分子生物學實驗講義

分子生物學實驗講義ExperimentalDirectionofMolecularBiology昆明醫(yī)學院基礎學院生物化學教研室DepartmentofBiochemistryFacultyofBasicMedicalSciences,Kunming2007年3月實驗一質粒DNA的提取與限制酶切鑒定IsolationofPlasmidDNAandIdentificationbyRestrictionDigestion一、

目的(Objectives)掌握質粒DNA小量快速提取法；了解DNA限制性核酸內切酶酶切鑒定原理。二、

原理(Principles))質粒（plasmid）是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子。其分子量大小在1－200kb之間。是具有雙鏈閉合環(huán)狀結構的DNA分子，質粒主要發(fā)現(xiàn)于細菌、放線菌和真菌細胞中，具有自主復制和轉錄能力，能使子代細胞保持它們恒定的拷貝數(shù)，可表達它攜帶的遺傳信息。質粒一般獨立游離在細胞質內，也可整合到細菌染色體中，它離開宿主的細胞就不能存活，而它控制的許多生物學功能卻賦予宿主細胞某些表型。所有分離質粒DNA的方法都包括3個基本步驟：培養(yǎng)細菌使質粒擴增；收集和裂解細菌；分離和純化質粒DNA。采用溶菌酶可破壞菌體細胞壁，十二烷基硫酸鈉（Sodiumdodecylsulfate,SDS）可使細胞壁裂解。細菌經溶菌酶和陰離子去污劑（SDS）處理后，細菌DNA纏繞附著在細胞壁碎片上，離心時易被沉淀出來，而質粒DNA則留在上清液中。再經酒精沉淀、洗滌處理，可得到質粒DNA。共價閉環(huán)DNA（covalentlyclosedcircularDNA，簡稱cccDNA）質粒以超螺旋形式存在。若兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂，分子就能旋轉而消除鏈的張力，這種松弛型的DNA分子叫作開環(huán)DNA（opencircularDNA,簡稱ocDNA）。在電泳時，同一質粒如以cccDNA形式存在，它比其開環(huán)和線狀DNA的泳動速度都快，因此在本實驗中，質粒DNA在電泳凝膠中呈現(xiàn)3條區(qū)帶。限制性內切酶是分子生物學研究中的一種工具酶，這類酶的特點是具有能夠識別雙鏈DNA分子上的特異核苷酸順序的能力，能在這個特異性核苷酸序列內，切斷DNA的雙鏈，形成一定長度的DNA片段。如：EcoRⅠ和HindⅢ的識別序列和切口是：

EcoRⅠ：G↓AATTC

HindⅢ：A↓AGCTT限制性內切酶對環(huán)狀質粒DNA有多少切口，就能產生多少酶切片段，因此鑒定酶切后的片段在電泳凝膠的區(qū)帶數(shù)，就可以推斷酶切口的數(shù)目，從片段的遷移率可以大致判斷酶切片段大小的差別。用已知分子量的線狀DNA為對照，通過電泳遷移率的比較，就可以粗略推測分子形狀相同的未知DNA的分子量。三、

主要設備、實驗材料和試劑（Equipments,MaterialsandAgents）1．主要設備(Equipments)（1）塑料離心管1.5mL×30（2）塑料離心管架×1（3）微量加樣器10μL、100μL、1000μL各一支（4）常用玻璃儀器及滴管等（5）臺式高速離心機（16000r/min）（6）電泳儀（7）電泳槽（8）樣品槽模板2．材料(Materials)：質粒轉化大腸桿菌3．試劑(Agents)（1）溶液Ⅰ：pH8.0G.E.T緩沖液（50mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mmol/LTris-HCl）；用前加溶菌酶4mg/mL。（2）溶液Ⅱ:1mol/LNaOH40μl,5%SDS40μl,蒸餾水120μl，臨用時配制。（3）溶液Ⅲ：pH4.8乙酸鉀溶液（60mL5mol/LKAc，11.5mL冰乙酸，28.5mLH2O）（4）苯酚/氯仿（1∶1，V/V）：苯酚需在160℃重蒸，加入抗氧化劑8-羥基喹啉，使其濃度為0.1%，并用Tris-HCl緩沖液平衡兩次。氯仿中加入異戊醇，氯仿/異戊醇（24∶1，V/V）。

（5）pH8.0TE緩沖液：10mmol/LTris，1mmol/LEDTA，其中含有RNA酶（RNase）20μg/mL。（6）TAE電泳緩沖液：（7）DNA染色試劑SybrGreen或EB染色液：（8）10X上樣緩沖液（9）DNA分子量標準物（DNAMarker）四、操作步驟(Methods)1．培養(yǎng)細菌(cultivationofbacteria)將帶有質粒的大腸桿菌于培養(yǎng)液中過夜培養(yǎng)2．細菌中質粒DNA的快速提起（RapidIsolationofPlasmidDNAFromBacteria）（1）取液體培養(yǎng)菌液1.5mL置小離心管中，10000r/min離心1min去掉上清液。加入150μL的溶液Ⅰ，充分混懸細菌，在室溫下放置10min。（2）加入200μL新配置的溶液Ⅱ。加蓋，顛倒5次使之混勻。冰上放置5min。（3）加150μL冷卻的溶液Ⅲ，加蓋后顛倒5混勻，冰上放置15min。10000r/min離心5min，上清液倒入另一離心管中。（4）向上清液中加入等體積苯酚/氯仿，震蕩混勻，10000r/min離心2min，將上清液轉移至新的離心管中。（5）向上清液中加入等體積無水乙醇，混勻，室溫放置2min。離心5min，倒去上清乙醇溶液，將離心管倒扣在吸水紙上，吸干液體。（6）加1mL70%乙醇，震蕩并離心，倒去上清液，晾干，加入20μL的TE緩沖液，使DNA完全溶解，待用。3．質粒DNA的限制酶切(RestrictionDigestionofPlasmidDNA)取潔凈消毒1.5ml離心管1支，分別加入下列成分：自提樣品質粒：10μL10×酶切緩沖液：2μL限制性內切酶：2～4u加雙蒸水至總體積20μL，小心混勻，置于37℃水浴中，酶解1h，反應終止后，各酶切樣品于冰箱中貯存?zhèn)溆谩?．DNA瓊脂糖凝膠電泳(AgaroseGelElectrophoresisofDNA)（1）瓊脂糖凝膠的制備：稱取0.4g瓊脂糖，置于三角瓶中，加入50mLTAE緩沖液，置微波爐加熱全部融化后，取出搖勻，此為0.8%的瓊脂糖凝膠。（2）瓊脂糖凝膠板的制備：將膠模兩端用膠帶封閉，水平放置，插入上樣梳。待瓊脂糖凝膠液將冷卻至65℃左右時，小心倒入膠模中，使膠液緩慢展開，直到在整個玻璃板表面形成均勻的膠層，室溫下靜置20min，待凝固完全后，輕輕拔出上樣梳，在膠板上即形成相互隔開的樣品槽。（3）取3支1.5ml離心管，分別加入DNAmarker10μL、全部酶切DNA、未酶切的質粒DNA5μL，再向各管中加入上樣緩沖液2μL，SybrGreen2μL，混勻。（4）加樣：用微量加樣器將上述3種樣品分別加入凝膠樣品小槽內。每次加完一個樣品，要用蒸餾水反復洗凈微量加樣器，以防止相互污染。(5)電泳加完樣品后的凝膠板，立即通電。樣品進膠前，應使電流控制在20mA，樣品進膠后電壓控制在60~80V，電流為40~50mA。當指示劑色帶移動至距離膠板1～2cm處，停止電泳。(6)

將電泳后的膠板在紫外檢測儀下觀察在瓊脂糖凝膠中的DNA條帶。五、結果觀察(Observationofresults)在波長為254nm的紫外燈下，觀察染色后的電泳膠板。DNA存在處顯示出綠色的熒光條帶。六、思考題(Questions)1．細菌染色體DNA與質粒DNA分離的主要依據(jù)是什么？實驗二PCR技術及應用PCRTechniqueandItsApplications一、

目的(Objective)掌握PCR基本原理和方法；熟悉PCR技術的應用。二、原理(Principles)聚合酶鏈式反應（PolymeraseChainReaction，PCR）是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，為最常用的分子生物學技術之一。典型的PCR由模板高溫變性、引物與模板退火和引物鏈沿模板延伸三步反應組成一個循環(huán)，通過多次循環(huán)反應，使目的DNA得以迅速擴增。其主要步驟是：將待擴增的模板DNA置高溫下（通常為93℃-94℃）使其變性為單鏈；人工合成的兩個寡核苷酸引物（單鏈DNA）在其合適的復性溫度下分別與待擴增模板DNA的兩條單鏈互補結合，兩個引物在模板上結合的位置決定了擴增片段的長短；耐熱的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃將單核苷酸從引物的3’端開始摻入，按5’→3’方向延伸，合成與DNA模板互補的新鏈。

PCR能快速特異擴增任何已知目的基因或DNA片段，并能輕易在50～100μL反應體積中，對皮克（pg）級含量的目的基因擴增得到微克級（μg）的特異性DNA片段。因此，PCR技術一經問世就被迅速而廣泛地用于分子生物學的各個領域。它不僅可以用于基因的分離、克隆和核苷酸序列分析，還可以用于突變體和重組體的構建，基因表達調控的研究，基因多態(tài)性的分析，遺傳病和傳染病的診斷，腫瘤機制的探索，法醫(yī)鑒定等諸多方面。三、

主要設備、實驗材料和試劑（Equipments,MaterialsandAgents）1．主要設備(Equipments)（1）PCR儀（2）臺式高速離心機（16000r/min）（3）微量加樣器10μL、100μL、1000μL各一支（4）電泳儀、電泳槽2．材料(Materials)（1）薄壁反應管0.2mL×20（2）塑料離心管架×1（4）常用玻璃儀器及滴管等3．試劑(Agents)（1）DNA模版

（2）對應目的基因的特異引物（3）2mMdNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

（4）10×PCRBuffer

（5）TaqDNA聚合酶

（6）DNA染色試劑SybrGreen四、操作步驟(Methods)1．在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。

10×PCRbuffer

5μl

dNTPmix（2mM）

4μl

引物1（10pmol）

2μl

引物2（10pmol）

2μl

Taq聚合酶（2U/μl）

1μl

DNA模板（1ng/μl）

1μl

加ddH2O至

50μl，稍加離心混勻。視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．設定反應程序，將上述混合液置PCR儀中進行擴增。擴增條件為93℃預變性2min，進入循環(huán)擴增階段：93℃30s→58℃30s→72℃30s，循環(huán)20－25次，最后在72℃保溫5min。

3．結束反應，PCR產物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。

4．PCR的電泳檢測：取10μl擴增產物，加1μlDNA染色試劑SyberGreen，電泳檢測。五、結果觀察(Observationofresults)在波長為254nm的紫外燈下，觀察染色后的電泳膠板。DNA存在處顯示出綠色的熒光條帶。六、注意事項(Cautions)１．PCR反應應該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進行。2．所有試劑都應該沒有核酸和核酸酶的污染，作過程中均應戴手套。

3．PCR試劑配制應使用最高質量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

4．試劑都應該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。

5．試劑或樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓滅菌。

6．PCR的樣品應在冰浴上化開，并且要充分混勻。七、思考題(Questions)1、PCR擴增與細胞內DNA半保留復制有何異同？生物化學與分子生物學實習指導（中文版）生物化學與分子生物學實習指導實驗一蛋白質含量測定(比色分析法和分光光度法)實驗二從小鼠肝臟中提取DNA實驗三DNA酶解及DNA片段瓊脂糖凝膠電泳實驗四現(xiàn)代PCR技術實驗五人血清抗胰蛋白酶（α1－AT）的分離及鑒定內容一鹽析法，凝膠過濾法內容二纖維素離子交換層析，蛋白含量測定，酶活性測定內容三SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳內容四總結實驗六酶的特異性、激動劑、抑制劑實驗七溫度、pH對酶促反應速度的影響實驗八運動對尿中乳酸含量的影響實驗九肝糖原實驗實驗十肝脂質的提取及薄層層析實驗一蛋白質含量測定(比色分析法和分光光度法)【目的要求】1.掌握比色分析法和分光光度法基本原理、標準曲線的制作及使用，標準管法結果計算2.熟悉蛋白質含量測定常用方法、原理及應用3.了解常用可見光、紫外分光光度計的測定原理及使用【教學內容】1.酚試劑法蛋白質含量測定Lambert-Beer定律，比色分析法和分光光度法基本原理,722型分光光度計使用，常用蛋白質含量測定方法及應用，酚試劑法測定蛋白質含量原理、操作,標準曲線的制備及使用2.雙縮脲法蛋白質含量測定自學和獨立完成實驗并與酚試劑法比較，結果計算3.紫外分光光度法蛋白質含量測定紫外分光光度法測定蛋白質含量原理，方法，優(yōu)缺點，注意事項；國產752型紫外分光光度計使用，UV—260分光光度計使用，注意事項，波長掃描，標準曲線制作【實驗原理】一、比色分析法許多物質本身具有一定的顏色，也有許多物質本身無顏色，在加入適當?shù)娘@色劑后生成有色物質。溶液濃度越大，顏色越深。因此可以利用比較溶液顏色深淺的方法來測定有色溶液的濃度。這種方法叫比色分析法。1.物質的顏色和波長：可見光：波長（λ）400—760nm紫外光：λ小于400nm紅外光：λ大于760nm光的互補：將兩種適當顏色的可見光按一定強度比例混合可得到白光，這兩種光叫互補光，該現(xiàn)象叫光的互補。單色光：白光通過棱鏡后可分解成各種波長不同的色光，把具有一種波長，不能再分解的光叫單色光。2.溶液的顏色和光吸收的關系：溶液的顏色，是由于不同的有色物質有選擇地吸收某種顏色的光而引起的。溶液呈現(xiàn)的顏色是與它主要吸收的光相互補的光的顏色。溶液吸收的光越多，呈現(xiàn)的顏色越深。例如：一束白光通過核黃素溶液，溶液呈黃色，是因為藍色光被吸收，而其它顏色的光均為兩兩互補，透過光只多余出黃色光，所以核黃素溶液呈黃色。光吸收曲線：測定同一物質對不同波長光線的吸收程度，以波長為橫坐標，光密度為縱坐標作圖，所得曲線為光吸收曲線。3.物質濃度，液層厚度與光吸收的關系（Lambert--Beer定律）：當一束單色光通過溶液后，光被溶液吸收的程度（D）與溶液的濃度（C），液層的厚（L）以及入射光的強度（I0）有關。溶液濃度越大，液層越厚，吸光越多，這就是物質（均勻透明固體，液體，氣體）對光的吸收定律。lgI0/I意義：當I=I0時，lgI0/I=0，表示溶液完全不吸收光線；當I＜I0時，lgI0/I值較大，表示溶液對光吸收較多；當I→0時，lgI0/I值無窮大，表示光線幾乎被溶液完全吸收（溶液不透光）。由此可見，lgI0/I表示了溶液對光的吸收程度。表示方法：光密度OD或D（opticaldensity）吸光度A（Absorbance）消光度E（Extinction）于是，(3)式可寫成：D=KCL公式中K為消光系數(shù)，K=D/CL，表示有色溶液在單位濃度和單位厚度時的吸光度。同一溶質，K值相同。百分消光系數(shù)：C=1%，L=1cm克分子消光系數(shù)：C=1克分子濃度，L=1cmD=KCL意義：物質對光吸收程度與該物質的消光系數(shù)K，溶液濃度C，液層厚度L成正比。4.待測溶液濃度的計算：（1）標準管法：在同樣條件下，測得標準液和待測液的光密度（D）值，然后計算：標準液：Ds=KsCsLs待測液：Du=KuCuLu其中，Ls=Lu，Ks=Lu，Ds/Du=Cs/CuCu=（Du/Ds）×Cs（2）標準曲線法：分析大批待測樣品時，采用此法較方便。先配制一系列濃度由小到大的標準溶液，測出它們的光密度（D）值。在一定濃度范圍內，溶液濃度（C）與其光密度（D）之間呈直線關系。以各管D為縱坐標，C為橫坐標，繪制標準曲線。待測溶液D值測出后，在曲線上查出C。（3）標準系數(shù)法：多次測定標準溶液的光密度后求出平均值，標準系數(shù)=標準液濃度/標準液平均光密度，同法測出待測液的光密度代入下式：C=待測溶液光密度×標準系數(shù)（4）消光系數(shù)法：1%濃度，1cm厚度溶液中測得：K=E1cm1%或１克分子濃度，１cm厚度溶液中測得：K=ξC=D/E1cm%,或C=D/ξ常用于紫外吸收法測定蛋白質，核酸含量，二者分別在280nm和260nm處有最大吸收，其消光系數(shù)可查到，在同樣條件下，測定待測溶液的光密度,帶入上式即可求得C。優(yōu)點：可直接測定，不需呈色，不損失樣品,操作簡便注意：選擇1cm石英比色杯（玻璃杯在紫外光區(qū)強烈吸收紫外光，不能使用）二、比色分析的測定方法1.比色分析法：原理：白光透過濾光板后，可得到近似的單色光，讓單色光透過有色溶液，然后射到光電池上，光電池受光放出電子，所產生的電流與光的強度成正比關系。利用濾光板可獲得近似的單色光，波長范圍30-50nm。濾光板最易透過的光是有色溶液最易吸收的光。一般說來，選擇濾光板的顏色應與被測溶液的顏色為互補色。2.分光光度法：分光光度法使用分光光度計，利用棱鏡或光柵獲得單色光，波長范圍3-5nm，所以比比色分析法的靈敏度，準確度和選擇性都要高。三、比色分析條件的選擇1.波長的選擇：原則“吸收最大，干擾最小”例：A，B兩種物質，A物質最大吸收峰在a處，B物質在a處也有吸收，對A物質的測定有干擾，故選b處波長進行比色測定以滿足以上原則。2.光密度的選擇：D值讀數(shù)在檢流計標尺中部時，準確度較高，相對誤差最小。一般D=0.05—13.顯色條件的選擇：比色分析中，常需要利用空白溶液調節(jié)儀器的透光率為100%，此時D為0?？瞻兹芤簝H僅不含被測物質，而其它溶液，試劑和處理條件與被測溶液完全相同。因此，利用空白溶液可消除顯色溶液中其它有色物質的干擾，抵消比色杯和試劑對入射光的影響。四、722型分光光度計的使用1.選擇波長2．比色杯：（1）液體3/4—2/3，不可過多或過少。（2）用擦鏡紙擦干外表面液體。3.靈敏度：調整后不再動。4.將裝有空白溶液的比色杯放入光路。原則：開蓋調“D=0”，關蓋調“T=100”。五、752型紫外可見分光光度計的使用1.選擇波長2．比色杯：測蛋白、核酸時使用石英比色杯，專機專用，余同上。3.靈敏度：調整后不再動。4.注意：測蛋白、核酸時，開氘燈。六、蛋白質的測定常用方法：1.根據(jù)蛋白質含氮量進行測定的定氮法。2.根據(jù)蛋白質結構或組成的紫外吸收特性進行測定的紫外分光光度法。3.根據(jù)蛋白質與不同呈色試劑反應而進行測定的比色法?！緦嶒瀮热荨恳?、酚試劑法（FolinMethod）原理：蛋白質中肽鍵在堿性溶液中與銅離子形成絡合物，此絡合物能使酚試劑中的磷鉬酸還原產生蘭色化合物；同時，蛋白質中的酪氨酸、色氨酸也能與酚試劑的磷鉬酸，磷鎢酸作用產生蘭色化合物，顏色深淺與蛋白質的含量成正比。試劑：1.堿性銅液2.酚試劑3.0.9%NaCl4.標準牛血清白蛋白溶液（1％）操作步驟：1．取上述牛血清白蛋白溶液1.0ml用0.9%NaCl稀釋10倍后，按下表操作：溫放置20分鐘，每管加酚試劑0.5毫升，立即混勻3．室溫放置30分鐘后，以第6管為空白管，選波長650nm比色，讀取光密度。二、雙縮脲法（BiuretMethod）原理：凡具有兩個以上肽鍵（—CO-NH—）的物質，在堿性溶液中與銅離子反應，形成紫紅色絡合物，稱雙縮脲反應。由于蛋白質含有肽鍵，也能發(fā)生雙縮脲反應，顏色深淺與蛋白質濃度成正比。試劑：1.雙縮脲試劑2.0.9%NaCl3．標準血清4．待測血清步驟：1．取3支干凈的試管按下表操作：2．混勻，30分鐘后以第3管為空白管，用520nm波長比色，讀取光密度。3．計算：蛋白質含量g%=（Du/Ds）×標準蛋白濃度【注意事項】1．試管洗刷干凈，刻度吸管專管專用2．雙縮脲法和酚試劑法兩個實驗的波長分別為520nm和650nm，測定時注意轉換波長3．比色測定時，勿觸及比色杯光面實驗二從小鼠肝臟中提取DNA【目的要求】1.掌握DNA分離的原理、各試劑作用及操作過程2.掌握肝勻漿制備及注意事項3.熟悉DNA濃度、純度測定原理及方法,儀器使用4.了解分子生物學實驗技術(錄像)【教學內容】1.從肝中提取DNA小鼠處死方法,試劑配制,離心機使用,肝勻漿制備,DNA分離純化原理及注意事項2.DNA濃度、純度測定原理及方法,儀器使用3.(錄像帶教學)核酸分離純化,DNA序列測定,核酸探針標記與分子雜交【實驗原理】1．生物組織中DNA是以DNA-蛋白質復合物的形式存在2．在稀NaCl溶液中，DNA-蛋白質溶解度小，RNA-蛋白質溶解度大;在濃NaCl溶液中，DNA-蛋白質溶解度大，RNA-蛋白質溶解度?。ǚ珠_DNA和RNA）3．SDS（十二烷基硫酸鈉），使蛋白質變性（分開DNA和蛋白質）（1）SDS是一種陰離子表面活性劑，能使蛋白質的氫鍵和疏水鍵打開，并結合到蛋白質的疏水部位;（2）SDS可引起蛋白質構象改變（3）SDS是一種良好的解離劑，可使蛋白質溶解，變性（4）形成SDS-蛋白質復合物，并使復合物帶負電4．氯仿-異丙醇可以將蛋白質除去5．適量的冷無水乙醇可使DNA析出。6．防止DNA酶解的辦法——加入EDTA-2Na（乙二胺四乙酸二鈉）7．檢查DNA純度：A260/A280（1）A260/A280＝1.8，高純度DNA（2）A260/A280<1.8，含蛋白質（3）A260/A280>1.8，含RNA【試劑】(1)0.14MNaCl，0.1MEDTA(2)5MNaCl(3)30%SDS(4)氯仿-異丙醇(5)0.015MNaCl-0.0015M檸檬酸鈉(6)冷無水乙醇【步驟】一．提取脫氧核糖核蛋白1.殺鼠取肝3克（2—3只小鼠），15ml0.14MNaCl，0.1MEDTA洗去血液2.肝勻漿制備（1）乳缽中剪碎（2）15ml0.14MNaCl，0.1MEDTA（3）不要用力研磨3.離心3000rpm10分鐘，棄上清沉淀加入0.14MNaCl，0.1MEDTA15ml輕輕懸起離心3000rpm10分鐘，棄上清沉淀加入0.14MNaCl，0.1MEDTA10ml使之溶解，轉至50毫升三角燒瓶中二．除蛋白質1.加入30%SDS1ml混勻，60℃水浴輕搖15分鐘，取出冷至室溫2.5MNaCl2.75ml,輕搖10分鐘3.氯仿-異丙醇19ml（沉淀蛋白）,輕搖20分鐘,離心2500rpm10分三．粗提DNA1.吸上清（水相）轉入玻璃離心管（含DNA）,棄沉淀（剩余物）2.加入1.5倍體積冰乙醇（無水乙醇）輕搖至DNA析出四．檢測1．用鑷子或玻璃棒取出置試管中，加入0.015MNaCl-0.0015M檸檬酸鈉1毫升2．稀釋適當倍數(shù)：量取10-50μl(用0.1ml刻度吸管吸取)原液，用0.015MNaCl-0.0015M檸檬酸鈉稀釋到5ml（稀釋100-500倍）3．測A260/A280（用0.015MNaCl-0.0015M檸檬酸鈉做空白溶液）五．計算1.DNA濃度：（μg/ml）=A260×50×稀釋倍數(shù)2.DNA純度：A260/A280【注意事項】1.研磨時上下用力，盡量避免DNA鏈斷裂。2．加入氯仿—異丙醇后勿劇烈搖動，以免大分子斷裂。3．有機溶劑對人體有害，操作時要注意。實驗三DNA酶解及DNA片段瓊脂糖凝膠電泳【目的要求】1.掌握限制性核酸內切酶概念、特點及作用原理，DNA酶解技術的應用2.掌握瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段原理及其操作3.熟悉電泳基本原理及其影響因素【教學內容】1．限制性核酸內切酶概念、特點及作用原理，DNA酶解技術的應用2．DNA片段瓊脂糖凝膠電泳3．電泳概念、分類、應用、基本原理及其影響因素,瓊脂糖凝膠制備、加樣、電泳及結果分析【實驗】一．DNA酶解原理：1.限制性核酸內切酶：是一類能識別并水解雙鏈DNA中特定堿基順序的核酸水解酶。一般能識別4-6個堿基對，并在特定位點切割。如：HindⅢA↓AGCTTEcoRⅠG↓AATTCHpuⅡC↓CGG2.酶單位數(shù)：在最適溫度、PH條件下，1小時完全水解1μgλDNA所需的酶量為1個單位。試劑：(1)λDNA（0.38μg/μl）(2)HindⅢ(16u/μl)(3)酶解Buffer(Tris-HCl,NaCl,MgCl2,DTT)(4)反應終止液（溴酚藍1%，SDS1%，EDTA2%，甘油50%）方法：1.取兩只EP管（1）λDNA10μl，雙蒸水10μl（2）λDNA10μl，HindⅢ10μl充分混勻2.37℃水浴2小時。3.保溫結束后加入終止液5μl。二.瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段（水平潛水式）原理：1．DNA含有PO43-基團，在pH7.5Buffer中帶負電,在電場中向正極移動。由于不同大小的DNA片段的電荷密度大致相同，自由電泳時，各核酸分子的遷移率區(qū)別很小，難以分開2．選用適當濃度的凝膠作為支持物，使之具備一定的孔徑，即可發(fā)揮分子篩效應（凝膠孔徑對大小不同的分子有不同的阻力），使大小不同的核酸片段遷移率出現(xiàn)較大差異，達到分離的目的，同樣條件對Maker電泳，對比觀察DNA酶解效果3．DNA經溴乙錠（EB）染色，溴乙錠可以插入DNA雙螺旋結構兩個堿基之間，與核酸形成絡合物，在紫外（300nm,360nm）激發(fā)下，產生桔黃色熒光（590nm可見光）。標準Maker經溴乙錠（EB）染色可以觀察到6條帶，分別為:23Kb,9.9Kb,4.4Kb,4.3Kb,2.2Kb,2.0Kb試劑：（1）1%瓊脂糖（2）TAE液（3）Marker（4）EB方法：1.電泳儀接線：黑（負）—黑，紅（正）—紅2．凝膠槽準備：用膠布固定膠槽兩側，調整梳子高度距離槽底2-3毫米，調好水平。3．灌膠：(1)稱取0.8克瓊脂糖,加入80毫升TAE中,熱浴溶解至透明(2)60℃左右加入EB100μl(終濃度0.5μg/ml),倒入備好的凝膠槽中。應注意膠面平整,無氣泡(3)冷卻后,拔去梳子4．加樣:(1)去掉膠布，將灌好的膠板平放在電泳槽中(2)加入電極Buffer使之高出膠面(1-3毫米)(3)用進樣器吸樣品20μl加入樣品槽中5．電泳:v=100V,1-1.5小時,至溴酚藍移出2/36．觀察:(戴手套)紫外燈下（254-365nm）,暗處觀察,記錄?？梢奃NA橙紅色區(qū)帶【注意事項】1．在EP管加入試劑時要用漩渦混合器混合后離心。2．瓊脂糖凝膠電泳時加樣側應位于負極端。3．溴乙錠可引起基因突變，操作時要注意個人防護。4．紫外光對人眼有害，觀察時加蓋玻璃罩，觀察時間不宜太長。實驗四PCR技術【目的要求】1．掌握PCR技術概念、原理、方法及應用2．熟悉PCR儀的使用及注意事項3．了解TaqDNA聚合酶的來源和特點，引物的設計原則4．了解現(xiàn)代PCR技術的擴展【教學內容】1．PCR技術概念、原理、方法、應用及技術擴展2．TaqDNA聚合酶的來源和特點，引物的設計原則3．PCR儀的使用及注意事項4．模板的制備【實驗】原理：以擬擴增的DNA分子為模板，以一對分別與模板5’末端和3’末端相互補的寡核苷酸片斷為引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復制機制沿著模板鏈延伸至完成新的DNA合成，重復這一過程，即可使目的DNA片斷得到擴增。PCR技術實際上是在摸板DNA，引物和4種脫氧核苷酸存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的酶促反應。試劑：1.TaqDNA聚合酶2.dNTP3.引物4.模板5.緩沖液(50mmol/L,10mmol/L,Tris-HCl,1.5mmol/LMgCl2)步驟：1．將PCR反應組分放在冰上解凍，并進行短時間離心以使組分沉降管底2．根據(jù)下列順序在PCR反應管中加入各反應組分：3．將反應組分混勻后，加入50μl石蠟油，離心數(shù)秒4．根據(jù)下列參數(shù)進行PCR擴增：5.將10μlPCR擴增產物（含1×上樣緩沖液）點樣于1.5-2.0％瓊脂糖凝膠中，電泳后在紫外燈下觀察DNA擴增產物?！綪CR技術的應用】1.在法醫(yī)學上的應用：一根毛發(fā),一滴血,少量精液,牙齒,口腔上皮細胞可進行DNA鑒定2.遺傳疾病的診斷和治療：可在懷孕早期獲得少量樣品(羊水,絨毛)進行擴增,發(fā)現(xiàn)異常的胎兒早期終止妊娠3.在艾滋病檢測中的應用:對于大多數(shù)AIDS患者，通過血清學方法檢測其血清中HIV-1抗體可特異敏感地加以篩查和診斷，但對于疑似HIV-1感染的病例，早期機體內尚無HIV-1抗體產生，或攜帶病毒的母親生產的嬰兒是否已感染HIV-1（垂直傳播，新生兒體內尚無抗體產生），直接檢測病毒則十分必要4.檢測癌基因:可選擇性地擴增ras基因百萬倍，靈敏度為5-10%，即100個細胞含有5-10個具有ras基因點突變的細胞即可檢測出來5.DNA克隆:只要知道目的基因的兩側序列，通過一對和模板DNA互補的引物，就可以十分有效地擴增出所需要的片段6.DNA序列的測定和基因定量7.考古學的應用【PCR技術的擴展】1.RT-PCR2.不對稱PCR3.巢式PCR4.原位PCR5.反向PCR6.重組PCR【注意事項】1.加各試劑時，要注意準確操作2.PCR儀運行時勿隨意改動3.溴乙錠可引起基因突變，操作時要注意個人防護4.紫外光對人眼有害，觀察結果時加蓋玻璃罩，觀察時間不宜太長實驗五人血清抗胰蛋白酶（α1－AT）的分離及鑒定【目的要求】1.掌握α1-AT分離純化各步驟原理、操作及鑒定方法2.掌握基本技術操作及儀器使用3.熟悉人血清蛋白質的分類方法,α1-AT性質4.了解生物大分子制備技術,分離純化類型5.學會利用學過的分離純化方法進行基本的科研設計6．練習研究論文基本寫作【教學內容一】分段鹽析法，凝膠過濾法（鹽析法概念及原理，分段鹽析概念，分子篩效應，柱層析基本技術）【實驗原理】1.鹽析法是一種利用蛋白質在高鹽溶液中溶解度不同而分離的方法。通過將硫酸銨加入蛋白質溶液中，使蛋白質表面電荷被中和，水化膜被破壞，導致蛋白質在水溶液中的穩(wěn)定性因素去除而沉淀。2.通過分段改變鹽類濃度達到分離目的的方法叫分段鹽析法。3.凝膠過濾又稱分子篩層析?；旌衔镫S流動相流經裝有凝膠作為固定相的層析柱時，分子量大的物質因不能進入凝膠網(wǎng)孔而沿凝膠顆粒間的空隙先被洗脫(阻力小,流程短,流速大),分子量小的物質因能進入凝膠網(wǎng)孔而受阻滯,流速緩慢,流程長而后被洗脫,由于流速不同可以把大小不同的分子分開.【儀器與試劑】1．離心機2．真空泵3．飽和硫酸銨溶液：稱取767g固體硫酸銨，加入1000ml水中，加熱使之溶解，室溫冷卻后4℃靜置過夜，然后用氨水將pH調至中性。4．固體（NH4）2SO45．SephadexG—256．奈氏試劑7.雙縮脲試劑8．pH7.4,0.05MPBS【步驟】一分段鹽析1．觀看人血清抗胰蛋白酶（α1－AT）的分離及鑒定教學錄像2．每組量取20ml血清，倒入一干凈燒杯中，緩慢加入飽和硫酸銨20ml，邊加邊攪拌,放入4℃冰箱30分鐘3．從冰箱中取出燒杯，將血清倒入離心管，3000rpm，離心20分鐘4．將上清倒入一干凈量筒中，記錄體積后，倒入干凈燒杯中，按17.6g/100ml量取固體硫酸銨，緩慢加入上清中，邊加邊攪拌。4℃冰箱放置30分鐘5．將燒杯中液體倒入抽濾器中，負壓抽濾6．刮下濾紙上的粗提蛋白，用4ml緩沖液溶解，準備加樣二凝膠過濾層析1．凝膠柱準備：（1）連接層析柱（2）夾住出口，加入1/3體積的0.05MpH6.4PBS，灌膠，待凝膠自然沉降約1cm時，打開出口，控制流速，60滴/分（3）層析柱填裝完成后，連接下口瓶，調節(jié)流速，使入口和出口流速相同。平衡至入口pH值與出口pH值相同（即pH試紙呈色相同），關閉出口，等待加樣2．加樣：用吸管吸去膠面以上的緩沖液，立即加入蛋白粗提液（沿管壁緩慢加入）3．打開出口，調流速15滴/分，待蛋白粗提液完全進入膠面，用少量緩沖液清洗管壁。連接下口瓶4．檢測：用雙縮脲試劑檢測洗脫液。待試劑變紅，開始收集，直到試劑不變色停止收集。測量并記錄收集液的體積，留取1ml樣品（標記為G—25樣品），放入一冷凍管中冰箱凍存；剩余的液體收集入一大試管中，作好標記，下次實驗用5．洗去銨鹽：全速洗脫，用奈氏試劑檢測洗脫液，直到橙色消失為止，回收凝膠【注意事項】1．鹽析所用器皿一定要干燥2．鹽析時，應將飽和硫酸銨或固體硫酸銨加入到血清中，且邊加邊攪拌3．層析柱上方要留有少量液體，避免使凝膠暴露于空氣中4．凝膠過濾上樣時，使樣品沿管壁緩緩流下，勿沖破膠面【教學內容二】DEAE-纖維素離子交換層析(離子交換層析概念,交換劑的組成，分類,交換劑的選擇，離子交換層析基本原理,分離α1-AT原理及操作過程,注意事項,洗脫方式及意義)。酶活性測定，蛋白質定量【原理】1.DEAE-cellulose離子交換層析：DEAE-cellulose是應用最廣的陰離子交換劑，本身帶有正電荷，能不同程度的吸附溶液中的陰離子。層析時使用不同離子強度或不同pH值的緩沖溶液進行分段洗脫，含負電荷少的離子首先被洗脫下來，含負電荷多的蛋白質后被洗脫下來，于是不同蛋白質被分開。2.α1－AT活力測定：α1－AT的活力是通過檢測它對胰蛋白酶的抑制力而測定的。胰蛋白酶可以水解低分子底物—苯甲酰精氨酰對硝基苯胺，產生黃色產物對硝基苯胺，顏色深淺與胰蛋白酶活力成正比。將各步純化的α1-AT樣品與一定量的胰蛋白酶溶液反應，檢測胰蛋白酶剩余活力，該剩余活力與α1-AT活力成負相關?！緝x器】1．722分光光度計2．恒溫水浴【試劑】1．DEAE-纖維素2．樣品：由G-25除鹽的α1-AT粗提液3．0.05mol/LpH6.4磷酸緩沖液；0.12mol/LpH6.4磷酸緩沖液4．0.5mol/LNaCl5．0.5mol/LHCl6．胰蛋白酶液：取3mg胰蛋白酶溶解于16.6mlpH3水中，濃度為180μg/ml7．0.05mol/LpH8.2Tris-HCl緩沖液，內含0.02mol/LCaCl28．苯甲酰－精氨酰－對硝基苯胺（簡稱BAPNA）,取18mgBAPNA溶解于10ml甲醇中,加Tris-HCl緩沖液到50ml9．33%乙酸【步驟】一DEAE-cellulose離子交換層析1.觀看教學錄像2.取出上次課的粗提樣品，