系為研究對(duì)象，分別用常氧〔37℃，5%CO2及飽和濕度〕、1%模擬低氧〔37℃，1%O2，5%CO2，94%N2及飽和濕度〕和去鐵胺〔DFO〕誘導(dǎo)低氧的方法〔在細(xì)胞培養(yǎng)基中參加終濃度為130mol/L的DFO【3】。培養(yǎng)這4種細(xì)胞24h后搜集細(xì)胞并提取總RNA和蛋白，然后分別通過(guò)定量PCR和WesternBlot的方法檢測(cè)低氧對(duì)這4個(gè)細(xì)胞系中Lin28A的mRNA和蛋白表達(dá)的影響。

1.2.2研究低氧促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞中Lin28A轉(zhuǎn)錄的詳細(xì)實(shí)驗(yàn)

第一，檢測(cè)低氧條件下HCT116細(xì)胞中Lin28A的初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物〔pre-mRNA〕表達(dá)變化。分別用常氧、1%模擬低氧和DFO誘導(dǎo)低氧的方法培養(yǎng)HCT116細(xì)胞，24h后搜集細(xì)胞并提取總RNA，然后用定量PCR的方法檢測(cè)低氧對(duì)HCT116細(xì)胞中Lin28A的pre-mRNA表達(dá)的影響，以判斷低氧是否促進(jìn)Lin28A的轉(zhuǎn)錄。

第二，鑒定低氧誘導(dǎo)Lin28A的轉(zhuǎn)錄是HIF1alpha;還是HIF2alpha;依賴(lài)的。接種HCT116細(xì)胞至6孔板，用Dharmacon公司的HIF1alpha;、HIF2alpha;以及NegativeControl〔NC〕的siRNA分別轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞，轉(zhuǎn)染12h后，除1組轉(zhuǎn)染了NC的細(xì)胞換成完全培養(yǎng)基外，其余轉(zhuǎn)染組〔HIF1alpha;、HIF2alpha;以及NC各1組〕均換成含有DFO的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，收獲細(xì)胞并提取總RNA，用定量PCR的方法分別檢測(cè)各siRNA轉(zhuǎn)染組中Lin28A的pre-mRNA表達(dá)變化，進(jìn)而判斷低氧誘導(dǎo)Lin28A的轉(zhuǎn)錄是HIF1alpha;還是HIF2alpha;依賴(lài)的【4】。

第三，尋找并定位Lin28A基因啟動(dòng)子上的HIF反響元件。首先以基因組DNA為模板，并用特異引物擴(kuò)增含有不同數(shù)目HRE的Lin28A啟動(dòng)子截短體序列，然后將擴(kuò)增的片段分別插入pGL3-basic熒光報(bào)告質(zhì)粒中。用構(gòu)建的不同報(bào)告質(zhì)粒分別和內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染24孔板中的HCT116細(xì)胞，每轉(zhuǎn)染組6個(gè)孔。轉(zhuǎn)染4h后換液，每轉(zhuǎn)染組中的3個(gè)孔換成完全培養(yǎng)基，另3孔那么換成含有DFO的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h后，用Promega公司的雙熒光報(bào)告基因檢測(cè)試劑測(cè)定熒光報(bào)告基因的活性，最后根據(jù)螢火蟲(chóng)熒光值和海腎熒光值的比值來(lái)判斷報(bào)告基因的表達(dá)程度，從而定位功能性HRE。再用染色質(zhì)免疫共沉淀〔CHIP〕的方法在體內(nèi)驗(yàn)證Lin28A啟動(dòng)子區(qū)有HIF的調(diào)控識(shí)別位點(diǎn)【5】。

1.2.3低氧增強(qiáng)Lin28AmRNA穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)研究

第一，檢測(cè)低氧對(duì)含有Lin28A3"-UTR的報(bào)告基因的mRNA穩(wěn)定性的影響。首先構(gòu)建帶有Lin28A3"-UTR的luciferase嵌合表達(dá)載體。通過(guò)特異引物以cDNA為模板擴(kuò)增Lin28A的3"-UTR，并在此根底上利用定點(diǎn)突變PCR的方法構(gòu)建ARE突變的Lin28A3"-UTR，然后分別插入到pGL3-control載體中l(wèi)uciferase的ORF后面作為報(bào)告質(zhì)粒，將報(bào)告質(zhì)粒和內(nèi)參質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞，用雙熒光報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)低氧對(duì)含有Lin28A3"-UTR的報(bào)告基因的mRNA穩(wěn)定性的影響，同時(shí)判斷是否依賴(lài)Lin28A3"-UTR中的ARE。

第二，鑒定低氧下穩(wěn)定Lin28AmRNA的RNA結(jié)合蛋白。分別收獲常氧及低氧培養(yǎng)的HCT116細(xì)胞并提取總蛋白，然后檢測(cè)低氧下HCT116細(xì)胞中RNA結(jié)合蛋白HuR和TTP的表達(dá)變化及其磷酸化狀態(tài)，以挑選低氧下穩(wěn)定Lin28AmRNA的RNA結(jié)合蛋白。

2結(jié)果

在獲得的結(jié)果上，我們發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞隨著腫瘤的生長(zhǎng)逐漸處于低氧狀態(tài)，Lin28A會(huì)因?yàn)槟[瘤細(xì)胞被誘導(dǎo)，表達(dá)出轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA表達(dá)，另一方面其穩(wěn)定性增加。

3討論

惡性腫瘤在開(kāi)展的過(guò)程中，隨著腫瘤體積的增加，氧氣變得相對(duì)缺乏，因此腫瘤組織通常處于低氧的微環(huán)境。低氧狀態(tài)下腫瘤細(xì)胞主要通過(guò)兩種機(jī)制調(diào)節(jié)基因的表達(dá)而使之適應(yīng)低氧環(huán)境乃至促進(jìn)腫瘤的演進(jìn)【6】。一方面，低氧下，氧敏感的低氧誘導(dǎo)因子1alpha;〔HIF1alpha;〕停頓降解并迅速積累，然后與組成性表達(dá)的HIF1beta;形成異二聚體HIF1，HIF1是轉(zhuǎn)錄因子，可直接與啟動(dòng)子區(qū)的5"-RCGTG-3"〔R是嘌呤A或G〕序列結(jié)合而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄【7】；另一方面，低氧還能通過(guò)調(diào)節(jié)一些RNA結(jié)合蛋白的活性而從轉(zhuǎn)錄后程度調(diào)控mRNA的穩(wěn)定性[8]。

本次研究最大的創(chuàng)新之處在于：目前研究發(fā)現(xiàn)Lin28A在包括結(jié)腸癌在內(nèi)的多種腫瘤中表達(dá)增加，但機(jī)制不清。我們發(fā)現(xiàn)處于低氧微環(huán)境的結(jié)腸癌細(xì)胞中Lin28A的mRNA表達(dá)增加，而且提醒了低氧誘導(dǎo)Lin28A表達(dá)升高的機(jī)制是促進(jìn)Lin28A的轉(zhuǎn)錄以及增加Lin28AmRNA的穩(wěn)定性，因此在低氧微環(huán)境促進(jìn)腫瘤演進(jìn)的理論研究上具有創(chuàng)新性；同時(shí)在結(jié)腸癌演進(jìn)的機(jī)制研究上也具有創(chuàng)新性。

綜上所述，在腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞逐漸處于低氧狀態(tài)，而低氧可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中Lin28A的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA表達(dá)以及穩(wěn)定性增加，不斷積累的Lin28A作為原癌基因促進(jìn)腫瘤的演進(jìn)。

參考文獻(xiàn)

【1】宋虎,徐溢新,許騰.Lin28A過(guò)表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞糖酵解的促進(jìn)作用及其機(jī)制[J].徐州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2022,67(12):773-775.

【2】周培華,趙玉生,鄭新.慢病毒介導(dǎo)5HRE-CEAp調(diào)控RASSF1A表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901抑制的研究[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2022,26(13):23.

【3】李幼梅,張思儀,趙連梅.LIN28A、E-cadherin和vimentin在浸潤(rùn)性乳腺癌中的表達(dá)及其臨床意義[J].癌變.畸變.突變,2022,56(29):308.

【4】周曉黎,廖艷,劉浩.不同氧濃度下結(jié)腸癌細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子-1alpha;表達(dá)及糖酵解的差異[J].臨床外科雜志,2022,56(9):12.

【5】Pinzoacute;n-Daza.OxidativeStressHypoxicConditions[J].JournalofCellularBiochemistry,2022,34(12):23

【6】MaoxiL,KunliD,BoJ.HighExpressionthroughActivatingNF-kappa;Bp65SignalingPathway[J].PathologyOncologyResearch,2022,45(12):34.

【7】李博,鄧睿,李棟.結(jié)腸癌組織中SphK1和FAK