人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(huì)

48/48國際人用藥品注冊(cè)技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)ICH協(xié)調(diào)指導(dǎo)原則生物分析方法驗(yàn)證及樣品分析M10終稿2022年5月24日采納在ICH進(jìn)程第2階段，ICH大會(huì)將相應(yīng)ICH專家工作組已達(dá)成共識(shí)的文本或指導(dǎo)原則草案遞交給ICH區(qū)域監(jiān)管機(jī)構(gòu)，用以按照相應(yīng)國家或地區(qū)的程序-征求內(nèi)部和外部意見。

M10指導(dǎo)原則進(jìn)程編碼進(jìn)程日期M10ICH大會(huì)成員第二階段發(fā)布征求意見稿（2019年1月15日版）2019年2月26日M10ICH大會(huì)監(jiān)管機(jī)構(gòu)成員第四階段采納2022年5月24日法律聲明：本指導(dǎo)原則受版權(quán)保護(hù)，在ICH版權(quán)已得到認(rèn)可的情況下，除ICH標(biāo)識(shí)外，基于公共許可可以使用、復(fù)制、引用、改編、修改、翻譯或傳播，在任何情形下需在文件中承認(rèn)ICH版權(quán)。如需要改編、修改或翻譯，必須進(jìn)行合理的處理，明確注明或以其他方式標(biāo)注對(duì)原文或基于原文進(jìn)行的更改。必須避免任何暗示ICH授權(quán)或支持對(duì)原版文件改編、調(diào)整或翻譯的行為。本文件按現(xiàn)有狀態(tài)提供，不做任何形式的保證。任何情況下，ICH或原版文件作者不會(huì)對(duì)任何由使用本文件造成的索賠、傷害或其他責(zé)任負(fù)責(zé)。上述許可不適用于第三方提供的內(nèi)容。因此，對(duì)版權(quán)歸屬第三方的文件，必須從該版權(quán)持有者處獲得復(fù)制許可。ICH協(xié)調(diào)指導(dǎo)原則生物分析方法驗(yàn)證及樣品分析M10ICH共識(shí)指導(dǎo)原則目錄TOC\o"1-3"\h\u213871.引言 6292971.1目的 6278371.2背景 6128201.3范圍 6229912.一般原則 7322672.1方法開發(fā) 7304642.2方法驗(yàn)證 7295282.2.1完整驗(yàn)證 7164092.2.2部分驗(yàn)證 8281992.2.3交叉驗(yàn)證 8230363.色譜法 8234703.1對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品 9208553.2方法驗(yàn)證 9246193.2.1選擇性 94673.2.2特異性 1065933.2.3基質(zhì)效應(yīng) 10268083.2.4校準(zhǔn)曲線和范圍 11202863.2.5準(zhǔn)確度和精密度 1267513.2.6殘留 1346253.2.7稀釋可靠性 13217563.2.8穩(wěn)定性 1374493.2.9進(jìn)樣重現(xiàn)性 16177333.3研究樣品分析 16119463.3.1分析批 16251983.3.2分析批接受標(biāo)準(zhǔn) 17302653.3.3校正范圍 18288663.3.4研究樣品重分析 19219753.3.5研究樣品重進(jìn)樣 2013373.3.6色譜圖積分 2013114.配體結(jié)合分析 2075484.1主要試劑 2014464.1.1對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品 2033494.1.2關(guān)鍵試劑 20317304.2方法驗(yàn)證 2143644.2.1特異性 2164284.2.2選擇性 2296014.2.3校準(zhǔn)曲線和范圍 22252234.2.4準(zhǔn)確度和精密度 23217644.2.5殘留 24205664.2.6稀釋線性和鉤狀效應(yīng) 24142624.2.7穩(wěn)定性 25165164.3研究樣品分析 26185594.3.1分析批 26275964.3.2分析批接受標(biāo)準(zhǔn) 26104574.3.3校正范圍 27129974.3.4研究樣品重分析 27286685.已測(cè)樣品再分析（ISR） 2832876.部分驗(yàn)證和交叉驗(yàn)證 30185486.1部分驗(yàn)證 30286706.2交叉驗(yàn)證 31305727.相關(guān)考慮 31326257.1待測(cè)物同為內(nèi)源性物質(zhì)的分析方法 318077.1.1待測(cè)物同為內(nèi)源性物質(zhì)分析方法的質(zhì)控樣品 331627.1.2待測(cè)物同為內(nèi)源性物質(zhì)分析方法的選擇性、回收率和基質(zhì)效應(yīng) 3367937.1.3待測(cè)物同為內(nèi)源性物質(zhì)分析方法的平行性 34207967.1.4待測(cè)物同為內(nèi)源性物質(zhì)分析方法的準(zhǔn)確度和精密度 34116757.1.5待測(cè)物同為內(nèi)源性物質(zhì)分析方法的穩(wěn)定性 34117807.2平行性 34264747.3回收率 35229837.4最低需求稀釋度 35316727.5商品化與診斷試劑盒 3539247.6新技術(shù)或備選技術(shù) 3661567.6.1干基質(zhì)方法 37307448.文檔資料 37179978.1摘要信息 37148048.2驗(yàn)證和生物分析報(bào)告的文件 3823659.專業(yè)術(shù)語 43

1.引言1.1目的本指導(dǎo)原則旨在為化學(xué)藥物和生物藥物生物分析方法驗(yàn)證及其在研究樣品分析中的應(yīng)用提供建議，以確保用于支持化學(xué)藥物和生物藥物研發(fā)及注冊(cè)申請(qǐng)中生物分析結(jié)果的質(zhì)量和一致性。生物分析方法驗(yàn)證旨在證明所采用的生物分析方法適用于預(yù)期目的。也可采用本指導(dǎo)原則建議以外的方法進(jìn)行驗(yàn)證，但需要提供適當(dāng)?shù)目茖W(xué)依據(jù)。采用或擬采用不同方法驗(yàn)證時(shí)，建議申請(qǐng)人就驗(yàn)證方法的重大變更咨詢監(jiān)管機(jī)構(gòu)。1.2背景生物基質(zhì)中化學(xué)藥物和生物藥物及其代謝物的濃度測(cè)定是藥物開發(fā)過程中的重要內(nèi)容，研究結(jié)果有助于支持藥物安全性和有效性相關(guān)監(jiān)管決策。因此，所使用的生物分析方法必須經(jīng)過充分表征、適當(dāng)驗(yàn)證和記錄，以確保獲得可靠數(shù)據(jù)以支持監(jiān)管決策。某些情況下，本指南還可促進(jìn)藥物研發(fā)過程中依據(jù)3Rs（減少、優(yōu)化、替代）原則進(jìn)行動(dòng)物研究。1.3范圍本指導(dǎo)原則描述了用于支持監(jiān)管決策的生物樣品（例如血液、血漿、血清、其他體液或組織）分析方法驗(yàn)證及研究樣品分析。本指導(dǎo)原則適用于測(cè)定生物樣品（如全血、血漿、血清、其他體液或組織）中化藥和生物藥及其代謝產(chǎn)物濃度的檢測(cè)方法，上述生物樣品來自于：根據(jù)GLP原則進(jìn)行的非臨床毒代動(dòng)力學(xué)（TK）研究、可替代臨床研究的非臨床藥代動(dòng)力學(xué)（PK）研究以及各期臨床試驗(yàn)，包括向監(jiān)管機(jī)構(gòu)提交的生物利用度比較和生物等效性（BA/BE）研究。對(duì)擬提交注冊(cè)申請(qǐng)的研究中涉及的主要基質(zhì)，應(yīng)進(jìn)行完整的方法驗(yàn)證，必要時(shí)，還應(yīng)對(duì)其他基質(zhì)進(jìn)行部分驗(yàn)證。對(duì)不用于注冊(cè)申請(qǐng)、藥物安全有效性評(píng)估或說明書內(nèi)容的試驗(yàn)（如探索性研究），申請(qǐng)人可根據(jù)其支持內(nèi)部決策的強(qiáng)度水平自行決定分析方法驗(yàn)證的程度。本指導(dǎo)原則適用于配體結(jié)合分析法（LBAs）和色譜分析法[例如通常與質(zhì)譜檢測(cè)器聯(lián)用的液相色譜（LC）或氣相色譜（GC）]的定量分析。對(duì)于必須遵循藥物非臨床試驗(yàn)質(zhì)量管理規(guī)范（GLP）或藥物臨床試驗(yàn)質(zhì)量管理規(guī)范（GCP）的研究，研究樣品的生物分析也應(yīng)符合其相關(guān)要求。本指導(dǎo)原則不適用于生物標(biāo)志物和免疫原性分析方法。2.一般原則2.1方法開發(fā)生物分析方法開發(fā)的目的是確定方法的設(shè)計(jì)、操作條件、局限性和適用性以達(dá)到預(yù)期目的，并確保分析方法可用于驗(yàn)證。在生物分析方法開發(fā)之前或進(jìn)行中，如果可行，申請(qǐng)人應(yīng)充分了解目標(biāo)待測(cè)物（例如藥物的理化性質(zhì)、體內(nèi)外代謝、紅細(xì)胞/血漿分布以及蛋白結(jié)合情況），并考慮可能適用的任何現(xiàn)有分析方法的各個(gè)方面。方法開發(fā)涉及明確待測(cè)物定量檢測(cè)相關(guān)的過程和條件，包括以下要素的充分表征：標(biāo)準(zhǔn)品/對(duì)照品關(guān)鍵試劑校準(zhǔn)曲線質(zhì)控樣品（QCs）選擇性和特異性靈敏度準(zhǔn)確度精密度回收率待測(cè)物穩(wěn)定性最低需求稀釋度（MRD）生物分析方法開發(fā)不需要保存大量的記錄或注釋。方法開發(fā)一旦完成，需經(jīng)過方法驗(yàn)證，證明該方法適用于研究樣品分析。如果在分析非臨床或臨床研究樣品期間遇到需要停止分析的問題，則應(yīng)記錄檢測(cè)方法的任何變更及其理由。2.2方法驗(yàn)證2.2.1完整驗(yàn)證為確保分析性能的可接受性和分析結(jié)果的可靠性，必須對(duì)生物分析方法進(jìn)行驗(yàn)證。生物分析方法是用于測(cè)定生物樣品中待測(cè)物濃度的一系列操作步驟。在建立用于臨床和關(guān)鍵非臨床研究中待測(cè)物定量分析方法時(shí)，應(yīng)對(duì)生物分析方法進(jìn)行全面驗(yàn)證。藥物研發(fā)過程中采用文獻(xiàn)報(bào)道的分析方法和商品試劑盒用于生物樣品分析時(shí)，也應(yīng)進(jìn)行完整驗(yàn)證。通常情況下僅需測(cè)定一個(gè)待測(cè)物，但有時(shí)需檢測(cè)多個(gè)待測(cè)物，可能涉及兩種不同的藥物、原形藥物及其代謝物、或藥物的對(duì)映體或異構(gòu)體。此時(shí)，所有目標(biāo)待測(cè)物的方法學(xué)驗(yàn)證和樣品分析都應(yīng)符合本指導(dǎo)原則。除另有說明外，色譜分析法的完整方法驗(yàn)證應(yīng)包括以下內(nèi)容：選擇性、特異性、基質(zhì)效應(yīng)、校準(zhǔn)曲線（響應(yīng)函數(shù)）、范圍（定量下限（LLOQ）至定量上限（ULOQ））、準(zhǔn)確度、精密度、殘留、稀釋可靠性、穩(wěn)定性和進(jìn)樣重現(xiàn)性。除另有說明外，LBA的方法驗(yàn)證應(yīng)包括以下內(nèi)容：特異性、選擇性、校準(zhǔn)曲線（響應(yīng)函數(shù)）、范圍（LLOQ至ULOQ）、準(zhǔn)確度、精密度、殘留、稀釋線性和穩(wěn)定性。必要時(shí)，如可獲得合適的研究樣品，還應(yīng)進(jìn)行平行性考察。方法學(xué)驗(yàn)證期間開展的各項(xiàng)評(píng)估應(yīng)與研究樣品的分析工作流程相關(guān)。用于分析方法驗(yàn)證的基質(zhì)（包括抗凝劑和添加劑）應(yīng)與研究樣品相同。在難以獲得與研究樣品相同基質(zhì)（例如，組織、腦脊液、膽汁等稀有基質(zhì)）或檢測(cè)游離藥物的情況下，可采用替代基質(zhì)開展分析方法驗(yàn)證。替代基質(zhì)的選擇應(yīng)科學(xué)合理。通常認(rèn)為，同一物種內(nèi)不同基質(zhì)間的差異（如年齡、種族、性別）不會(huì)影響方法驗(yàn)證。應(yīng)事先建立詳細(xì)具體描述生物分析方法及驗(yàn)證過程的書面文件，可采用研究方案、研究計(jì)劃、報(bào)告、記錄或標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）的形式。2.2.2部分驗(yàn)證對(duì)經(jīng)完全驗(yàn)證的分析方法的修改可以通過部分驗(yàn)證進(jìn)行評(píng)估。部分驗(yàn)證的內(nèi)容應(yīng)根據(jù)方法變更的范圍和性質(zhì)來確定，驗(yàn)證內(nèi)容可從僅一項(xiàng)準(zhǔn)確度和精密度驗(yàn)證到幾乎完整驗(yàn)證（參見第6.1節(jié)）。2.2.3交叉驗(yàn)證當(dāng)涉及多種分析方法和/或多個(gè)生物分析實(shí)驗(yàn)室時(shí)，需采用交叉驗(yàn)證評(píng)估報(bào)告數(shù)據(jù)間的相關(guān)性（參見第6.2節(jié)）。3.色譜法3.1對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品分析方法驗(yàn)證和研究樣品分析時(shí)，需將含有目標(biāo)待測(cè)物的對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入空白基質(zhì)中，以制備校正標(biāo)樣和質(zhì)控樣品。校正標(biāo)樣和質(zhì)控樣品應(yīng)采用不同的儲(chǔ)備液配制。但是，如果儲(chǔ)備液的準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性已得到驗(yàn)證，校正標(biāo)樣和質(zhì)控樣品可采用相同的儲(chǔ)備液配制。應(yīng)在所有校正標(biāo)樣、質(zhì)控樣品和研究樣品處理過程中加入適宜的內(nèi)標(biāo)（IS）。若不加內(nèi)標(biāo)，應(yīng)提供相應(yīng)的支持性證據(jù)。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品具有良好性質(zhì)至關(guān)重要，其質(zhì)量會(huì)影響分析結(jié)果，從而影響研究數(shù)據(jù)，因此要確保其質(zhì)量（純度、鑒別）和內(nèi)標(biāo)的適用性。方法驗(yàn)證和研究樣品分析過程中使用的對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品的來源應(yīng)可靠并可追溯，并且其化學(xué)形式應(yīng)與待測(cè)物相同。如果無法獲得與待測(cè)物相同的對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品，也可以使用質(zhì)量可控的其他化學(xué)形式的物質(zhì)（例如鹽或水合物）。適宜的對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品包括藥典標(biāo)準(zhǔn)品、商業(yè)化標(biāo)準(zhǔn)品或經(jīng)充分驗(yàn)證的內(nèi)部或外部組織制備的標(biāo)準(zhǔn)品。應(yīng)提供分析證書（CoA）或同等的其他材料來證明對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量，應(yīng)包含有關(guān)純度、儲(chǔ)存條件、重新標(biāo)定/失效日期和批號(hào)的相關(guān)信息。內(nèi)標(biāo)不需要提供分析證書，只要證明其適用性即可，例如能夠證明該物質(zhì)本身或其相關(guān)的任何雜質(zhì)對(duì)于待測(cè)物的檢測(cè)不會(huì)產(chǎn)生干擾。使用質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)，建議盡可能使用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)。同位素內(nèi)標(biāo)必須具有足夠高的同位素純度，并且不會(huì)發(fā)生同位素交換反應(yīng)。應(yīng)檢查是否存在未標(biāo)記待測(cè)物，如果檢測(cè)到未標(biāo)記待測(cè)物，則應(yīng)在方法驗(yàn)證期間評(píng)估其潛在影響。儲(chǔ)備液和工作液應(yīng)當(dāng)使用分析證書所標(biāo)明的穩(wěn)定期內(nèi)（即有效期或重新標(biāo)定日期）的對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品制備。3.2方法驗(yàn)證3.2.1選擇性選擇性是分析方法在空白生物基質(zhì)中存在潛在干擾物質(zhì)的情況下區(qū)分和測(cè)定待測(cè)物的能力。應(yīng)使用至少6個(gè)不同個(gè)體來源/批次（非溶血和非高脂）的空白基質(zhì)（不含待測(cè)物或內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)樣品）證明選擇性。在不同來源的基質(zhì)難以獲得的情況下，可以使用更少來源的基質(zhì)。還應(yīng)評(píng)估內(nèi)標(biāo)的選擇性。選擇性的評(píng)估應(yīng)證明空白樣品中待測(cè)物或內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間處沒有干擾組分引起的顯著響應(yīng)。每個(gè)基質(zhì)中，干擾組分的響應(yīng)不應(yīng)高于待測(cè)物定量下限響應(yīng)的20%，并且不高于定量下限樣品中內(nèi)標(biāo)響應(yīng)的5％。高脂基質(zhì)選擇性的評(píng)價(jià)應(yīng)使用至少一種來源的高脂基質(zhì)。為保證科學(xué)目的，用于驗(yàn)證的基質(zhì)應(yīng)盡可能代表預(yù)期研究樣品。應(yīng)盡量從甘油三酯水平異常高的受試者中獲得。如果難以獲得，也可以使用加入甘油三酯的基質(zhì)，雖然其并不能完全代表實(shí)際研究樣品。如果藥物影響脂質(zhì)代謝或預(yù)期的患者是高脂血癥群體，則不建議使用加入甘油三酯制備的高脂基質(zhì)。高脂基質(zhì)的選擇性驗(yàn)證對(duì)于臨床前研究來說不是必需的，除非藥物影響脂質(zhì)代謝或者在特定的高脂血癥動(dòng)物中應(yīng)用。溶血基質(zhì)選擇性的評(píng)價(jià)應(yīng)使用至少一種來源的溶血基質(zhì)，可通過向基質(zhì)中加入溶血全血（至少2%V/V）獲得，以形成明顯可見的溶血樣品。3.2.2特異性特異性是生物分析方法檢測(cè)和區(qū)分待測(cè)物與其他物質(zhì)的能力，包括相關(guān)物質(zhì)（例如與待測(cè)物結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)、代謝物、異構(gòu)體、雜質(zhì)、樣品制備過程中形成的降解產(chǎn)物，或預(yù)期目標(biāo)適應(yīng)癥患者的合并用藥）。如果生物基質(zhì)中預(yù)計(jì)存在相關(guān)物質(zhì)，則應(yīng)在方法驗(yàn)證期間或者在給藥前研究樣品中評(píng)估其影響。當(dāng)采用LC-MS方法時(shí)，特異性的考察包括比較待測(cè)物與潛在相關(guān)干擾物質(zhì)的分子量以及將相關(guān)物質(zhì)與待測(cè)物色譜分離。干擾組分的響應(yīng)不應(yīng)超過待測(cè)物定量下限響應(yīng)的20%，并不高于定量下限樣品中內(nèi)標(biāo)響應(yīng)的5%。在分析檢測(cè)過程中（包括提取過程或進(jìn)入離子源以后），還應(yīng)評(píng)估代謝物回復(fù)轉(zhuǎn)化為母體待測(cè)物的可能性（即潛在不穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物，如酯待測(cè)物到醇/酸代謝物、不穩(wěn)定的N-氧化物或葡萄糖苷酸代謝物、內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)）。在新化學(xué)實(shí)體藥物開發(fā)的早期階段尚未對(duì)代謝物進(jìn)行研究時(shí)，這種評(píng)估通常無法實(shí)現(xiàn)。但建議考慮以上情形，并在必要時(shí)進(jìn)行部分驗(yàn)證。如存在上述情況，則應(yīng)該在生物樣品分析報(bào)告中評(píng)估回復(fù)轉(zhuǎn)化程度，并討論對(duì)研究結(jié)果的影響。3.2.3基質(zhì)效應(yīng)基質(zhì)效應(yīng)是指由于生物基質(zhì)中的干擾物質(zhì)和通常未識(shí)別的成分引起的待測(cè)物響應(yīng)的改變。在方法驗(yàn)證過程中，需要考察不同來源/批次間的基質(zhì)效應(yīng)。基質(zhì)效應(yīng)應(yīng)通過分析至少3個(gè)重復(fù)的低和高濃度質(zhì)控樣品進(jìn)行評(píng)估，每個(gè)重復(fù)使用至少6個(gè)不同來源/批次的基質(zhì)制備。對(duì)于每一個(gè)來源/批次的基質(zhì)，準(zhǔn)確度應(yīng)在標(biāo)示濃度的±15％以內(nèi)，并且精密度（變異系數(shù)百分比，％CV）不應(yīng)大于15％。如果基質(zhì)難以獲得，可以允許使用更少來源/批次的基質(zhì)。如有可能，基質(zhì)效應(yīng)也應(yīng)在相關(guān)的患者群體或特殊人群（例如肝功能不全或腎功能不全患者）中評(píng)估。當(dāng)預(yù)計(jì)試驗(yàn)中會(huì)出現(xiàn)溶血或高脂基質(zhì)時(shí)，建議在方法驗(yàn)證期間根據(jù)具體情況使用溶血或高脂基質(zhì)進(jìn)行額外的基質(zhì)效應(yīng)考察。3.2.4校準(zhǔn)曲線和范圍校準(zhǔn)曲線用于描述待測(cè)物的標(biāo)示濃度與分析響應(yīng)之間的關(guān)系。通過在空白基質(zhì)中加入已知濃度待測(cè)物制備校正標(biāo)樣，涵蓋相應(yīng)的濃度范圍并組成校準(zhǔn)曲線。配制校正標(biāo)樣的基質(zhì)應(yīng)與研究樣品基質(zhì)相同。校準(zhǔn)曲線的濃度范圍由定量下限（LLOQ，校正標(biāo)樣的最低濃度）和定量上限（ULOQ，校正標(biāo)樣的最高濃度）來決定。在方法驗(yàn)證和每一分析批中，每個(gè)待測(cè)物都應(yīng)隨行一條校準(zhǔn)曲線。校準(zhǔn)曲線應(yīng)包括空白樣品、零濃度樣品（僅加入內(nèi)標(biāo)的空白樣品）和至少6個(gè)濃度水平的校正標(biāo)樣（包括定量下限和定量上限）。應(yīng)使用簡(jiǎn)單的回歸模型來充分描述濃度-響應(yīng)關(guān)系?；貧w模型的選擇應(yīng)該有書面的操作規(guī)程指導(dǎo)。應(yīng)在方法驗(yàn)證期間確定回歸模型、數(shù)據(jù)加權(quán)和轉(zhuǎn)換方案?？瞻讟悠泛土銤舛葮悠凡粦?yīng)該包含在校準(zhǔn)曲線回歸方程當(dāng)中。校正標(biāo)樣可以重復(fù)分析，在這種情況下，所有可接受的重復(fù)數(shù)據(jù)都應(yīng)納入校準(zhǔn)曲線回歸分析。報(bào)告中應(yīng)包括校準(zhǔn)曲線參數(shù)（例如線性擬合時(shí)的斜率和截距）、校正標(biāo)樣的回算濃度和計(jì)算的平均準(zhǔn)確度、精密度。應(yīng)提交在驗(yàn)證過程中所有可接受的校準(zhǔn)曲線，其中包括不同天內(nèi)考察的至少3個(gè)獨(dú)立分析批的校準(zhǔn)曲線。在定量下限水平，校正標(biāo)樣的回算濃度應(yīng)在標(biāo)示濃度的±20％以內(nèi)，其他水平應(yīng)在標(biāo)示值的±15％以內(nèi)。至少有75％的校正標(biāo)樣且至少6個(gè)濃度水平應(yīng)符合上述標(biāo)準(zhǔn)。在使用重復(fù)測(cè)定的情況下，對(duì)于每個(gè)濃度水平，至少50％的校正標(biāo)樣應(yīng)滿足接受標(biāo)準(zhǔn)（LLOQ±20％，其他濃度±15％）。如果不符合接受標(biāo)準(zhǔn)，則應(yīng)拒絕該校正標(biāo)樣，并重新擬合去除該點(diǎn)后的校準(zhǔn)曲線，包括回歸分析。對(duì)于準(zhǔn)確度和精密度考察的批次，如果分析批定量下限或定量上限校正標(biāo)樣的所有重復(fù)數(shù)據(jù)都不合格，則應(yīng)拒絕該批次結(jié)果，確定分析批失敗的可能原因，并在必要時(shí)修改方法。如果下一個(gè)驗(yàn)證批次也失敗，則應(yīng)在重新啟動(dòng)驗(yàn)證之前修改該方法。應(yīng)至少在一次評(píng)估中采用新鮮配制的校正標(biāo)樣制備校準(zhǔn)曲線。隨后，可在規(guī)定的穩(wěn)定期內(nèi)使用冷凍的校正標(biāo)樣。3.2.5準(zhǔn)確度和精密度3.2.5.1質(zhì)控樣品配制質(zhì)控樣品旨在模擬研究樣品，通過將已知濃度的待測(cè)物加入到空白基質(zhì)中來配制，并在與研究樣品相同預(yù)期條件下儲(chǔ)存和檢測(cè)，以評(píng)估分析方法的有效性。校正標(biāo)樣和質(zhì)控樣品應(yīng)采用不同的儲(chǔ)備液配制，以避免出現(xiàn)與分析方法性能無關(guān)的偏差。如果儲(chǔ)備液的準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性已得到驗(yàn)證，則可使用相同的儲(chǔ)備液配制校正標(biāo)樣和質(zhì)控樣品。如果不存在干擾或基質(zhì)效應(yīng)，也可以使用單一來源的空白基質(zhì)，詳見第3.2.3節(jié)。在方法驗(yàn)證過程中，應(yīng)配制在校準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)至少4個(gè)濃度水平的質(zhì)控樣品：LLOQ、在LLOQ濃度三倍以內(nèi)（低濃度質(zhì)控）、約為校準(zhǔn)曲線范圍的30-50％（中濃度質(zhì)控）和至少ULOQ的75％（高濃度質(zhì)控）。對(duì)于非準(zhǔn)確度和精密度驗(yàn)證的分析批，可重復(fù)分析低、中和高濃度QC樣品。這些QC樣品連同校正標(biāo)樣將為接受或拒絕分析批提供依據(jù)。3.2.5.2準(zhǔn)確度和精密度評(píng)估準(zhǔn)確度和精密度應(yīng)通過分析每一個(gè)分析批（批內(nèi)）和不同分析批間（批間）的質(zhì)控樣品來確定。應(yīng)使用相同批次的數(shù)據(jù)考察準(zhǔn)確度和精密度。批內(nèi)準(zhǔn)確度和精密度應(yīng)通過在每一分析批、對(duì)每個(gè)濃度水平的質(zhì)控樣品進(jìn)行至少5個(gè)樣品分析來評(píng)估。批間準(zhǔn)確度和精密度需要通過對(duì)每個(gè)濃度水平質(zhì)控在至少兩天內(nèi)考察的至少3個(gè)分析批結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。為了能夠評(píng)估一個(gè)分析批內(nèi)隨時(shí)間變化的任何趨勢(shì)，建議至少在一個(gè)分析批中證明質(zhì)控樣品的準(zhǔn)確度和精密度，該分析批的大小應(yīng)與研究樣品預(yù)期分析批大小相當(dāng)。報(bào)告的方法驗(yàn)證數(shù)據(jù)以及準(zhǔn)確度和精密度的測(cè)定應(yīng)包括所有獲得的結(jié)果，包括不符合接受標(biāo)準(zhǔn)的單個(gè)質(zhì)控樣品，已被記錄的明顯錯(cuò)誤情況除外。同時(shí)還要提交每個(gè)分析批的批內(nèi)準(zhǔn)確度和精密度數(shù)據(jù)。如果不是所有分析批的批內(nèi)準(zhǔn)確度和精密度均滿足標(biāo)準(zhǔn)，則應(yīng)計(jì)算每個(gè)濃度水平質(zhì)控樣品的批內(nèi)準(zhǔn)確度和精密度的總體估計(jì)值。批間精密度和準(zhǔn)確度應(yīng)合并所有批次的數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算。用于這些考察的分析批中，至少一個(gè)分析批的校準(zhǔn)曲線應(yīng)采用新鮮配制的校正標(biāo)樣制備。如果其他分析批未使用新鮮配制的校準(zhǔn)曲線，則需證明凍存校正標(biāo)樣的穩(wěn)定性。除LLOQ外，每個(gè)濃度水平質(zhì)控樣品的準(zhǔn)確度應(yīng)在標(biāo)示值的±15％以內(nèi)，LLOQ的準(zhǔn)確度應(yīng)在標(biāo)示值的±20％以內(nèi)。除LLOQ外，每個(gè)濃度水平質(zhì)控樣品的精密度（％CV）不應(yīng)超過15％，LLOQ的精密度不應(yīng)超過20％。對(duì)于非準(zhǔn)確度和精密度驗(yàn)證的分析批，至少2/3的QC樣品、每個(gè)濃度水平的至少50%應(yīng)在標(biāo)示值的±15%以內(nèi)。3.2.6殘留效應(yīng)殘留效應(yīng)是指前一個(gè)樣品保留在分析儀器上的殘余物而引起測(cè)定濃度變化。在方法開發(fā)過程中應(yīng)當(dāng)評(píng)估并盡量減少殘留。在驗(yàn)證期間，通過在ULOQ樣品之后分析空白樣品來考察殘留效應(yīng)。在ULOQ之后的空白樣品中的殘留應(yīng)不超過LLOQ樣品中待測(cè)物響應(yīng)的20％和內(nèi)標(biāo)響應(yīng)的5％。如果殘留不可避免，則研究樣品不能隨機(jī)進(jìn)樣，應(yīng)考慮具體措施，在方法驗(yàn)證時(shí)檢驗(yàn)并在研究樣品分析時(shí)應(yīng)用這些措施，以確保殘留不影響準(zhǔn)確度和精密度。包括在分析預(yù)期高濃度樣品之后，下一個(gè)研究樣品之前，進(jìn)樣空白樣品。3.2.7稀釋可靠性稀釋可靠性是在必要時(shí)對(duì)樣品稀釋過程的評(píng)估，以確保不會(huì)對(duì)待測(cè)物濃度的準(zhǔn)確度和精密度造成影響，應(yīng)使用與配制質(zhì)控樣品相同物種來源的空白基質(zhì)進(jìn)行樣品稀釋。稀釋質(zhì)控樣品的濃度應(yīng)大于ULOQ，采用空白基質(zhì)對(duì)樣品進(jìn)行稀釋，每個(gè)稀釋因子至少5個(gè)測(cè)定值，并在同一批次進(jìn)行檢測(cè)，以確保檢測(cè)濃度在校準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)被準(zhǔn)確、精密地測(cè)量。研究樣品分析過程中所用稀釋因子和濃度應(yīng)該處于方法學(xué)驗(yàn)證的稀釋因子和濃度范圍內(nèi)。稀釋質(zhì)控的平均準(zhǔn)確度應(yīng)在標(biāo)示值的±15%之內(nèi)，精密度（%CV）不應(yīng)超過15%。當(dāng)試驗(yàn)基質(zhì)難以獲得時(shí)，在證明不影響精密度和準(zhǔn)確度的情況下可以使用替代基質(zhì)進(jìn)行稀釋。3.2.8穩(wěn)定性應(yīng)進(jìn)行穩(wěn)定性考察，以確保樣品在制備、處理和分析過程中采取的每一步操作以及使用的儲(chǔ)存條件都不會(huì)影響待測(cè)物的濃度。用于穩(wěn)定性試驗(yàn)的儲(chǔ)存和分析條件，如樣品儲(chǔ)存時(shí)間和溫度、樣品基質(zhì)、抗凝劑和容器材料等，都應(yīng)與實(shí)際研究樣品相同。文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)不足以證明穩(wěn)定性結(jié)果。穩(wěn)定性考察中質(zhì)控樣品的儲(chǔ)存時(shí)間不應(yīng)比研究樣品儲(chǔ)存時(shí)間短。采用低濃度和高濃度穩(wěn)定性質(zhì)控樣品考察基質(zhì)中待測(cè)物的穩(wěn)定性。低濃度和高濃度穩(wěn)定性質(zhì)控樣品應(yīng)分別在零時(shí)和考察條件下放置后進(jìn)行評(píng)價(jià)。應(yīng)在每個(gè)濃度水平下制備一批QC樣品。對(duì)于每個(gè)濃度水平，應(yīng)將這批QC樣品分為至少3等份，以進(jìn)行儲(chǔ)存、處理和分析。由新鮮制備的校正標(biāo)樣獲得校準(zhǔn)曲線，根據(jù)校準(zhǔn)曲線分析穩(wěn)定性質(zhì)控樣品，同批次隨行檢測(cè)新鮮制備的質(zhì)控樣品或穩(wěn)定性已被證明的質(zhì)控樣品。每一濃度的均值應(yīng)在標(biāo)示濃度的±15%范圍內(nèi)。如果研究樣品的濃度持續(xù)高于校準(zhǔn)曲線的ULOQ，則應(yīng)調(diào)高穩(wěn)定性質(zhì)控樣品的濃度，以反映這些較高濃度樣品的穩(wěn)定性結(jié)果。由于溶解度的限制，這種情況在非臨床研究中很難出現(xiàn)。對(duì)固定復(fù)方制劑或特定藥物治療方案相關(guān)研究，應(yīng)使用含所有給藥化合物的基質(zhì)進(jìn)行各待測(cè)物在基質(zhì)中的凍融、前處理過程中和長期穩(wěn)定性的考察。通常應(yīng)該進(jìn)行下列穩(wěn)定性考察：1）基質(zhì)中的穩(wěn)定性凍融穩(wěn)定性為了評(píng)估從冷凍儲(chǔ)存條件中反復(fù)取出樣品的影響，應(yīng)在多次冷凍和解凍循環(huán)后考察待測(cè)物的穩(wěn)定性。應(yīng)采用與研究樣品相同的處理過程，對(duì)低和高濃度穩(wěn)定性質(zhì)控樣品進(jìn)行解凍和分析。穩(wěn)定性質(zhì)控樣品應(yīng)在解凍循環(huán)之間保持至少12小時(shí)的冷凍。用于凍融穩(wěn)定性考察的質(zhì)控樣品應(yīng)使用新鮮制備的校準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品或已證明穩(wěn)定的質(zhì)控樣品進(jìn)行評(píng)估。經(jīng)驗(yàn)證的冷凍-解凍循環(huán)次數(shù)應(yīng)不少于研究樣品所經(jīng)歷的凍融循環(huán)次數(shù)，至少應(yīng)進(jìn)行三次循環(huán)。前處理穩(wěn)定性（短期穩(wěn)定性）應(yīng)設(shè)計(jì)考察基質(zhì)中待測(cè)物前處理過程中的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，以模擬研究樣品的實(shí)驗(yàn)室處理?xiàng)l件。低濃度和高濃度穩(wěn)定性質(zhì)控樣品應(yīng)采用與研究樣品相同的方式解凍，并在前處理過程中保持與研究樣品相同的溫度和至少相同的持續(xù)時(shí)間。在前處理過程中的總時(shí)間應(yīng)該是一致的；不接受額外暴露于前處理?xiàng)l件下的時(shí)間累加（即不包括每次凍融考察的時(shí)間累加）。長期穩(wěn)定性應(yīng)考察基質(zhì)中的待測(cè)物在冰箱中儲(chǔ)存的長期穩(wěn)定性。低濃度和高濃度穩(wěn)定性質(zhì)控樣品應(yīng)在與研究樣品相同的冰箱儲(chǔ)存條件下保存至少相同的持續(xù)時(shí)間。對(duì)于化學(xué)藥物，可以接受將一個(gè)溫度（例如-20℃）的穩(wěn)定性外推到較低溫度（例如-70/80℃）。對(duì)于生物藥物，可以采用括號(hào)法，例如，在-70/80°C和-20°C條件下的穩(wěn)定性已經(jīng)被證明的情況下，若研究樣品儲(chǔ)存溫度在此范圍之間，則不必額外考察研究樣品儲(chǔ)存溫度下的長期穩(wěn)定性。2）處理后樣品中的待測(cè)物穩(wěn)定性應(yīng)考察處理后樣品穩(wěn)定性，包括分析完成前（在自動(dòng)進(jìn)樣器/儀器中）的時(shí)間。如：處理后樣品（干燥提取物或在進(jìn)樣階段）在研究樣品分析時(shí)存放條件下的穩(wěn)定性。處理后樣品在儀器或自動(dòng)進(jìn)樣器溫度下的穩(wěn)定性。處理后樣品的總存儲(chǔ)時(shí)間應(yīng)該是同期的（即自動(dòng)進(jìn)樣器存儲(chǔ)時(shí)間和其他存儲(chǔ)時(shí)間不能相加）。3）儲(chǔ)備液和工作液中待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)穩(wěn)定性應(yīng)根據(jù)分析研究樣品期間使用的儲(chǔ)存條件，確定待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的儲(chǔ)備液和工作液的穩(wěn)定性，采用溶液的最低和最高濃度進(jìn)行考察。考慮到檢測(cè)器的線性和檢測(cè)范圍，應(yīng)通過適當(dāng)稀釋，通過檢測(cè)器的響應(yīng)來考察儲(chǔ)備液和工作液的穩(wěn)定性。如果穩(wěn)定性隨濃度而變化，則需要考察所有濃度儲(chǔ)備液和工作液的穩(wěn)定性。如果穩(wěn)定同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)在與待測(cè)物相同的儲(chǔ)存條件下不發(fā)生同位素交換，則內(nèi)標(biāo)不需要進(jìn)行額外的穩(wěn)定性考察。如果對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品過期或已超過重新標(biāo)定日期，之前使用該批對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品配制的儲(chǔ)備液的穩(wěn)定性由儲(chǔ)備液的有效期或重新標(biāo)定日期決定。僅為了延長對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品的使用效期而將其配制成儲(chǔ)備液或工作液的做法是不被接受的。此外，如果適用，也應(yīng)該進(jìn)行下列考察：4）全血穩(wěn)定性樣品從受試者采集之后到儲(chǔ)存之前，應(yīng)該充分關(guān)注樣品基質(zhì)（全血）中待測(cè)物的穩(wěn)定性，以確保通過分析方法獲得的濃度能夠反映樣品采集時(shí)受試者血液中待測(cè)物的濃度。如果使用的基質(zhì)是血漿，則應(yīng)在方法開發(fā)（例如在全血中使用探索性方法）或方法驗(yàn)證期間考察全血中待測(cè)物的穩(wěn)定性。其結(jié)果應(yīng)在方法驗(yàn)證報(bào)告中提供。3.2.9進(jìn)樣重現(xiàn)性方法的重現(xiàn)性通過重復(fù)測(cè)定質(zhì)控樣品來考察，通常包含在精密度和準(zhǔn)確度考察中。但如果樣品可以重新進(jìn)樣（例如在儀器中斷或其他原因如設(shè)備故障的情況下），應(yīng)評(píng)估重新進(jìn)樣的重現(xiàn)性，以確定處理過的樣品的可行性，并支持它們?cè)谥匦逻M(jìn)樣前的儲(chǔ)存。重新進(jìn)樣的重現(xiàn)性通過由儲(chǔ)存后的校正標(biāo)樣和至少5個(gè)低濃度和高濃度QC組成的分析批重新進(jìn)樣來評(píng)估，以重新進(jìn)樣的QC樣品的精密度和準(zhǔn)確度確定處理后樣品重新進(jìn)樣的可行性。應(yīng)當(dāng)考察并將其結(jié)果納入方法驗(yàn)證報(bào)告或在生物分析報(bào)告中提交。3.3研究樣品分析方法驗(yàn)證完進(jìn)樣重現(xiàn)性成之后可進(jìn)行研究樣品分析，然而部分驗(yàn)證內(nèi)容可以在后續(xù)階段完成（如長期穩(wěn)定性）。提交注冊(cè)申請(qǐng)時(shí)生物分析方法驗(yàn)證應(yīng)已全部完成。根據(jù)已驗(yàn)證的分析方法處理研究樣品、質(zhì)控樣品和校正標(biāo)樣。如果考察系統(tǒng)適用性，則應(yīng)參照預(yù)先規(guī)定的具體研究計(jì)劃、方案或SOP進(jìn)行。系統(tǒng)適用性包括設(shè)備適應(yīng)和儀器性能，采用獨(dú)立于當(dāng)前批次校正標(biāo)樣和質(zhì)控的樣品進(jìn)行考察，受試者樣品不能用于考察系統(tǒng)適用性。同時(shí)應(yīng)監(jiān)測(cè)研究樣品中內(nèi)標(biāo)響應(yīng)，以確定是否存在系統(tǒng)性內(nèi)標(biāo)變異。有關(guān)內(nèi)容請(qǐng)參考表1。3.3.1分析批一個(gè)分析批由1個(gè)空白樣品（不含待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的處理后樣品）、1個(gè)零濃度樣品（含內(nèi)標(biāo)的處理后基質(zhì)）、至少6個(gè)濃度水平的校正標(biāo)樣、至少3個(gè)濃度水平的質(zhì)控樣品（低、中、高濃度雙樣品，或至少研究樣品總數(shù)的5％，兩者中取數(shù)目更多者）以及待分析的研究樣品。質(zhì)控樣品應(yīng)該分散到整個(gè)分析批中，以保證整個(gè)分析批的準(zhǔn)確度和精密度。質(zhì)控樣品應(yīng)始終與研究樣品同樣處理。校正標(biāo)樣和質(zhì)控樣品應(yīng)使用單獨(dú)配制的儲(chǔ)備液分別配制，除非儲(chǔ)備液的準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性已得到驗(yàn)證。所有樣品（校正標(biāo)樣、質(zhì)控樣品和研究樣品）應(yīng)按照擬分析順序在同一處理批中處理和提取。應(yīng)避免在同一分析批檢測(cè)的樣品在多個(gè)單獨(dú)處理批中處理。以上情況無法避免時(shí)，例如由于前處理穩(wěn)定性限制，則每個(gè)處理批應(yīng)包括低、中、高濃度質(zhì)控樣品。對(duì)于比較BA/BE研究，建議每例受試者的全部樣品在同一分析批中檢測(cè)，以減少結(jié)果的變異。應(yīng)評(píng)估和報(bào)告研究樣品分析過程中發(fā)生的任何殘留影響（見第3.2.6節(jié)）。如檢測(cè)到殘留，則應(yīng)減輕其對(duì)測(cè)定濃度的影響（例如研究樣品的非隨機(jī)化、在預(yù)期高濃度樣品后進(jìn)樣空白樣品）或在生物樣品分析報(bào)告中證明報(bào)告濃度的有效性。3.3.2分析批接受標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)在方案、研究計(jì)劃或SOP中規(guī)定接受或拒絕分析批的標(biāo)準(zhǔn)。若一個(gè)分析批包含多個(gè)處理批，則整個(gè)分析批及單獨(dú)處理批均應(yīng)滿足接受標(biāo)準(zhǔn)。即使分析批中一個(gè)處理批因不滿足接受標(biāo)準(zhǔn)被拒絕，分析批也存在滿足接受標(biāo)準(zhǔn)的可能。失敗處理批中的校正標(biāo)樣不能用于支持在該分析批中接受其他處理批。除LLOQ外，校正標(biāo)樣的回算濃度應(yīng)在標(biāo)示值的±15％以內(nèi)，LLOQ應(yīng)在±20％范圍內(nèi)。至少75％且不少于6個(gè)濃度水平的校正標(biāo)樣應(yīng)滿足該標(biāo)準(zhǔn)。如果采用的校正標(biāo)樣濃度超過6個(gè)且其中一個(gè)不滿足標(biāo)準(zhǔn)，則應(yīng)該拒絕該校正標(biāo)樣，重新計(jì)算不含該點(diǎn)的校準(zhǔn)曲線并進(jìn)行新的回歸分析。如果拒絕的校正標(biāo)樣是LLOQ，則該分析批新的LLOQ是校準(zhǔn)曲線下一個(gè)可接受的最低濃度校正標(biāo)樣；新的LLOQ應(yīng)滿足其原來的接受標(biāo)準(zhǔn)（即±15％）。如果最高濃度校正標(biāo)樣被拒絕，則該分析批的ULOQ是校準(zhǔn)曲線下一個(gè)可接受的最高濃度校正標(biāo)樣。重新擬合后的校準(zhǔn)曲線范圍應(yīng)覆蓋至少3個(gè)濃度水平（低、中、高）的質(zhì)控樣品。對(duì)于重新擬合校準(zhǔn)曲線范圍以外的研究樣品應(yīng)重新進(jìn)行分析。如果使用多樣品校正標(biāo)樣，其中僅有一個(gè)LLOQ或ULOQ標(biāo)樣不滿足接受標(biāo)準(zhǔn)，則校正范圍不變。至少2/3且每一濃度水平至少50%質(zhì)控樣品的準(zhǔn)確度值應(yīng)該在標(biāo)示值的±15%范圍內(nèi)。若不滿足這一標(biāo)準(zhǔn)，則應(yīng)拒絕該分析批。需要將失敗分析批中的所有研究樣品制備新的分析批次，以便進(jìn)行后續(xù)分析。如果批次失敗是由可歸結(jié)的技術(shù)原因引起的，則樣品可以重新進(jìn)樣。含有稀釋復(fù)測(cè)樣品的分析批應(yīng)包含稀釋質(zhì)控，以驗(yàn)證研究樣品分析過程中稀釋方法的準(zhǔn)確度和精密度。稀釋質(zhì)控的濃度應(yīng)大于需稀釋研究樣品（或ULOQ）的濃度，并采用相同的稀釋因子進(jìn)行稀釋。如果在一次分析批中使用多個(gè)稀釋因子，則稀釋QC只需按最高和最低稀釋因子稀釋。稀釋質(zhì)控的批內(nèi)接受標(biāo)準(zhǔn)僅影響稀釋研究樣品的接受情況，不影響分析批的結(jié)果。在同時(shí)檢測(cè)多個(gè)待測(cè)物的情況下，每個(gè)待測(cè)物都要有一條校準(zhǔn)曲線。如果分析批其中一個(gè)待測(cè)物的結(jié)果可以接受，而另一個(gè)待測(cè)物的結(jié)果被拒絕，則可以采用接受待測(cè)物的數(shù)據(jù)，被拒絕的待測(cè)物應(yīng)重新處理和分析。只需要報(bào)告重新分析的待測(cè)物的數(shù)據(jù)。報(bào)告中應(yīng)包含接受批的校正標(biāo)樣和質(zhì)控樣品的回算濃度。對(duì)于所有接受的分析批，應(yīng)計(jì)算每個(gè)濃度水平質(zhì)控樣品的總體（批間）準(zhǔn)確度和精密度，并在分析報(bào)告中提交（參見第8節(jié)和表1）。若總體平均準(zhǔn)確度和/或精密度不滿足15％的接受標(biāo)準(zhǔn)，則應(yīng)進(jìn)行調(diào)查以確認(rèn)出現(xiàn)偏差的原因。在比較BA/BE研究中出現(xiàn)這種情況，可能會(huì)導(dǎo)致結(jié)果被拒絕。3.3.3校正范圍如果在研究樣品分析開始前，已知或預(yù)測(cè)研究樣品中的待測(cè)物濃度范圍較窄，則建議縮窄校準(zhǔn)曲線范圍、調(diào)整質(zhì)控樣品濃度或適當(dāng)添加不同濃度新的質(zhì)控樣品，以充分反映研究樣品的濃度。在預(yù)期的治療劑量下，如果在樣品分析開始后，出現(xiàn)研究樣品向校準(zhǔn)曲線一端非預(yù)期聚集的情況，應(yīng)停止分析，在繼續(xù)進(jìn)行研究樣品分析之前，縮窄校準(zhǔn)曲線范圍（即部分驗(yàn)證）、調(diào)整現(xiàn)有質(zhì)控樣品濃度，或者在觀察到的范圍內(nèi)增加額外濃度的質(zhì)控樣品。在優(yōu)化校準(zhǔn)曲線范圍或質(zhì)控濃度之前已分析過的樣品，沒有必要進(jìn)行重新分析。以上要求同樣適用于大量研究樣品的分析濃度高于ULOQ的情況。如果可能，應(yīng)調(diào)整校準(zhǔn)曲線范圍，并增加質(zhì)控樣品或調(diào)整濃度。如無法調(diào)整校準(zhǔn)曲線范圍或濃度超過ULOQ的樣品數(shù)量不多，則應(yīng)采用經(jīng)驗(yàn)證的稀釋方法對(duì)樣品進(jìn)行稀釋。至少2個(gè)質(zhì)控樣品濃度水平應(yīng)在研究樣品的濃度范圍內(nèi)。如果校準(zhǔn)曲線范圍被調(diào)整，則應(yīng)重新驗(yàn)證生物分析方法（部分驗(yàn)證），以驗(yàn)證響應(yīng)函數(shù)并確保準(zhǔn)確度和精密度。3.3.4研究樣品重分析研究樣品分析開始前，應(yīng)該在方案、研究計(jì)劃或SOP中預(yù)先規(guī)定重新分析研究樣品的理由、重復(fù)次數(shù)以及報(bào)告值的選擇標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于正在分析多種待測(cè)物的研究樣品，如果其中一種待測(cè)物不符合接受標(biāo)準(zhǔn)，不應(yīng)拒絕另一種待測(cè)物的有效結(jié)果。應(yīng)在生物樣品分析報(bào)告中提供并討論重分析樣品的數(shù)量（以及占樣品總數(shù)的百分比）。對(duì)于比較BA/BE研究，應(yīng)使用單獨(dú)的表格報(bào)告拒絕的分析批的濃度值。研究樣品重分析可能基于下列理由：由于校正標(biāo)樣的準(zhǔn)確度和/或質(zhì)控樣品的準(zhǔn)確度和精密度不滿足接受標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致分析批被拒絕；研究樣品的內(nèi)標(biāo)響應(yīng)與校正標(biāo)樣和質(zhì)控樣品的內(nèi)標(biāo)響應(yīng)差異顯著（在SOP中預(yù)先規(guī)定）；測(cè)得的濃度高于ULOQ；測(cè)得的濃度低于調(diào)整后的LLOQ，而該批校準(zhǔn)曲線中最低濃度校正標(biāo)樣已被拒絕，導(dǎo)致LLOQ比其他分析批高；進(jìn)樣不當(dāng)或設(shè)備故障；稀釋后的研究樣品濃度低于LLOQ；在給藥前樣品、對(duì)照或安慰劑樣品中測(cè)得可定量的待測(cè)物；色譜圖不佳（SOP中預(yù)先規(guī)定）。對(duì)于比較BA/BE研究，通常不接受由于藥代動(dòng)力學(xué)原因（例如樣品濃度與預(yù)期曲線不符）重分析研究樣品，因?yàn)檫@樣可能會(huì)影響研究結(jié)果。應(yīng)在生物樣品分析報(bào)告中提供包含所有重分析樣品的初始值、重分析原因、重分析結(jié)果、采用結(jié)果及理由的匯總表。此外，應(yīng)提供針對(duì)每種原因重新分析的樣本總數(shù)的匯總表。在首次分析結(jié)果無法報(bào)告的情況下，認(rèn)為單次重分析是足夠的（例如濃度高于ULOQ或儀器故障）。在需要對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)情況下（例如給藥前樣品具有可測(cè)量濃度），如果樣品體積足夠，則可以進(jìn)行重復(fù)測(cè)定。受試者的安全性應(yīng)優(yōu)先于試驗(yàn)中的任何其他方面。因此，可能還有其他情況，需要因調(diào)查安全性而重新分析特定的研究樣品。3.3.5研究樣品重進(jìn)樣如果已經(jīng)在方法驗(yàn)證時(shí)證明了進(jìn)樣重現(xiàn)性或在生物樣品分析報(bào)告中提供了進(jìn)樣重現(xiàn)性的結(jié)果，在儀器故障的情況下，可以將已經(jīng)處理的樣品重新進(jìn)樣分析。僅僅因?yàn)樾Ｕ龢?biāo)樣或質(zhì)控樣品失敗，而沒有任何確定的分析原因，就重新進(jìn)樣一個(gè)完整的分析批或個(gè)別校正標(biāo)樣或質(zhì)控樣品是不可接受的。3.3.6色譜圖積分在研究計(jì)劃、方案或SOP中應(yīng)規(guī)定色譜圖積分以及重積分的要求。任何與規(guī)定要求不符的偏離都應(yīng)在生物樣品分析報(bào)告中討論，此外，生物分析報(bào)告中還應(yīng)提供需要重積分的色譜圖列表，包括所有手動(dòng)積分情況以及重積分的理由。應(yīng)保留原始和重積分色譜圖以及初始和重復(fù)積分結(jié)果以供參考，并在比較BA/BE研究的生物樣品分析報(bào)告中提交。4.配體結(jié)合分析4.1主要試劑4.1.1對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)進(jìn)行充分表征并提供充足的證明性文件（例如，檢驗(yàn)分析證書和來源）。生物藥物具有高度復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，其與用于生物樣品分析的結(jié)合試劑的反應(yīng)活性可能會(huì)受藥品生產(chǎn)工藝變化影響。因此用于配制校正標(biāo)樣和質(zhì)控的對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品批次應(yīng)盡可能與非臨床試驗(yàn)和臨床試驗(yàn)中使用的批次保持一致。如果用于生物樣品分析的標(biāo)準(zhǔn)品批次發(fā)生變化，則應(yīng)在使用前用原始批次和新批次的質(zhì)控樣品進(jìn)行評(píng)估，以確保方法學(xué)的性能符合接受標(biāo)準(zhǔn)。4.1.2關(guān)鍵試劑關(guān)鍵試劑包括結(jié)合試劑（例如結(jié)合蛋白、適配子、抗體或偶聯(lián)抗體）和含酶試劑，對(duì)分析結(jié)果有直接影響，因此必須確保關(guān)鍵試劑的質(zhì)量。關(guān)鍵試劑通過與待測(cè)物結(jié)合，發(fā)生相互作用以產(chǎn)生與待測(cè)物濃度相關(guān)的儀器響應(yīng)。應(yīng)在分析方法中對(duì)關(guān)鍵試劑進(jìn)行鑒定和規(guī)定。在方法開發(fā)的早期應(yīng)考慮關(guān)鍵試劑的可靠采購方式，無論是自制還是購買商品化試劑。關(guān)鍵試劑的數(shù)據(jù)表應(yīng)至少包括試劑標(biāo)識(shí)、來源、批次/批號(hào)，純度（如適用）、濃度（如適用）和穩(wěn)定性/復(fù)測(cè)日期/儲(chǔ)存條件（參考表1）。也有可能需要提供額外的表征數(shù)據(jù)。關(guān)鍵試劑生命周期管理程序是必要的，以確保關(guān)鍵試劑的原始批次和新批次的一致性。試劑性能應(yīng)通過生物分析方法來評(píng)估。一般關(guān)鍵試劑的微小變化不會(huì)影響分析性能，而重大變化可能會(huì)顯著影響其性能。如果變化較?。ɡ?，其中一種試劑來源發(fā)生變化），則進(jìn)行一個(gè)對(duì)比性的準(zhǔn)確度和精密度分析批驗(yàn)證即可。但如果變化較大，則有必要進(jìn)行額外的驗(yàn)證試驗(yàn)。理想情況下，直接對(duì)新試劑和舊試劑的分析結(jié)果進(jìn)行比較即可。重大變化包括但不限于以下方面：抗體生產(chǎn)工藝的改變，從動(dòng)物采集的額外血樣用于制備多克隆抗體和新克隆、新供貨商的單克隆抗體。應(yīng)記錄復(fù)驗(yàn)日期和驗(yàn)證參數(shù)，以支持延長使用或更換關(guān)鍵試劑。試劑的穩(wěn)定性試驗(yàn)應(yīng)基于生物分析方法中試劑的性能表現(xiàn)和儲(chǔ)存條件的一般指導(dǎo)原則，考察時(shí)間可延長至超過供應(yīng)商提供的效期范圍。同時(shí)應(yīng)記錄性能參數(shù)，來支持關(guān)鍵試劑效期延長或更換。4.2方法驗(yàn)證LBA大部分情況下使用微孔板，每個(gè)研究樣品可使用單孔或多孔的方式進(jìn)行分析。分析方式應(yīng)在方案、研究計(jì)劃或SOP中進(jìn)行規(guī)定。如果在方法學(xué)開發(fā)和驗(yàn)證中每個(gè)樣品使用單孔或多孔進(jìn)行分析，那么樣品分析中也應(yīng)該每個(gè)樣品相應(yīng)地分別使用單孔或多孔進(jìn)行分析。如果每個(gè)樣品采用多孔方式進(jìn)行分析，可以采用復(fù)孔響應(yīng)的平均值來報(bào)告樣品濃度或分別計(jì)算每個(gè)孔的濃度值，再取復(fù)孔濃度平均值的方法報(bào)告結(jié)果。數(shù)據(jù)評(píng)估應(yīng)基于可報(bào)告的濃度值。4.2.1特異性特異性與LBA中的交叉反應(yīng)性概念有關(guān)。重要的是，結(jié)合試劑與目標(biāo)待測(cè)物特異性結(jié)合，但不與共存的結(jié)構(gòu)相關(guān)分子（例如，內(nèi)源性化合物、異構(gòu)體或結(jié)構(gòu)相關(guān)的伴隨藥物）發(fā)生交叉反應(yīng)。可采用在空白基質(zhì)樣品中添加研究樣品中最大濃度的預(yù)期相關(guān)干擾物質(zhì)來考察。應(yīng)考察加入最大濃度相關(guān)干擾物質(zhì)時(shí)，目標(biāo)待測(cè)物在LLOQ和ULOQ水平的準(zhǔn)確度。添加相關(guān)干擾物質(zhì)的空白樣品的響應(yīng)應(yīng)低于LLOQ。存在相關(guān)干擾物質(zhì)的情況下，目標(biāo)待測(cè)物的準(zhǔn)確度不應(yīng)超過標(biāo)示值的±25。當(dāng)存在非特異性干擾的情況下，應(yīng)在空白基質(zhì)中添加遞增濃度的相關(guān)干擾物質(zhì)，考察目標(biāo)待測(cè)物在LLOQ和ULOQ水平的準(zhǔn)確度，來評(píng)估相關(guān)干擾物質(zhì)對(duì)分析方法的影響。存在干擾時(shí)，需確定發(fā)生干擾時(shí)相關(guān)干擾物質(zhì)最低濃度。在生物樣品分析過程中，應(yīng)采取適當(dāng)措施避免，例如，可能需要相應(yīng)地調(diào)整LLOQ/ULOQ或考慮新方法。在方法學(xué)開發(fā)和早期分析驗(yàn)證期間，這些“相關(guān)干擾物質(zhì)”通常不可獲得?？梢栽谧畛醯姆椒▽W(xué)驗(yàn)證完成后，再補(bǔ)充特異性驗(yàn)證。4.2.2選擇性選擇性是指在樣品基質(zhì)中存在非特異性干擾成分時(shí)，分析方法檢測(cè)和區(qū)分目標(biāo)待測(cè)物的能力?；|(zhì)中可能含有干擾目標(biāo)待測(cè)物檢測(cè)的非特異性成分，如降解酶、異嗜性抗體或類風(fēng)濕因子。應(yīng)評(píng)估低濃度水平的選擇性，因?yàn)樵诤芏喟咐?，低濃度水平的分析?huì)存在選擇性的問題，但也建議在較高的待測(cè)物濃度水平下評(píng)估選擇性。因此，應(yīng)通過向至少10個(gè)不同來源的空白基質(zhì)中，分別加入LLOQ和高濃度質(zhì)控水平的目標(biāo)待測(cè)物來考察選擇性。在稀有基質(zhì)的情況下，可接受使用較少不同來源的空白基質(zhì)。至少80不同來源的空白樣品的響應(yīng)應(yīng)低于LLOQ的響應(yīng)。至少80不同來源中，目標(biāo)待測(cè)物標(biāo)樣樣品的LLOQ的準(zhǔn)確度應(yīng)在標(biāo)示值的±25%范圍內(nèi)，高濃度水平質(zhì)控的準(zhǔn)確度應(yīng)在標(biāo)示值的±20%范圍內(nèi)。應(yīng)評(píng)估高脂基質(zhì)和溶血樣品中的選擇性（參考第3.2.1節(jié)）。對(duì)于高脂和溶血樣品，可以使用單一來源的基質(zhì)分析一個(gè)批次來評(píng)估選擇性。應(yīng)在相關(guān)患者人群（如腎或肝功能損傷患者、炎癥或免疫腫瘤患者，如適用）的樣品中評(píng)估選擇性。在這種情況下，至少需要使用5名患者不同來源的基質(zhì)。4.2.3校準(zhǔn)曲線和范圍校準(zhǔn)曲線反映了待測(cè)物濃度與分析平臺(tái)響應(yīng)值之間的關(guān)系。校準(zhǔn)曲線由已知濃度的待測(cè)物加入基質(zhì)中配制得到的構(gòu)成一定濃度范圍的校正標(biāo)樣組成。校正標(biāo)樣應(yīng)使用與研究樣品相同的生物基質(zhì)制備。定量范圍由最低濃度的校正標(biāo)樣LLOQ和最高濃度的校正標(biāo)樣ULOQ來定義。在方法學(xué)驗(yàn)證期間，每一個(gè)待測(cè)物的每一個(gè)分析批都應(yīng)有一條校準(zhǔn)曲線。如有需要，應(yīng)說明使用替代基質(zhì)的合理性。校準(zhǔn)曲線應(yīng)至少由6個(gè)濃度水平的校正標(biāo)樣建立，包括LLOQ和ULOQ，以及一個(gè)空白樣品?？瞻讟悠凡粦?yīng)參與校準(zhǔn)曲線參數(shù)的計(jì)算。可以使用濃度低于標(biāo)準(zhǔn)曲線LLOQ和高于ULOQ的錨定點(diǎn)樣品來改善曲線的擬合。如果上下漸近線附近有數(shù)據(jù)點(diǎn)，則校準(zhǔn)曲線的響應(yīng)和濃度之間的關(guān)系通常由四參數(shù)或五參數(shù)logistic模型來擬合，如果有合理的理由，也可采用其他模型進(jìn)行擬合。應(yīng)該在不同天內(nèi)評(píng)估至少6個(gè)獨(dú)立批次，以考察批次間的變異性。每個(gè)校正標(biāo)樣回算濃度的準(zhǔn)確度和精密度應(yīng)滿足：LLOQ和ULOQ水平的準(zhǔn)確度和精密度在標(biāo)示值的±25范圍內(nèi)，其他所有濃度水平的準(zhǔn)確度和精密度在標(biāo)示值的±20范圍內(nèi)。在不包括錨定點(diǎn)的情況下，應(yīng)至少有75，且至少6個(gè)濃度水平的校正標(biāo)樣（包括LLOQ和ULOQ）符合上述標(biāo)準(zhǔn)。錨定點(diǎn)因超出校準(zhǔn)曲線的定量范圍，可不要求滿足上述標(biāo)準(zhǔn)。建議校準(zhǔn)曲線采用新鮮配制的校正標(biāo)樣。如果不使用新鮮配制的校正標(biāo)樣，則可在規(guī)定的穩(wěn)定期內(nèi)使用凍存的校正標(biāo)樣。4.2.4準(zhǔn)確度和精密度4.2.4.1質(zhì)控樣品的配制質(zhì)控樣品旨在模擬研究樣品，通過在基質(zhì)中加入已知量的待測(cè)物來配制，并在與預(yù)期研究樣品相同的條件下儲(chǔ)存和檢測(cè)，以評(píng)估分析方法的有效性。用于配制質(zhì)控樣品的稀釋系列應(yīng)完全獨(dú)立于用于配制校正標(biāo)樣的稀釋系列。如果儲(chǔ)備液的準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性已得到驗(yàn)證，，則可使用同一份儲(chǔ)備液（或工作儲(chǔ)備液）來配制校正標(biāo)樣和質(zhì)控樣品。在校準(zhǔn)曲線定量范圍內(nèi)質(zhì)控樣品應(yīng)至少配制5個(gè)濃度水平：LLOQ、LLOQ的三倍以內(nèi)（低濃度質(zhì)控）、校準(zhǔn)曲線定量范圍幾何平均值附近（中濃度質(zhì)控）、ULOQ的75%以上（高濃度質(zhì)控）以及ULOQ。對(duì)于非準(zhǔn)確度和精密度驗(yàn)證分析批，可分析兩組低、中和高濃度QC樣品。這些QC樣品連同校正標(biāo)樣將為接受或拒絕分析批提供依據(jù)。4.2.4.2準(zhǔn)確度和精密度評(píng)估準(zhǔn)確度和精密度應(yīng)通過分析每一個(gè)分析批內(nèi)（批內(nèi)）和不同分析批間（批間）的質(zhì)控樣品來確定。準(zhǔn)確度和精密度應(yīng)使用同樣的分析批和數(shù)據(jù)來進(jìn)行評(píng)估。準(zhǔn)確度和精密度應(yīng)通過在2天或2天以上的至少6個(gè)分析批中，對(duì)每一個(gè)質(zhì)控濃度水平（LLOQ、低、中、高、ULOQ）至少重復(fù)分析3次來確定。報(bào)告的方法驗(yàn)證數(shù)據(jù)和準(zhǔn)確度及精密度的測(cè)定應(yīng)包括所有可獲得的結(jié)果，但明顯錯(cuò)誤且記錄在案的情況除外。應(yīng)報(bào)告每個(gè)分析批的批內(nèi)準(zhǔn)確度和精密度數(shù)據(jù)。如果不是所有的分析批均符合批內(nèi)準(zhǔn)確度或精密度的接受標(biāo)準(zhǔn)，則應(yīng)計(jì)算每一個(gè)濃度水平質(zhì)控樣品的批內(nèi)準(zhǔn)確度和精密度的總體估計(jì)值。分析批之間（批間）精密度和準(zhǔn)確度應(yīng)結(jié)合所有分析批的數(shù)據(jù)來計(jì)算。除LLOQ和ULOQ（應(yīng)在標(biāo)示值的±25范圍內(nèi)）外，每個(gè)濃度水平下的批內(nèi)和批間總體準(zhǔn)確度應(yīng)在標(biāo)示值的±20%范圍內(nèi)。除LLOQ和ULOQ不應(yīng)超過25外，每一濃度水平質(zhì)控的批內(nèi)和批間精密度均不應(yīng)超過20%。對(duì)于非準(zhǔn)確度和精密度驗(yàn)證分析批，至少2/3的總質(zhì)控樣品和每個(gè)濃度水平至少50%的質(zhì)控樣品應(yīng)在標(biāo)示值的±20%范圍內(nèi)。此外，還應(yīng)評(píng)估總誤差（即準(zhǔn)確度（%）和精密度（%）誤差絕對(duì)值的總和））?？傉`差不應(yīng)超過30%（LLOQ和ULOQ的總誤差不應(yīng)超過40%）。4.2.5殘留效應(yīng)LBA一般不會(huì)出現(xiàn)殘留效應(yīng)的問題。但是，如果分析平臺(tái)有出現(xiàn)殘留的趨勢(shì)，應(yīng)通過在ULOQ的校正標(biāo)樣之后放置空白樣品來考察殘留效應(yīng)的可能性?？瞻讟悠返捻憫?yīng)應(yīng)低于LLOQ。4.2.6稀釋線性和鉤狀效應(yīng)由于很多LBA的分析范圍狹窄，因此研究樣品的濃度可能需要稀釋后才能處于定量范圍內(nèi)。對(duì)稀釋線性進(jìn)行評(píng)估，以確定：（i）測(cè)量濃度在校準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)不受稀釋的影響，以及（ii）高于校準(zhǔn)曲線ULOQ的樣品濃度的準(zhǔn)確性不受鉤狀效應(yīng)（即由高濃度待測(cè)物引起的信號(hào)抑制）的影響，以免產(chǎn)生錯(cuò)誤的結(jié)果。應(yīng)使用與研究樣品相同的基質(zhì)來制備稀釋用質(zhì)控樣品。稀釋線性采用稀釋質(zhì)控來驗(yàn)證，即在基質(zhì)中加入高于ULOQ濃度的待測(cè)物，分析未稀釋的樣品（用于鉤狀效應(yīng)），同時(shí)用空白基質(zhì)稀釋該樣品（至少3個(gè)不同稀釋因子）至校準(zhǔn)曲線濃度范圍內(nèi)。至少用3個(gè)獨(dú)立配制的稀釋系列來考察每一個(gè)稀釋因子，復(fù)孔數(shù)與樣品分析中的復(fù)孔數(shù)保持一致。通過稀釋質(zhì)控樣品驗(yàn)證是否存在響應(yīng)抑制現(xiàn)象（鉤狀效應(yīng)），如果觀察到該現(xiàn)象且不能通過合理的方式來消除，則應(yīng)在研究樣品分析過程中采取措施減輕響應(yīng)抑制。經(jīng)稀釋因子校正后，每個(gè)稀釋質(zhì)控樣品的計(jì)算平均濃度應(yīng)在標(biāo)示值的±20%范圍內(nèi)，精密度不應(yīng)超過20%。在研究樣品分析過程中應(yīng)用的稀釋因子應(yīng)在經(jīng)驗(yàn)證合格的稀釋因子范圍內(nèi)。4.2.7穩(wěn)定性應(yīng)進(jìn)行穩(wěn)定性評(píng)估，以確保樣品制備、處理和分析過程中的每一步驟以及儲(chǔ)存條件不會(huì)影響待測(cè)物的濃度。穩(wěn)定性試驗(yàn)的儲(chǔ)存和分析條件，如樣品儲(chǔ)存時(shí)間和溫度、樣品基質(zhì)、抗凝劑和容器材料，都應(yīng)反映實(shí)際研究樣品條件。僅用參考文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)證明穩(wěn)定性是不夠的。應(yīng)采用儲(chǔ)存時(shí)間等于或大于研究樣品儲(chǔ)存時(shí)間的穩(wěn)定性質(zhì)控樣品進(jìn)行儲(chǔ)存期限的驗(yàn)證。使用低濃度和高濃度的穩(wěn)定性質(zhì)控樣品評(píng)估待測(cè)物在基質(zhì)中的穩(wěn)定性。低和高濃度的穩(wěn)定性質(zhì)控樣品分別在零時(shí)和一定儲(chǔ)存條件儲(chǔ)存后進(jìn)行評(píng)估。每個(gè)濃度水平應(yīng)制備一批質(zhì)控樣品，該批質(zhì)控樣品至少分成三份，用于儲(chǔ)存、處理和分析。由新鮮制備的校正標(biāo)樣獲得校準(zhǔn)曲線，根據(jù)校準(zhǔn)曲線分析穩(wěn)定性質(zhì)控樣品，同批次隨行檢測(cè)新鮮制備的質(zhì)控樣品或穩(wěn)定性已被證明的質(zhì)控樣品。盡管使用新鮮制備的校正標(biāo)樣和質(zhì)控樣品是首選的方式，但對(duì)于大分子，在某些情況下，可能需要將其冷凍過夜。在這種情況下，應(yīng)提供有效的數(shù)據(jù)證明凍融穩(wěn)定性。質(zhì)控樣品在每個(gè)凍融循環(huán)間應(yīng)該至少冷凍12小時(shí)。每個(gè)質(zhì)控水平下的平均濃度與標(biāo)示值的偏差應(yīng)在±20%范圍內(nèi)。在定量范圍狹窄的情況下，許多LBA可能需要對(duì)樣品進(jìn)行稀釋，研究樣品的濃度可能始終高于校準(zhǔn)曲線的ULOQ。如果是這種情況，應(yīng)考慮樣品稀釋，調(diào)整穩(wěn)定性質(zhì)控樣品的濃度來表示實(shí)際樣品濃度范圍。對(duì)于固定劑量復(fù)方制劑和特定的給藥方案，評(píng)估基質(zhì)中一個(gè)待測(cè)物的凍融穩(wěn)定性、前處理穩(wěn)定性和長期穩(wěn)定性時(shí)，應(yīng)該在基質(zhì)中加入所有的給藥化合物，具體視情況而定。如第3.2.8節(jié)所述，穩(wěn)定性的驗(yàn)證應(yīng)包括室溫或樣品制備溫度下的前處理過程（短期）穩(wěn)定性和凍融穩(wěn)定性。此外，應(yīng)驗(yàn)證長期凍存穩(wěn)定性。對(duì)于化學(xué)藥物，將一種溫度（例如-20℃）下的穩(wěn)定性外推至更低溫度（例如-70℃/-80℃）是可接受的。對(duì)于生物藥物，可以采用括號(hào)法，例如在-70℃/-80℃和-20°C下證明穩(wěn)定性的情況下，則無需考察樣品在這兩個(gè)溫度之間儲(chǔ)存的穩(wěn)定性。4.3研究樣品分析在驗(yàn)證完成后可進(jìn)行研究樣品的分析，但是一些參數(shù)可能在稍后的階段中完成（例如，長期穩(wěn)定性）。當(dāng)數(shù)據(jù)提交給監(jiān)管機(jī)構(gòu)時(shí)，生物分析方法學(xué)驗(yàn)證應(yīng)該已經(jīng)完成。研究樣品、質(zhì)控樣品和校正標(biāo)樣的處理應(yīng)與經(jīng)過驗(yàn)證的分析方法保持一致。有關(guān)內(nèi)容請(qǐng)參閱表1。4.3.1分析批一個(gè)分析批包括一個(gè)空白樣品，至少6個(gè)濃度水平的校正標(biāo)樣，至少3個(gè)濃度水平的質(zhì)控樣品（低、中和高）各兩套（或至少占研究樣品總數(shù)的5，以較高者為準(zhǔn)），以及待分析研究樣品?？瞻讟悠凡粦?yīng)納入校準(zhǔn)曲線參數(shù)的計(jì)算中。質(zhì)控樣品應(yīng)分散在分析批中，且能夠與所有研究樣品同樣處理，以確保整個(gè)分析批準(zhǔn)確度和精密度符合要求。大多數(shù)情況下，LBA使用微孔板。一個(gè)分析批可包括一個(gè)或多個(gè)板。通常，每塊板包含一套獨(dú)立的校準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品。如果每塊板包含獨(dú)立的校準(zhǔn)標(biāo)樣和質(zhì)控樣品，那么需單獨(dú)評(píng)估每塊板是否符合接受標(biāo)準(zhǔn)。但是，對(duì)于某些分析平臺(tái)，樣品容量可能是有限的。這種情況下，可以在第一塊和最后一塊板上各放置一套校正標(biāo)樣，但質(zhì)控樣品應(yīng)分散在每塊板上。至少在每塊板的研究樣品開始（之前）和結(jié)束（之后）均應(yīng)放置質(zhì)控樣品。每塊板上的質(zhì)控樣品及每條校準(zhǔn)曲線均應(yīng)符合接受標(biāo)準(zhǔn)（參見第4.3.2節(jié)）。計(jì)算濃度時(shí)，應(yīng)整合所有校正標(biāo)樣進(jìn)行一次回歸分析。如果整合的校準(zhǔn)曲線不符合接受標(biāo)準(zhǔn)，則整個(gè)分析批失敗。4.3.2分析批接受標(biāo)準(zhǔn)在方案、研究計(jì)劃或SOP中應(yīng)明確定義接受或拒絕分析批的標(biāo)準(zhǔn)。如果分析批包含多個(gè)處理批，則整個(gè)分析批和各個(gè)處理批均應(yīng)符合接受標(biāo)準(zhǔn)。即使分析批中的一個(gè)處理批因不符合接受標(biāo)準(zhǔn)而被拒絕，分析批也有可能滿足接受標(biāo)準(zhǔn)。在失敗的分析批中的校準(zhǔn)樣品不能用于支持同分析批中其他批次的接受。校正標(biāo)樣除LLOQ和ULOQ水平外的所有濃度水平的回算濃度應(yīng)在標(biāo)示值的±20以內(nèi)，LLOQ和ULOQ水平的回算濃度應(yīng)在標(biāo)示值的±25以內(nèi)。至少75的校正標(biāo)樣且至少6個(gè)濃度水平，應(yīng)符合上述接受標(biāo)準(zhǔn)。上述要求不適用于錨定點(diǎn)校正標(biāo)樣。如果設(shè)置超過6個(gè)校正標(biāo)樣，且其中一個(gè)校正標(biāo)樣不符合接受標(biāo)準(zhǔn)，則應(yīng)拒絕該校正標(biāo)樣，應(yīng)剔除該校正標(biāo)樣后對(duì)校準(zhǔn)曲線進(jìn)行重新評(píng)估并再次進(jìn)行回歸分析。如果校正標(biāo)樣的LLOQ不符合要求被拒絕，則此分析批新的定量下限為校準(zhǔn)曲線可接受的次低濃度的校正標(biāo)樣。如果校準(zhǔn)標(biāo)樣的ULOQ不符合要求被拒絕，則該分析批新的定量上限為校準(zhǔn)曲線可接受的次高濃度的校正標(biāo)樣。修訂后的定量下限和定量上限校正標(biāo)樣將保持原來的接受標(biāo)準(zhǔn)（即±20）。修訂后的校準(zhǔn)曲線校正范圍必須涵蓋所有質(zhì)控樣品（低、中、高）。超出修訂后校準(zhǔn)曲線校正范圍的研究樣品應(yīng)重新進(jìn)行分析。每個(gè)分析批應(yīng)至少包含3個(gè)濃度水平質(zhì)控樣品（低、中、高）。在研究樣品分析過程中，校正標(biāo)樣和質(zhì)控樣品應(yīng)與研究樣品的復(fù)孔數(shù)保持一致。至少2/3的質(zhì)控樣品以及在每個(gè)濃度水平下50％的質(zhì)控樣品的準(zhǔn)確度應(yīng)在標(biāo)示值的±20以內(nèi)。如果接受標(biāo)準(zhǔn)與上述標(biāo)準(zhǔn)不同，則應(yīng)在SOP或方案中預(yù)先說明。應(yīng)計(jì)算所有可接受分析批中每個(gè)濃度水平質(zhì)控樣品總體的平均準(zhǔn)確度和精密度，并在分析報(bào)告中進(jìn)行報(bào)告。如果總體平均準(zhǔn)確度和/或精密度超過20，應(yīng)進(jìn)行額外的調(diào)查以分析導(dǎo)致該偏差的原因。在比較BA/BE研究中，這種情況可能會(huì)導(dǎo)致數(shù)據(jù)被拒絕。4.3.3校正范圍研究樣品分析中，至少2個(gè)水平的質(zhì)控樣品應(yīng)落入研究樣品測(cè)定的濃度范圍內(nèi)。在預(yù)期的治療劑量下，如果研究樣品開始分析后，發(fā)現(xiàn)研究樣品的結(jié)果聚集在校準(zhǔn)曲線一端，那么應(yīng)停止分析，在繼續(xù)進(jìn)行研究樣品分析之前，可采取下列方法優(yōu)化檢測(cè)方法：縮小標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)范圍（即部分驗(yàn)證），更改現(xiàn)有的質(zhì)控濃度，或者在原校準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)增加額外濃度水平的質(zhì)控樣品。在優(yōu)化校準(zhǔn)曲線范圍或質(zhì)控濃度之前，不需重新分析已分析的研究樣品。4.3.4研究樣品重分析在開始分析研究樣品之前，應(yīng)在方案、研究計(jì)劃或SOP中預(yù)先規(guī)定重分析生物樣品的可能原因、重分析的數(shù)量和重分析后選擇報(bào)告值的標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)在生物分析報(bào)告中報(bào)告并討論重分析的樣品數(shù)量（以及占樣品總數(shù)的百分比）。對(duì)于比較BA/BE研究，應(yīng)使用單獨(dú)的表格報(bào)告拒絕的分析批的濃度值。研究樣品重分析可能原因有：由于校正標(biāo)樣的準(zhǔn)確度和/或質(zhì)控樣品的精密度和準(zhǔn)確度不符合接受標(biāo)準(zhǔn)，因而拒絕該分析批；檢測(cè)濃度高于ULOQ；因校準(zhǔn)曲線LLOQ被拒絕，調(diào)整后的校準(zhǔn)曲線的定量下限高于其他分析批，導(dǎo)致檢測(cè)濃度低于調(diào)整后的定量下限；設(shè)備發(fā)生故障；稀釋樣品濃度低于LLOQ；給藥前樣品、對(duì)照或安慰劑樣品中檢測(cè)到可定量的目標(biāo)待測(cè)物；如果生物樣品為復(fù)孔檢測(cè)，由于一個(gè)孔的結(jié)果未能達(dá)到預(yù)定義的接受標(biāo)準(zhǔn)（例如，復(fù)孔間差異較大，其中一個(gè)孔的濃度高于ULOQ或低于LLOQ）而獲得不可報(bào)告的值。對(duì)于比較BA/BE研究，不可接受由于PK原因（例如樣品濃度不符合預(yù)期曲線）對(duì)研究樣品進(jìn)行的重分析，因?yàn)檫@樣可能導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果發(fā)生偏差。生物分析報(bào)告中應(yīng)報(bào)告重分析樣品，并提供初始值、重分析的原因、重分析的結(jié)果、最終接受的值以及接受的理由。此外，報(bào)告中應(yīng)提供由于各種原因而重分析的樣品匯總表。如果在第一次分析時(shí)，產(chǎn)生了不可報(bào)告結(jié)果，那么單次樣品重分析是足夠的（例如，濃度高于ULOQ或復(fù)孔間的差異過大）。樣品的重分析的復(fù)孔數(shù)應(yīng)與最初分析時(shí)的孔數(shù)一致。在某些需要確認(rèn)檢測(cè)結(jié)果的情況下（例如，給藥前樣品檢測(cè)到可測(cè)量濃度），在樣品體積允許時(shí)需要多樣品測(cè)定。臨床試驗(yàn)受試者的安全應(yīng)優(yōu)先于試驗(yàn)的任何其他方面。因此，在其他情況下，可能需要為了調(diào)查目的重新分析特定研究樣本。5.已測(cè)樣品再分析（ISR）研究樣品與方法驗(yàn)證中使用的校正標(biāo)樣和QC樣品的表現(xiàn)可能不同，后者是通過向空白基質(zhì)中加入待測(cè)物而制備的。在蛋白結(jié)合、已知或未知代謝物的回復(fù)轉(zhuǎn)化、樣品非均一性、合并用藥或研究樣品特有的生物組分等方面的差異，可能影響測(cè)定的研究樣品中待測(cè)物的濃度。ISR旨在驗(yàn)證所報(bào)告的樣品待測(cè)物濃度的可靠性。至少應(yīng)在下列情況下開展ISR：對(duì)于本指南范圍內(nèi)的非臨床試驗(yàn)，一般每個(gè)種屬應(yīng)至少進(jìn)行一次ISR所有關(guān)鍵性的比較BA/BE試驗(yàn)首次人體臨床試驗(yàn)關(guān)鍵性早期患者試驗(yàn)，每個(gè)患者群體一次首次或關(guān)鍵性肝功能和/或腎功能不全患者試驗(yàn)通過使用同樣的生物分析方法，在不同天單獨(dú)的（即不同于原來的）分析批重新分析給定試驗(yàn)的部分樣品，來開展ISR。ISR的規(guī)模依賴于待測(cè)物和研究樣品，并應(yīng)基于對(duì)分析方法和待測(cè)物的深入了解。當(dāng)研究樣品總數(shù)≤1000時(shí)，至少應(yīng)重新分析10%的樣品；如果樣品總數(shù)>1000，則應(yīng)分析前1000樣品的10%（即100），加上超過1000樣品數(shù)目的5%樣品。應(yīng)在研究方案、研究計(jì)劃或SOP中，預(yù)先確定ISR研究樣品選取的客觀標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)從用藥的群體中，盡可能隨機(jī)選擇受試者/實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，重要的是足以覆蓋濃度分布。因此，推薦在峰濃度（Cmax）周圍選擇ISR樣品以及部分在消除相選擇。此外，所選擇的樣品應(yīng)代表整個(gè)試驗(yàn)。不應(yīng)混合樣品，因?yàn)榛旌蠘悠房赡芟拗飘惓Ｇ闆r的發(fā)現(xiàn)。ISR樣品和質(zhì)控樣品應(yīng)以和原始分析同樣的方式處理和分析。應(yīng)在待測(cè)物穩(wěn)定性窗口內(nèi)進(jìn)行ISR，但不應(yīng)在與原始分析的同一天。應(yīng)根據(jù)下式計(jì)算原始濃度和重新分析測(cè)得濃度平均值的百分偏差：%差值=對(duì)于色譜方法，至少2/3的重新分析的百分偏差應(yīng)在±20%范圍內(nèi)。對(duì)于LBA方法，至少2/3的重新分析的百分偏差應(yīng)在±30%范圍內(nèi)。如果總體ISR結(jié)果不符合接受標(biāo)準(zhǔn)，則應(yīng)進(jìn)行調(diào)查并糾正原因。應(yīng)該有SOP指導(dǎo)如何引發(fā)和開展調(diào)查。如果調(diào)查不能確定失敗原因，則也應(yīng)在分析報(bào)告中提供ISR失敗對(duì)試驗(yàn)有效性的影響。如果ISR滿足接受標(biāo)準(zhǔn)，但在多個(gè)樣品的結(jié)果中顯示較大的或系統(tǒng)性誤差，這可能表明分析存在問題，建議繼續(xù)開展調(diào)查。值得關(guān)注的趨勢(shì)性例子可能包括：來自一名受試者的所有ISR均失敗來自一個(gè)分析批的所有ISR均失敗ISR評(píng)價(jià)的所有內(nèi)容均應(yīng)記錄，以允許重構(gòu)該試驗(yàn)和任何調(diào)查。與原始值偏差很大（例如>50%或“異常值”）的單個(gè)樣品不應(yīng)引發(fā)對(duì)原始樣品的重新分析，且不必調(diào)查。ISR樣品數(shù)據(jù)不應(yīng)取代研究樣品的原始數(shù)據(jù)。6.部分驗(yàn)證和交叉驗(yàn)證6.1部分驗(yàn)證部分驗(yàn)證旨在評(píng)價(jià)對(duì)已經(jīng)完整驗(yàn)證的生物分析方法的修改。部分驗(yàn)證的范圍可由少至一個(gè)批內(nèi)準(zhǔn)確度和精密度的測(cè)定，到接近于完整驗(yàn)證。如果在一個(gè)場(chǎng)所建立了穩(wěn)定性，則不必在另一個(gè)場(chǎng)所重復(fù)驗(yàn)證。對(duì)于色譜法，這類典型的生物分析方法修改或變更包括但不限于下列情形：使用同樣方法，但變更分析地點(diǎn)（即生物分析方法在不同實(shí)驗(yàn)室間轉(zhuǎn)移）分析方法變更（例如變更檢測(cè)體系、檢測(cè)平臺(tái)）樣品處理步驟變更樣品體積變更（例如較小的兒童樣品體積）標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍變更生物體液中抗凝劑變更（但反離子不變）（例如從肝素變?yōu)橐叶匪囊宜幔‥DTA）同一種屬，從一種基質(zhì)變更為另一種基質(zhì)（例如從人血漿變?yōu)檠寤蚰X脊液），或同一基質(zhì)，從一個(gè)種屬變更為不同種屬（例如從大鼠血漿變更為小鼠血漿）儲(chǔ)存條件變更對(duì)于LBA分析，這類典型的生物分析方法修改或變更包括但不限于下列情形：LBA關(guān)鍵試劑變更（例如變更批號(hào)）MRD變更儲(chǔ)存條件變更標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍變更分析方法變更（例如變更檢測(cè)體系或檢測(cè)平臺(tái)）使用同樣方法，但變更分析地點(diǎn)（即生物分析方法在不同實(shí)驗(yàn)室間轉(zhuǎn)移）樣品預(yù)處理變更生物體液中抗凝劑變更（但反離子不變）（例如從肝素變?yōu)镋DTA）如果檢測(cè)到的參數(shù)滿足完整驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)，則部分驗(yàn)證可以被接受。如果不滿足這些標(biāo)準(zhǔn)，則需要額外的調(diào)查和驗(yàn)證。6.2交叉驗(yàn)證當(dāng)涉及多個(gè)生物分析方法和/或多個(gè)生物分析實(shí)驗(yàn)室時(shí)，需采用交叉驗(yàn)證來評(píng)估報(bào)告數(shù)據(jù)間的相關(guān)性。下列情形需要進(jìn)行交叉驗(yàn)證：在一項(xiàng)試驗(yàn)中，從不同的經(jīng)完整驗(yàn)證的方法獲得數(shù)據(jù)在一項(xiàng)試驗(yàn)中，從不同實(shí)驗(yàn)室使用同一生物分析方法獲得數(shù)據(jù)在不同試驗(yàn)中，從不同的經(jīng)完整驗(yàn)證的方法獲得數(shù)據(jù)，將被合并或用于比較，以支持特定給藥方案，或監(jiān)管機(jī)構(gòu)用于做出關(guān)于安全性、有效性和藥品說明書的決定如果數(shù)據(jù)來自不同的經(jīng)完全驗(yàn)證的方法，并且數(shù)據(jù)不用于各試驗(yàn)合并，通常不需要交叉驗(yàn)證。如果可能，應(yīng)在分析研究樣品之前進(jìn)行交叉驗(yàn)證。交叉驗(yàn)證應(yīng)使用兩種方法或在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室中測(cè)量同一批QC樣品（低、中、高濃度），至少三個(gè)重復(fù)，和在試驗(yàn)研究濃度范圍內(nèi)的實(shí)際樣品（如果可以獲得）（n330）的結(jié)果進(jìn)行評(píng)估?？赏ㄟ^Bland-Altman作圖或Deming回歸來評(píng)估偏差。也可以使用其他用于評(píng)估兩種方法一致性的工具（例如一致性相關(guān)系數(shù)）。還可以用每種方法得到的研究樣品檢測(cè)濃度-時(shí)間曲線作圖來評(píng)估偏差。在進(jìn)行一項(xiàng)比較BA/BE試驗(yàn)中，強(qiáng)烈反對(duì)使用多種生物分析方法來測(cè)量同一待測(cè)物。7.相關(guān)考慮7.1待測(cè)物同為內(nèi)源性物質(zhì)的分析方法對(duì)于同為內(nèi)源性物質(zhì)的待測(cè)物（例如替代療法），當(dāng)檢測(cè)方法不能區(qū)分治療藥物和內(nèi)源性物質(zhì)時(shí)，待測(cè)物檢測(cè)的準(zhǔn)確性成為挑戰(zhàn)。此外，待測(cè)物的內(nèi)源性水平可能隨年齡、性別、人種、晝夜變化、疾病或藥物治療的副作用的變化而變化。生物標(biāo)志物不在本指南的范圍內(nèi)。如有可能，用于制備校正標(biāo)樣和QC樣品的生物基質(zhì)應(yīng)與研究樣品基質(zhì)（即真實(shí)的生物基質(zhì)）相同，且應(yīng)如第3節(jié)和第4節(jié)所述無基質(zhì)效應(yīng)和干擾。選擇的生物基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)濃度應(yīng)足夠低，以獲得足夠的信噪比（例如，小于LLOQ的20%）。在沒有可用的無干擾基質(zhì)時(shí)，可使用以下方法計(jì)算研究樣品中待測(cè)物的濃度：1）替代基質(zhì)法，2）替代待測(cè)物法，3）背景扣除法，4）標(biāo)準(zhǔn)添加法。替代基質(zhì)法：采用替代基質(zhì)配制校正標(biāo)樣。替代基質(zhì)從簡(jiǎn)單緩沖液或仿真人工基質(zhì)，到去除內(nèi)源性待測(cè)物的基質(zhì)或其他的基質(zhì)，復(fù)雜程度可能有很大差異。替代待測(cè)物法：采用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的待測(cè)物作為質(zhì)譜法中的替代標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以構(gòu)建內(nèi)源性待測(cè)物定量的校準(zhǔn)曲線。此方法假設(shè)實(shí)際待測(cè)物和替代待測(cè)物除分子量外的物理化學(xué)性質(zhì)基本相同。然而，同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時(shí)間和質(zhì)譜靈敏度可能不同于待測(cè)物，因此，在應(yīng)用該方法之前，應(yīng)確認(rèn)標(biāo)記與未標(biāo)記待測(cè)物的質(zhì)譜響應(yīng)的比率（即響應(yīng)因子）應(yīng)接近一致，并在整個(gè)校準(zhǔn)范圍內(nèi)保持恒定。如果響應(yīng)因子不符合這些要求，則應(yīng)將其納入校準(zhǔn)曲線的回歸方程中。背景扣除法：外加待測(cè)物的校正標(biāo)樣中測(cè)得的濃度減去在合并基質(zhì)/代表性基質(zhì)中測(cè)得的內(nèi)源性物質(zhì)濃度，然后使用凈差值建立校準(zhǔn)曲線。加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)前，若通過稀釋空白基質(zhì)來降低背景濃度（例如，如果需要更低的LLOQ），則研究樣品和校正標(biāo)樣中基質(zhì)的組成不同，可能導(dǎo)致不同的回收率和基質(zhì)效應(yīng)。在驗(yàn)證方法時(shí)，應(yīng)考慮這些差異。標(biāo)準(zhǔn)添加法：標(biāo)準(zhǔn)添加法僅適用于具有線性響應(yīng)的分析平臺(tái)。通常，標(biāo)準(zhǔn)添加法用于確定實(shí)際基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)的濃度，以用于制備校正標(biāo)樣和QC樣品。然而，該方法也可用于研究樣品的測(cè)定。該方法中，每個(gè)研究樣本被分成等份。除一份外，所有等分試樣均單獨(dú)加入已知和不同量的待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)，以構(gòu)建實(shí)際空白基質(zhì)或每個(gè)研究樣品的校準(zhǔn)曲線（例如，3到5個(gè)點(diǎn)）。然后將內(nèi)源性空白濃度或研究樣品濃度確定為該特定研究樣品中制備的校準(zhǔn)曲線的x軸負(fù)截距。除了第3節(jié)和第4節(jié)中所示的驗(yàn)證外，同為內(nèi)源性物質(zhì)的待測(cè)物的分析方法進(jìn)行驗(yàn)證還需要考慮以下因素。7.1.1待測(cè)物同為內(nèi)源性物質(zhì)分析方法的質(zhì)控樣品在制備QC樣品之前，應(yīng)評(píng)估生物基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)濃度。應(yīng)使用內(nèi)源性干擾物質(zhì)濃度盡可能低的基質(zhì)。QC樣品的濃度應(yīng)考慮實(shí)際基質(zhì)中的內(nèi)源性物質(zhì)濃度，并應(yīng)代表預(yù)期的研究樣品濃度。QC樣品應(yīng)類似于研究樣品，并應(yīng)在同一基質(zhì)中制備。原則上，用于驗(yàn)證的所有QC樣品濃度應(yīng)為未添加（如果可能，內(nèi)源性物質(zhì)濃度在LLOQ和LQC之間）和添加已知濃度（HQC、MQC和LQC）的實(shí)際生物基質(zhì)濃度的整數(shù)倍。添加樣品（例如LLOQ、LQC）中待測(cè)物添加量應(yīng)足以提供比內(nèi)源性物質(zhì)濃度高三倍以上，或統(tǒng)計(jì)學(xué)上足以顯示比內(nèi)源性濃度更高。如果多批次、不同供應(yīng)商和可能含有較低濃度待測(cè)物的特殊群體基質(zhì)等，總是產(chǎn)生內(nèi)源性物質(zhì)水平很高的基質(zhì)，以致無法在實(shí)際基質(zhì)中制備LQC，則可使用稀釋基質(zhì)或替代基質(zhì)。7.1.2待測(cè)物同為內(nèi)源性物質(zhì)分析方法的選擇性、回收率和基質(zhì)效應(yīng)由于缺乏無干擾的基質(zhì)，選擇性的評(píng)估很復(fù)雜。對(duì)于色譜法，作為方法驗(yàn)證的一部分，應(yīng)通過使用分辨檢測(cè)系統(tǒng)（例如串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS））分析來自多個(gè)供體（至少6個(gè)正常空白、1個(gè)溶血和1個(gè)脂質(zhì)）的基質(zhì)來考察峰純度。如果有科學(xué)原理證明，也可以考慮其他方法。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)添加法和背景扣除法，由于研究樣品和校正標(biāo)樣使用相同的生物基質(zhì)和待測(cè)物，故兩者具有相同的回收率和基質(zhì)效應(yīng)。然而，如果內(nèi)源性成分不完全相同（例如重組蛋白），則應(yīng)在一項(xiàng)平行試驗(yàn)中評(píng)估回收率的潛在差異。對(duì)于替代基質(zhì)和替代待測(cè)物方法，校正標(biāo)樣和研究樣品之間的基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率可能不同。應(yīng)評(píng)估并確?；|(zhì)效應(yīng)（特別是在LLOQ水平）不會(huì)影響準(zhǔn)確度和精密度。如果使用替代基質(zhì)法，應(yīng)評(píng)估替代基質(zhì)和實(shí)際基質(zhì)中不同基質(zhì)效應(yīng)和回收率的影響。應(yīng)在同一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，采用基質(zhì)中加入待測(cè)物、僅內(nèi)源性基質(zhì)以及替代基質(zhì)中加入待測(cè)物得到的QC樣品，用替代校準(zhǔn)曲線進(jìn)行分析。如果在質(zhì)譜色譜法中使用替代待測(cè)物方法，應(yīng)評(píng)估替代待測(cè)物和實(shí)際內(nèi)源性物質(zhì)之間不同基質(zhì)效應(yīng)和回收率的影響。應(yīng)在同一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，采用基質(zhì)中加入待測(cè)物、僅內(nèi)源性基質(zhì)以及替代物加入基質(zhì)中得到的QC樣品，用替代基質(zhì)校準(zhǔn)曲線進(jìn)行分析。在某些情況下，當(dāng)內(nèi)源性物質(zhì)水平較高且LLOQ需要降低時(shí)，可能需要使用替代基質(zhì)稀釋QC樣品（例如背景扣除法）。此時(shí)，應(yīng)使用內(nèi)源性物質(zhì)濃度在LLOQ和LQC之間的實(shí)際生物基質(zhì)（如果可用），重復(fù)進(jìn)行回收率和基質(zhì)效應(yīng)實(shí)驗(yàn)。色譜法和LBA法的接受標(biāo)準(zhǔn)分別參見第3節(jié)和第4節(jié)。由于