生物色譜技術(shù)

生物色譜技術(shù)因?yàn)橛型瑢W(xué)沒有學(xué)習(xí)過色譜，我們大概介紹一下色譜技術(shù)的起源。色譜技術(shù)最初就是俄國(guó)的植物學(xué)家茨維特發(fā)明的。1906年，茨維特在研究植物色素的過程中，做了一個(gè)經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)：在一根玻璃管的狹小一端塞上一小團(tuán)棉花，在管中填充沉淀碳酸鈣，這就形成了一個(gè)吸附柱。然后將其與吸濾瓶連接，使綠色植物葉子的石油醚抽取液自柱中通過。結(jié)果植物葉子中的幾種色素便在玻璃柱上展開：留在最上面的是兩種葉綠素；綠色層下面接著葉黃素；隨著溶劑跑到吸附層最下層的是黃色的胡蘿卜素。這樣吸附柱成了一個(gè)有規(guī)則的與光譜相似的色層。然后把該潮濕的吸附柱從玻璃管中推出，依色層的位置用小刀切開，于是各種色素就得以分離。再用醇為溶劑將色素溶解出來，即得到了各成分的純?nèi)芤?，由此?shí)現(xiàn)了色素的分離和制備。1903年，他將這一研究成果發(fā)表在華沙的《生物學(xué)雜志》上，這就是有關(guān)色譜法的第一篇研究論文。但當(dāng)時(shí)他用俄文寫的報(bào)告未能引起人們的興趣，一直到他死后威爾施塔特重新介紹了這種方法時(shí)，他的工作才受到了人們的注意。色譜法31903–MikhailTswettdefinestheScienceofChromatography

ChromatographyInventorM.S.Tswett(茨維特)生物色譜法生物色譜法（Biochromatography）是20世紀(jì)80年代中后期問世，由生命科學(xué)與色譜分離技術(shù)交叉形成的一種極具發(fā)展?jié)摿Φ男屡d色譜技術(shù)。細(xì)胞膜色譜法親和色譜法常規(guī)色譜法固定相含有生物大分子固定相和研究對(duì)象都是生物大分子研究對(duì)象是生物大分子4細(xì)胞膜色譜CellMembraneChromatography,CMC將細(xì)胞膜結(jié)合到硅膠表面，制成細(xì)胞膜固定相，利用色譜學(xué)技術(shù)研究流動(dòng)相中藥物與受體相互作用規(guī)律的受體動(dòng)力學(xué)新方法。特點(diǎn)：分離+活性篩選合二為一適合于天然藥物活性成分的篩選及藥物作用機(jī)理的研究。5舉例α1A腎上腺素受體高表達(dá)細(xì)胞膜色譜

a：酚妥拉明b：5-羥色胺c：甲氧明d：羥甲唑啉6abcd親和色譜AffinityChromatography，AC

利用生物大分子具有對(duì)某一類生物大分子特異性識(shí)別和可逆結(jié)合的特性而建立起來的一種分離方法，也叫做生物親和或生物特異性親和色譜。親和識(shí)別：

抗體-抗原

酶-底物

激素-受體載體配體7IgG蛋白8親和色譜分離原理2.配體與目標(biāo)物吸附；3.洗脫目標(biāo)物；1.找與底物專一可逆結(jié)合的配體,將配體通過共價(jià)鍵偶聯(lián)到載體。94.親和柱再平衡。親和體系特異性親和體系高特異性抗原－抗體荷爾蒙－受體蛋白核酸－互補(bǔ)堿基鏈段、核酸結(jié)合蛋白酶－底物、產(chǎn)物、抑制劑群特異性免疫球蛋白－A蛋白、G蛋白酶－輔酶凝集素－糖、糖蛋白、細(xì)胞、細(xì)胞表面受體酶、蛋白質(zhì)－肝素酶、蛋白質(zhì)－活性色素（染料）酶、蛋白質(zhì)－過渡金屬離子（銅、鋅等）酶、蛋白質(zhì)－氨基酸（組氨酸等）10核酸結(jié)合蛋白11A蛋白12從A型金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)分離而得的一種細(xì)胞壁蛋白?？膳c人類大多數(shù)類型的IgG(IgG3除外)的Fc段結(jié)合，但很少或幾乎不與人類的IgM結(jié)合。用于免疫分析和IgG的提純。葡萄球菌A蛋白(StaphylococcalproteinA,SPA)免疫球蛋白

A（immunoglobulinA，IgA）已有研究證明，呼吸道分泌液中SigA含量的高低直接影響呼吸道粘膜對(duì)病原體的抵抗力，兩者呈正相關(guān)。1.與病毒或細(xì)菌毒素結(jié)合，從而阻止它們進(jìn)入或破壞細(xì)胞；2.附著在細(xì)菌的鞭毛上，讓其活動(dòng)性減弱，并且更容易被巨噬細(xì)

胞吞噬.親和色譜純化抗體原理13親和色譜分離示意圖14親和色譜的固定相無機(jī)氧化物：SiO2、Al2O3、ZrO3生物聚合物：纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖、葡聚糖等。

配體載體間隔臂固定相1.載體（support，又稱基體matrix）①親水但不溶于水，可溶脹；②大孔且有一定的機(jī)械強(qiáng)度；③化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定且易于改性；④表面積很大但呈現(xiàn)惰性；特性15專一性和特異性決定著分離純化的產(chǎn)品純度相互作用的強(qiáng)弱決定著吸附和解吸的難易程度特異性配體生物素－親和素、抗原－抗體、酶－抑制劑、激素－受體通用性配體凝集素－各種糖蛋白，核酸－RNA、RNA－蛋白質(zhì)2.配位體（ligand，又稱底物substrate）親和色譜的固定相16親和色譜的固定相①脂肪族有機(jī)物或多肽、蛋白組成；②具有雙官能團(tuán)，一端連接載體，一端偶聯(lián)配體；③長(zhǎng)度直接影響固定相的立體效應(yīng)；④可在對(duì)載體進(jìn)行化學(xué)改性的時(shí)候形成；⑤可具有疏水性或親水性。3.間隔臂（spacer或spacerarms）小分子物質(zhì)作為配基，載體和配基間插入一個(gè)“手臂”以消除空間障礙。17親和色譜的洗脫方式18階梯式梯度線性梯度影響洗脫過程的因素1.離子強(qiáng)度：提高離子強(qiáng)度，親和作用減弱或完全破壞。2.pH值：在適當(dāng)?shù)膒H下，親和結(jié)合作用較高，在其它pH下，

親和作用減弱或完全破壞。3.離液劑：脲和鹽酸胍的存在可減弱親和作用。4.溫度：提高溫度，靜電作用、氫鍵、配位鍵減弱；

疏水性相互作用增強(qiáng)。5.液體離子：SCN-、I-、CIO4-的存在，疏水性相互作用減弱。6.螯合劑：影響配位鍵，使親和作用消失19中壓液相色譜儀北京東西分析儀器有限公司LC-5600系列常（中）壓生化制備液相色譜儀20GE公司舉例21常規(guī)色譜親和柱22反相色譜法水+乙腈23反相色譜分離多肽24反相色譜分離多肽重現(xiàn)性重現(xiàn)性好！25反相色譜分離蛋白26體積排阻色譜分子量大的先被洗脫出來，分子量小的后被洗脫出來。原理：是按分子大小順序進(jìn)行分離的一種色譜方法，體積大的分子不能滲透到凝膠孔穴中去而被排阻，較早的淋洗出來；中等體積的分子部分滲透；小分子可完全滲透入內(nèi)，最后洗出色譜柱。2728體積排阻色譜離子交換色譜原理：利用被分離組分與固定相之間發(fā)生離子交換能力的差

異來實(shí)現(xiàn)分離。29陽離子交換樹脂

大都含有磺酸基(-SO3H)、羧基(-COOH)或苯酚基(-C6H4OH)等酸性基團(tuán)，其中的氫離子能與溶液中的金屬離子或其他陽離子進(jìn)行交換。2R-SO3H+Ca2+----(R-SO3)2Ca+2H+硬水軟化原理離子交換色譜30陰離子交換樹脂大都含有季胺基[-N(CH3)3OH]、胺基(-NH2)或亞胺基(-NH2)等堿性基團(tuán)。它們?cè)谒心苌蒓H-離子，可