(整理)生化實(shí)驗(yàn)講義：實(shí)驗(yàn)十一親和層析最后

實(shí)驗(yàn)十一親和層析純化胰蛋白酶一、引言前面我們所學(xué)的凝膠過(guò)濾法、離子交換法以及電泳等一系列分離純化生物大分子的手段，比起早期采用的鹽析法，有機(jī)溶劑及等電點(diǎn)沉淀法等，分離效果要好得多。但是，這些方法中，或是利用生物大分子在一定條件下不同的溶解度、電荷分布、總電荷的不同，或是依據(jù)其分子的大小和形狀的不同。一句話，多是利用生物分子間物理和化學(xué)性質(zhì)的差異來(lái)進(jìn)行分離純化的。由于這些方法的特異性比較低，加之待分離物質(zhì)之間的物化性質(zhì)差異較小，常常要綜合不同的分離方法。經(jīng)過(guò)許多步驟才能使生物分子達(dá)到一定的純度。這樣既費(fèi)時(shí)間，又費(fèi)試劑，有時(shí)最后產(chǎn)品還不能令人滿意。另外，有些生物大分子，往往在生物組織或發(fā)酵液中的含量很低，相對(duì)地說(shuō)雜質(zhì)很多，特別是一些具有生物活性的分子，往往由于分離純化的步驟很多，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，造成破壞以致失活，產(chǎn)率很低。這就促使人們?nèi)で笮碌姆椒▉?lái)解決存在的問(wèn)題。親和層析法是近十多年來(lái)迅速地發(fā)展并廣泛被采用來(lái)分離純化生物大分子的一種十分有效的方法。它具有分離快速，純化效率高。特別是對(duì)于那些含量少，雜質(zhì)多，采用常規(guī)方法難于分離的生物活性分子，顯示了獨(dú)特的優(yōu)越性。有時(shí)一次被分離物質(zhì)的純度可提高幾倍，十幾倍甚至幾百倍。因此，親和層析技術(shù)已成為純化生物分子，特別是純化生物活性物質(zhì)最重要的方法之一。二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求1.理解親和層析法的基本原理，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)?zāi)艹醪秸莆罩苽湟环N親和吸附劑的操作方法；2.理解和掌握親和層析實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)；3.學(xué)會(huì)一種測(cè)定蛋白水解酶活力及比活的方法。三、基本原理簡(jiǎn)言之，親的層析主要是根據(jù)生物分子與其特定的固相化的配基或配體之間具有一定的親和力而使生物分子得以分離。這是由一種典型的吸附層析發(fā)展而來(lái)的分離純化方法。許多生物分子都有一種獨(dú)特的生物學(xué)功能。即它們都具有能和某些相對(duì)應(yīng)的專一分子可逆地結(jié)合的特性（分子間通過(guò)某些次級(jí)鍵結(jié)合，如范德華力，疏水力，氫鍵等，在一定條件下又可解離）。如：酶和底物（包括酶的抑制劑、產(chǎn)物、輔酶及其底物的類似物）的結(jié)合。特異性的抗體一抗原（包括病毒、細(xì)胞）、激素與其受體、載體蛋白，基因與其互補(bǔ)DNA、mRNA及阻遏蛋白的結(jié)合，植物凝集素與淋巴細(xì)胞表面抗原及某些多糖的結(jié)合等。均屬于專一性而可逆的結(jié)合。這種分子之間的結(jié)合能力叫做親和力。親和層析正是利用生物分子間所具有的專一親和力而設(shè)計(jì)的層析技術(shù)。所以有人稱為“生物專一吸附技術(shù)”或“功能層析技術(shù)”。在實(shí)際工作中，只要把被識(shí)別的分子，稱為配基（Ligand），在不損害其生物學(xué)功能的條件下共價(jià)結(jié)合到水不溶性載體或基質(zhì)上（Matrix,如Sepharose4B）制成親和吸附劑，然后裝柱。再把含有要分離純化的物質(zhì)的混合液通過(guò)這個(gè)柱子，這時(shí)絕大部分對(duì)配基沒(méi)有親和力的化合物均順利地流過(guò)層析柱而不滯留，只有與配基互補(bǔ)的化合物被吸附留在柱內(nèi)。當(dāng)所有的雜質(zhì)從柱上流走后，再改變洗脫條件，使結(jié)合在配基上的物質(zhì)解離下來(lái)。這樣，原來(lái)混合液中被分離的物質(zhì)便以高度純化的形式在洗脫液中出現(xiàn)。其過(guò)程可用簡(jiǎn)圖表示如下：親和層析原理示意圖本實(shí)驗(yàn)為了純化胰蛋白酶，采用胰蛋白酶的天然抑制劑—雞卵粘蛋白作為配基制成親和吸附劑，從胰臟粗提取液中純化胰蛋白酶。雞卵粘蛋白是專一性較高的胰蛋白酶抑制劑，對(duì)牛和豬的胰蛋白酶有相當(dāng)強(qiáng)的抑制作用，但不抑制糜蛋白酶。在pH=7~8的緩沖溶液中卵粘蛋白與胰蛋白酶牢固地結(jié)合，而在pH=2~3時(shí)，又能被解離下來(lái)。因此，采用雞卵粘蛋白作成的親和吸附劑可以從胰臟粗提液中通過(guò)一次親和層析直接獲得活力大于10,000BAEE單位/毫克蛋白胰蛋白酶制品，比用經(jīng)典分離純化方法簡(jiǎn)便得多。純化效率可達(dá)到10~20倍以上。四、試劑與器材主要試劑：丙酮三氯乙酸HClNaOHNaClNaHCO3Na2CO3氯代環(huán)氧丙烷乙腈甲酸TrisCaCl2KClDEAE-纖維素Sepharose-4B.新鮮豬胰臟雞蛋清乙酸二氧六環(huán)二甲基亞砜主要貯存溶液：1.雞卵粘蛋白層析液（1升）0.02mol/LpH=7.3Tris-HClBuffer。2.DEAE-纖維素處理液：0.5mol/LHCl300ml和0.5mol/LNaOH-0.5mol/LNaCl0.3升。3.卵粘蛋白洗脫液：0.02mol/LpH=7.3Tris-HClBuffer含0.3mol/LNaCl,150ml.4.標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶溶液：結(jié)晶胰蛋白酶以0.001NHCl配制成50μg/ml。5.親和層析柱平衡液：0.1mol/LpH=8.0Tris-HClBuffer,含0.5mol/LKCl、0.05mol/LCaCl2,500ml。（配1000ml：12.1gTris，37.5gKCl，5.6gCacl2）。6.0.05mol/LpH=8.0Tris-HClBuffer含0.2%Cacl2（全斑公用，配1000ml：6.05gTris水溶后，先用4mol/LHCl調(diào)pH為8.0，然后方可加2gCacl2）。7.親和柱解吸液：0.1mol/L甲酸—0.5mol/LKClpH=2.5,500ml。（配1000ml：37.5gKCl，4.35ml甲酸）。8.Sepharose4B膠清洗液：0.5mol/LNaCl和0.1mol/LNaHCO3緩沖液，pH=9.5,各500ml.9.BAEE底物緩沖液：34mgBAEE溶于50ml0.05mol/LpH=8.0Tris-HClbuffer中，臨用前配制，冰箱內(nèi)可保存3天。主要器材：恒溫水浴，溫度計(jì)，G2玻璃漏斗，抽濾瓶，布氏漏斗，離心杯（50ml），透析袋，層析柱（2×30cm,26×30cm），秒表，移液管，貯液瓶（1升），電磁攪拌器，pH計(jì)，紫外分光光度計(jì)，紗布，勻漿器，pH試紙。五、實(shí)驗(yàn)操作步驟（一）雞卵粘蛋白的分離及純化1.雞卵粘蛋白（Ovomucoid）的一些性質(zhì):Ovomucoid是一種糖蛋白，在中性及偏酸性溶液中對(duì)熱及高濃度脲、有機(jī)溶劑，均有較高的耐受性。但在較酸、堿條件下，易引起變性。Ovomucoid帶有四種糖基，因此有較強(qiáng)的吸水性。在50%丙酮或5%三氯乙酸鹽的水溶液中，仍有較好的溶解度。所以，選擇合適的pH，丙酮濃度和三氯乙酸鹽的濃度，可以從蛋清中除去大量的非卵粘蛋白。由于Ovomucoid所帶的糖基不同，電泳行為呈現(xiàn)出不均一性，等電點(diǎn)在3.9~4.5之間并呈現(xiàn)出四條電泳條帶，但它們?cè)谏飳W(xué)功能上差異不大，在氨基酸組成上幾乎無(wú)差異，分子量約為28,000。每1摩爾的卵粘蛋白分子能抑制1摩爾的胰蛋白酶。所以每毫克高純度的卵粘蛋白能抑制約0.84毫克的胰蛋白酶。Ovomucoid在280nm處的百分消光系數(shù)A1%1cm.280=4.13.，即蛋白酶濃度為1mg/ml時(shí),溶液的吸光度A280=0.413，據(jù)此可以測(cè)定其溶液中蛋白質(zhì)的含量。2.Ovomucoid的分離及粗品制備：取2只雞蛋，得蛋清約50ml，將其溫?zé)嶂?5℃左右，加入等體積10%pH=1.0的三氯乙酸溶液（配制三氯乙酸：稱取10克三氯乙酸，用70ml蒸餾水溶解，再用5mol/LNaOH調(diào)pH=1.0左右，最后加蒸餾水至100ml。），這時(shí)出現(xiàn)大量白色沉淀，充分?jǐn)噭蚝?，測(cè)定溶液的pH值，此時(shí)溶液的pH值應(yīng)當(dāng)是3.5±0.2,若偏離此值，用5NHCl或5mol/LNaOH溶液調(diào)pH=3.5±0.2，注意在調(diào)pH值時(shí)，要嚴(yán)防局部過(guò)酸或過(guò)堿。接著25℃放置4小時(shí)或過(guò)夜。次日用4000~6000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，收集清液，再用三層紗布過(guò)濾并檢查濾液的pH值是否仍為3.5±0.2，若不是，則要調(diào)回到此范圍內(nèi)。然后將清液放冰浴冷卻至0℃，緩緩加入3倍體積預(yù)先冷卻的丙酮，用玻璃棒攪拌均勻并用塑料薄膜蓋好防止丙酮揮發(fā)，放冰箱或冰浴中3~4小時(shí)后，離心（3000轉(zhuǎn)/分，15~20分鐘）收集沉淀（清液留待回收丙酮）。將沉淀抽真空去凈丙酮，得到粗的卵粘蛋白。將其用20ml左右蒸餾水溶解。若溶解后的溶液渾濁，可用濾紙過(guò)濾或離心去掉不溶物。取上清裝透析袋，并對(duì)蒸餾水透析去除三氯乙酸（或用SephadexG-25凝膠層析柱脫鹽去除三氯乙酸）。測(cè)定其抑制胰蛋白酶的比活力。若比活力大于7000BAEE/mg，可直接用作親和配基制備親和吸附劑，否則應(yīng)進(jìn)一步純化。3.Ovomucoid的純化DEAE-纖維素的處理：稱取10克DEAE-Cellulose粉（DE-32），先用約150ml0.5mol/LNaCl?0.5mol/LNaOH溶液溶脹30分鐘，用G2漏斗抽干并用去離子水沖洗至中性，轉(zhuǎn)入燒杯中再用約150ml0.5mol/LHCl浸泡20分鐘，再在G2漏斗中用蒸餾水洗至中性，最后用約150ml0.02mol/LpH=7.3Tris-HCl緩沖液浸泡，抽真空去氣泡后裝柱（?2cm×20cm柱），并用同一緩沖液平衡一個(gè)床體積即可使用。將粗的Ovomucoid制品加入等體積的0.02mol/LpH=7.3Tris-HCl綏沖液后上柱吸附，并用同一緩沖液洗雜蛋白至A280<0.05為止。最后用含0.3mol/LNaCl的上述Tris-HCl緩沖液洗脫。收集具有胰蛋白酶抑制活性的蛋白峰。測(cè)定合并液的蛋白含量及卵粘蛋白的比活性及總活力。最后將其對(duì)蒸餾水透析（或用SephadexG-25）脫鹽，精確調(diào)溶液pH=4.0~4.5，加入3倍體積予冷的丙酮沉淀，放冰箱或冰浴3~4小時(shí)，然后離心（3000轉(zhuǎn)/分，15~20分鐘）收集沉淀（清液回收丙酮），真空下抽去丙酮即得卵粘蛋白干粉。如將透析后溶液吹風(fēng)濃縮，冰凍干燥則得海綿狀松軟白色干粉的卵粘蛋白。雞卵粘蛋白粗提物在DEAE-Cellulose柱上的層析圖平衡緩沖液：0.02mol/LpH=7.3Tris-HCl緩沖液沖洗緩沖液：同上洗脫液：0.02mol/LpH=7.3Tris-HCl緩沖液并含0.3mol/LNaCl（二）親和吸附劑的合成目前有多種方法活化載體和偶聯(lián)配基制備親和吸附劑。本實(shí)驗(yàn)采用氯代環(huán)氧丙烷活化載體與偶聯(lián)配基（在附錄中注明了溴化氰活化載體與偶聯(lián)配基的方法）。1.載體Sepharose4B的活化-氯代環(huán)氧丙烷活化.可用下面兩種溶劑。(1)二氧六環(huán)取10ml沉淀體積的Sepharose4B于G2玻璃燒結(jié)漏斗中，抽濾成半干，先用約100ml.0.5mol/LNaCl溶液淋洗，再用100~150ml蒸餾水洗滌，以除去其中的保護(hù)劑和防腐劑。抽干約得6克半干濾并，置于50ml三角瓶中，加入6.5ml2mol/LNaOH，2ml氯代環(huán)氧丙烷及15ml56%二氧六環(huán)，并置于40℃溫和攪拌2小時(shí)，然后將膠轉(zhuǎn)移到G2玻璃漏斗中以蒸餾水淋洗除去多余的試劑，最后再用約100ml0.2mol/LNa2CO3pH=9.5緩沖液洗滌。接著盡快進(jìn)行偶聯(lián)實(shí)驗(yàn)。（2）二甲基亞砜同（1）法將6克半干濾并置于50ml三角瓶中，加入6.5ml2mol/LNaOH，2ml氯代環(huán)氧丙烷及15ml56%二甲基亞砜，充分混勻，在40℃振蕩2小時(shí)，然后同（1）法洗滌凝膠后盡快進(jìn)行偶聯(lián)。2.雞卵粘蛋白與活化的載體Sepharose-4B偶聯(lián)將已活化好的Sepharose-4B轉(zhuǎn)移到三角瓶中。用10ml0.2mol/LNa2CO3,pH=9.5緩沖液將上述制備好的卵粘蛋白溶解（或0.1mol/LNaOH10ml溶解），取出0.1ml溶液稀釋20~30倍，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定卵粘蛋白的含量。剩余的溶液全部轉(zhuǎn)移到三角瓶中與活化好的Sepharose4B偶聯(lián)。在40℃恒溫?fù)u床振蕩24小時(shí)左右。偶聯(lián)終止后，將凝膠倒入G2漏斗中抽干并用100ml0.5mol/LNaCl溶液洗去未偶聯(lián)上的蛋白（收集濾液，測(cè)蛋白含量及總活力，以計(jì)算偶聯(lián)率）,再用100ml蒸餾水淋洗。接著用親和洗脫液（0.1mol/L甲酸—0.5mol/LKClpH=2.5）50ml洗一次。最后用蒸餾水洗至中性，浸泡于親和柱平衡液0.05mol/LCaCl20.1mol/LpH=8.0Tris-HCl緩沖液中，放冰箱待用。環(huán)氧氯丙烷活化載體與蛋白質(zhì)配基的偶聯(lián)反應(yīng)式如下：（三）親和層析分離純化胰蛋白酶1.粗胰蛋白酶的制備取100g新鮮冰凍豬胰臟，剝?nèi)ブ炯敖Y(jié)締組織后在勻漿機(jī)器中攪碎，加入約200ml,預(yù)冷的乙酸酸化水（pH=4.0）,8~10℃條件下,攪拌提取4~5小時(shí)，然后四層紗布擠濾（殘?jiān)儆眉s100ml乙酸酸化水?dāng)嚢杼崛?小時(shí)，四層紗布擠濾），收集合并兩次濾液，用2.5mol/LH2SO4調(diào)pH=2.5.~3.0，放置1~2小時(shí)（靜置期間要檢查一下pH值，應(yīng)始終保持pH=2.5~3.0）,最后用濾紙過(guò)濾，收集濾液待激活。2.胰蛋白酶原的激活：將濾液用5mol/LNaOH調(diào)pH=8.0，加固體CaCl2，使溶液中Ca2+的終濃度達(dá)到0.1mol/L。(注意先取2ml胰蛋白酶粗提液測(cè)定激活前的蛋白含量及酶活性。)然后加入2~5mg結(jié)晶胰蛋白酶進(jìn)行激活，于5℃冰箱放置18~20小時(shí)進(jìn)行激活（或在室溫下，20~25℃左右激活2~4小時(shí)）即可完成。激活期間，分別在16、18小時(shí)取樣測(cè)酶的活性，待酶的比活達(dá)到800~1000BAEE單位/mg時(shí)停止激活。用2.5mol/LH2SO4調(diào)至pH=2.5~3.0,濾去CaSO4沉淀物，濾液放冰箱內(nèi)備用。3.親和層析純化胰蛋白酶：（1）裝柱：取一支層析柱，先裝入1/4體積的親和柱平衡液（0.1mol/LpH=8.0,含0.05mol/LCaCl2的Tris-HCl溶液）。然后將親和吸附劑輕輕攪勻，緩緩加入柱內(nèi)，待其自然沉降，調(diào)好流速3ml/10min左右,用親和柱平衡液平衡，檢測(cè)流出液A280值小于0.02.（2）上樣：將胰蛋白酶粗提液用5mol/LNaOH調(diào)至pH=8.0,（若有沉淀，過(guò)濾去除之）。取一定體積上述澄清溶液上柱吸附。上樣體積可大致計(jì)算如下：胰蛋白酶上樣體積（ml）=式中：W：是卵粘蛋白偶聯(lián)的總mg數(shù)；0.84：是1mg卵粘蛋白能抑制約0.84mg胰蛋白酶；3×104：是純化后胰蛋白酶比活的近似值；C：是胰蛋白酶粗提液的濃度（mg/ml）；A：是胰蛋白酶粗提液的比活（BAEE/mg）；1.5：是上樣量過(guò)量50%。吸附畢，先用平衡液洗滌，至流出液A280<0.02。換洗脫液洗脫。（3）洗脫及收集胰蛋白酶：用0.1mol/L甲酸—0.5mol/LKClpH=2.5洗脫液進(jìn)行洗脫。洗脫速度約2~4ml/10min.然后收集蛋白峰并測(cè)定收集液的蛋白含量、酶的比活力及總活力。親和層析柱用平衡緩沖液平衡后可再次作親和層析。若柱內(nèi)加入防腐劑0.01%疊氮化鈉NaN3在冰箱中保存，至少一年內(nèi)活性不喪失。最后可用兩種方法將純化的胰蛋白酶制成固體保存：（1）將比活力最高部分用固體(NH4)2SO4以0.8飽和度鹽析，放置4小時(shí)以上，抽濾收集硫酸銨沉淀（要抽干）。濾并先用少量蒸餾水溶解，再加入1/4體積0.8mol/LpH=9.0的硼酸溶液，冰箱中放置,數(shù)日后即可獲得棒狀結(jié)晶。（注：只有胰蛋白酶的量較多時(shí)，才能得到結(jié)晶品）。（2）將親和層析獲得的胰蛋白酶溶液放入透析袋內(nèi)，在4℃對(duì)蒸餾水透析，然后冷凍干燥成干粉。胰蛋白酶在親和柱上的分離曲線六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果處理1.繪制親和柱層析洗脫曲線。2.計(jì)算雞卵粘蛋白的比活力。3.計(jì)算雞卵蛋白的偶聯(lián)量。4.繪制酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線（求初速度）。5.計(jì)算親和層析純化胰蛋白酶的比活力及純化效率。最后將親和層析過(guò)程中的各項(xiàng)數(shù)據(jù)詳細(xì)列入下表中。親和層析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)參數(shù)數(shù)據(jù)親和柱床體積（ml）洗脫的胰蛋白酶溶液體積(ml)洗脫的胰蛋白酶溶液吸光值A(chǔ)280洗脫的胰蛋白酶溶液蛋白濃度(mg/ml)親和柱吸附率(mg/ml凝膠)親和柱洗脫酶液活力(u/ml)親和柱洗脫酶液比活力(u/mg)上柱前樣品比活力(u/mg)親和柱純化效率（倍數(shù)）附錄一：用溴化氰活化載體及偶聯(lián)配基方法1.載體Sepharose4B的活化：取15ml沉淀體積的Sepharose4B,抽濾成半干物，用約10倍體積0.5mol/LNaCl洗，再用10~15倍蒸餾水洗去其中的保護(hù)劑和防腐劑。抽干約得8克半干濾并，放一小燒杯中，加入等體積的2mol/LpH=10.5NaHCO3緩沖溶液，外置一冰浴，在通風(fēng)廚內(nèi)于電磁攪拌器上輕輕地進(jìn)行攪拌，然后再緩慢加CNBr—乙腈溶液3ml（含CNBr1g/ml乙腈），邊測(cè)pH，通過(guò)逐滴加入2mol/LNaOH，始終維持pH在10.5左右，待CNBr—乙腈溶液加完并且pH不再明顯變化時(shí)，即可終止反應(yīng)（一般在30~35分鐘內(nèi)完成）。立即投入少許冰塊，取出并迅速轉(zhuǎn)移至G2玻璃燒結(jié)漏斗中抽濾，用大量冰水洗，最后用冷的0.1mol/LpH=9.5NaHCO3緩沖溶液洗，其用量約為凝膠體積的10~15倍。接著抽干待用。2.雞卵粘蛋白的偶聯(lián)：將30ml（約0.5g蛋白質(zhì)）對(duì)0.1mol/LpH=9.5NaHCO3透析平衡過(guò)的雞卵粘蛋白立即加入上述活化好的凝膠中，室溫緩慢攪拌反應(yīng)6小時(shí)，這一步動(dòng)作要快，從載體活化后到加入配基的時(shí)間最好不超過(guò)2分鐘，因活化好的載體極不穩(wěn)定，易變成無(wú)活性的產(chǎn)物。反應(yīng)6小時(shí)后取出抽濾，先用大量去離子水洗，然后用20ml1mol/L乙醇胺（pH=9~9.5）封閉殘存的活性基團(tuán)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2小時(shí)，抽濾。再用凝膠體積2~3倍的0.2mol/L甲酸和0.1mol/LpH=8.3Tris—HCl緩沖液交替洗滌，直到流出液中A280<0.05為止。抽干后用0.05mol/LpH=8.3Tris-HClBuffer浸泡,然后置冰箱中待用。溴化氰活化載體與蛋白質(zhì)配基偶聯(lián)反應(yīng)式如下：附錄二：酶活力的測(cè)定1.胰蛋白酶活力的測(cè)定：本實(shí)驗(yàn)以苯甲酰L—精氨酸乙酯（英文縮寫(xiě)為BAEE）為底物，用紫外吸收法進(jìn)行測(cè)定。方法如下：取2個(gè)光程為1厘米的帶蓋石英比色杯，先在一只杯中加入25℃予熱過(guò)的2.0ml緩沖液（0.05mol/LpH=8.0Tris-HClBuffer,含0.2%CaCl2）。0.2ml0.001mol/LHCl，然后再加0.8mlBAEE-0.05mol/LpH=8.0Tris-HClBuffer（含0.2%CaCl2和1mmol/LBAEE）作為空白，校正儀器的253nm處光吸收零點(diǎn)。再在另一比色杯中加入0.2ml待測(cè)酶液（用量一般為10微克結(jié)晶的胰蛋白酶），立即混勻并記時(shí)（杯內(nèi)已有2.0ml緩沖液和0.8mlBAEE溶液）。每半分鐘讀數(shù)一次，共讀3~4分鐘。若?A253/min>0.400，則酶液應(yīng)當(dāng)稀釋或減量，控制?A253/min在0.05~0.100左右為宜。繪制酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線，從曲線上求出反應(yīng)起始點(diǎn)吸光度隨時(shí)間的變化率（即初速度）?A253/min。胰蛋白酶活力單位的定義規(guī)定為：以BAEE為底物反應(yīng)液pH8.0，25℃，反應(yīng)體積3.0ml，光徑1厘米的條件下，測(cè)定?A253，每分鐘使?A253增加0.001，反應(yīng)液中所加入的酶量為一BAEE單位。所以：胰蛋白酶溶液的活力單位（BAEE單位/ml）＝胰蛋白酶比活力（BAEE單位/mg）＝2.卵粘蛋白抑制活性的測(cè)定胰蛋白酶抑制活力單位的定義：抑制一個(gè)胰蛋白酶活力單位（BAEE單位）所需卵粘蛋白的量，定為抑制劑的一個(gè)活力單位（英文縮寫(xiě)為BAEETIu）。具體測(cè)定方法如下：首先以底物（不加酶）于253nm處校正儀器光吸收零點(diǎn)（操作如上述）；再測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)酶的活力單位（操作如上述）；測(cè)定加入抑制劑后剩余酶活力單位；在比色杯中加入0.2ml上述標(biāo)準(zhǔn)酶液再加入適量的抑制劑（一般不能超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)酶含量，以1：2左右為宜，具體視抑制劑的純度而定），再加入1.8ml0.05mol/LpH=8.0Tris-HCl緩沖液，搖勻后于25℃放置2分鐘以上，讓酶與抑制劑充分結(jié)合。最后加入0.8ml底物（BAEE溶液），搖勻立即記時(shí)，測(cè)定A253的變化。計(jì)算剩余酶活力單位。按下面方式計(jì)算出抑制劑的抑制活力和抑制比活力：抑制劑溶液的抑制活力Iu＝（BAEE抑制單位/ml）抑制比活力＝（BAEETIu/mg）式中：?A0：未加抑制劑時(shí)，酶每分鐘?A253增加值?Ai.：加入抑制劑后，酶每分鐘?A253的增加值Ni：抑制劑溶液的稀釋倍數(shù)Vi：測(cè)定時(shí)加入抑制劑的體積。附錄三：豬胰蛋白和卵粘蛋白濃度的計(jì)算1.豬胰蛋白酶濃度（mg/ml）=A280×(1/1.35)×稀釋倍數(shù)2.雞