一株耐鹽耐氧反硝化菌MCW148的分離鑒定及其脫氮特性

一株耐鹽耐氧反硝化菌MCW148的分別判斷及其脫氮特點(diǎn)管理最好的養(yǎng)蝦場，也有30%的餌料未被攝食，殘餌溶生的氮、磷營養(yǎng)物質(zhì)是蝦池及其周邊淺海的主要污染源。在高密度的水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中，飼料中75%～80%的氮會(huì)進(jìn)入養(yǎng)殖水體中，并以氨氮、亞硝酸鹽氮的形式出現(xiàn)不同樣程度的累積，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物造成危害，從而限制了海水養(yǎng)殖的單位產(chǎn)量，并且其排放的廢水中也含有豐富的含氮化合物，會(huì)加快海水富營養(yǎng)化，造成赤潮災(zāi)害，給近岸海洋生態(tài)環(huán)境帶來了危害。因此，研究快速除掉養(yǎng)殖環(huán)境中有機(jī)污染的方法，以趕忙恢復(fù)和優(yōu)化養(yǎng)殖環(huán)境，對(duì)中國海水養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展以及灘涂和淺海資源的可連續(xù)利用擁有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。自從第一株好氧反硝化菌在1984年首次發(fā)現(xiàn)以來，國內(nèi)外陸續(xù)有大量菌株被分別出來[3-8]。好氧反硝化菌是一類能在好氧或兼氧條件下進(jìn)行反硝化的細(xì)菌，它的存在使得硝化過程和反硝化過程得以在一個(gè)反應(yīng)器中同步進(jìn)行，硝化反應(yīng)的產(chǎn)物可成為反硝化反應(yīng)的底物，加快了反應(yīng)速度，降低了運(yùn)行成本，同時(shí)反硝化反應(yīng)釋放的OH-會(huì)補(bǔ)償硝化反應(yīng)耗資的堿，防備酸性物質(zhì)的累積，保持系統(tǒng)pH的牢固[8，9]。本試驗(yàn)主要對(duì)1株耐鹽好氧反硝化細(xì)菌MCW148進(jìn)行了判斷，研究了該菌株高效代謝硝酸鹽氮的生理生化特點(diǎn)，及其最正確培養(yǎng)條件和生長特點(diǎn)，為好氧反硝化菌在海水養(yǎng)殖廢水辦理中的應(yīng)用確定基礎(chǔ)。資料與方法1.1菌種富集、分別純化和培養(yǎng)基組成稱取1g樣品放入裝有9mL無菌水的試管中，80℃水浴20min，充分振蕩混勻，取1mL到下一個(gè)同樣的試管中，依次稀釋獲取各種濃度的菌懸液。分別取10-5～10-73個(gè)稀釋梯度的稀釋液0.1mL涂布于NA平板上，爾后倒置于培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24h。挑取不同樣形態(tài)的單菌落轉(zhuǎn)接至NA斜面上，37℃恒溫培養(yǎng)24h，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。所挑取菌落同時(shí)在NA培養(yǎng)基平板上劃線檢驗(yàn)純度。菌株分別培養(yǎng)基（NA）：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，瓊脂20.0g，pH7.2～7.4，蒸餾水1000mL。硝酸鹽還原產(chǎn)氣培養(yǎng)基：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，KNO31.0g，pH7.2～7.4，蒸餾水1000mL。種子培養(yǎng)基：葡萄糖10.0g，CaCl20.2g，MgSO4·7H2O0.5g，（NH4）2SO42.0g，KCl0.2g，乙酸鈉3.32g，pH7.2～7.4，蒸餾水1000mL。反硝化基礎(chǔ)培養(yǎng)基：KNO32.0g，MgSO4·7H2O1.0g，KH2PO40.5g，葡萄糖10.0g，pH7.2～7.4，蒸餾水1000mL。1.2反硝化性能測定250mL三角瓶中加入100mL反硝化性能測定培養(yǎng)液，滅菌后加入1mL培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌液，置于120r/min、30℃下培養(yǎng)，每3h取樣測定培養(yǎng)基中的NO3--N、NO2--N濃度和細(xì)菌生長量（以吸光度OD600nm表示）。1.3菌株的判斷菌落形態(tài)及生理生化判斷：30℃培養(yǎng)24h，觀察菌落形態(tài)；革蘭氏染色、碳源利用等生理生化指標(biāo)測定參照文件的方法進(jìn)行。16SrDNAPCR擴(kuò)增和序列測定：將菌株保存至平板中，送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成測序和解析。1.4菌株生長條件及脫氮特點(diǎn)1.4.1最適碳源分別以葡萄糖、乙酸鈉、丁二酸鈉、草酸鈉、檸檬酸鈉為碳源，貧營養(yǎng)反硝化性能測定培養(yǎng)基中的其他成分不變，滅菌后依照1%的量加培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌液，爾后置于120r/min、30℃條件下培養(yǎng)，分別在0、12、24、36、48h取樣測定培養(yǎng)基中的NO3--N、NO2--N濃度，計(jì)算其去除率。1.4.2最適溫度以葡萄糖為碳源，配制化學(xué)需氧量（COD）為200mg/L、NO3--N質(zhì)量濃度為10mg/L的貧營養(yǎng)反硝化性能測定培養(yǎng)基，滅菌后依照1%的量加培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌液，分別置于15、20、25、30、35、40℃下，120r/min連續(xù)振蕩培養(yǎng)24h，測定培養(yǎng)液中的NO3--N濃度，計(jì)算其去除率。1.4.3最適初始pH培養(yǎng)溫度30℃，初始pH分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，其他試驗(yàn)設(shè)計(jì)同“?！苯Y(jié)果與解析2.1樣品的富集培養(yǎng)及菌種的分別純化污泥樣經(jīng)過3次富集培養(yǎng)后獲取混雜微生物的培養(yǎng)物，它可以在含有200mg/LNO3--N的合成培養(yǎng)基（FM）中生長，在培養(yǎng)過程中經(jīng)過測定培養(yǎng)液的OD600nm和NO3--N的濃度，發(fā)現(xiàn)該混雜培養(yǎng)液中的NO3--N含量不斷減少，而OD600nm不斷上升，說明該混雜液培養(yǎng)物擁有很強(qiáng)的好氧反硝化能力。上述混雜培養(yǎng)物在對(duì)氯苯胺的BTB平板進(jìn)步行劃線分別，挑取單菌落，經(jīng)過復(fù)篩、純化后獲取1株擁有高效脫氮功能的耐鹽好氧反硝化細(xì)菌菌株MCW148。2.2MCW148菌株反硝化性能經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室模擬養(yǎng)殖系統(tǒng)廢水的水質(zhì)（表1）解析，把MCW148菌株接種于

NO3--N

初始濃度為

150mg/L

的合成培養(yǎng)基中，

30℃、120r/min

搖床培養(yǎng)，準(zhǔn)時(shí)取樣測定菌體生長、

NO3--N

和

NO2--N

的濃度情況。結(jié)果（圖1）表示，MCW148能在12h內(nèi)將NO3--N濃度從140mg/L以上降至0.05mg/L以下，同時(shí)，NO2--N的濃度先漸漸高升，爾后漸漸降低至0.05mg/L以下，說明MCW148菌株擁有高效的反硝化脫氮能力。別的，由圖1還可知，MCW148菌株的生長同步于NO3--N濃度的降低，且MCW148菌株的生長曲線、NO3--N的代謝曲線中的遲緩期基本都在0～3h，爾后進(jìn)入對(duì)數(shù)期（4～15h），約在24h達(dá)到最高的菌體生長量。2.3菌株的判斷菌株MCW148在LB培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)2d的菌落為乳白色，圓形，中間凸出，表面圓滑濕潤，直徑在1mm左右；細(xì)胞呈直桿狀，1.0m×3.0μm，革蘭氏陽性，常以成對(duì)或鏈狀排列，單極毛（圖2）。接觸氧化酶陽性；可利用葡萄糖、檸檬酸鈉、阿拉伯糖、木糖等為碳源，但利用葡萄糖收效最好；硝酸鹽還原和反硝化陽性。擴(kuò)增菌株MCW148的16SrRNA部分基因，長度為1516bp。序列解析表示該菌株與巨大芽孢桿菌（Bacillusmegaterium）的同源性最高，為99%[4，11]。結(jié)合菌株的形態(tài)和生理生化特點(diǎn)，將菌株MCW148初步判斷為巨大芽孢桿菌。目前，國內(nèi)外在好氧反硝化菌領(lǐng)域進(jìn)行了大量的研究[12-16]，但在芽孢桿菌屬中，擁有耐鹽隨和氧反硝化能力的細(xì)菌卻鮮有報(bào)道。2.4MCW148菌株生長條件及脫氮特點(diǎn)2.4.1最適碳源分別以葡萄糖、乙酸鈉、丁二酸鈉、草酸鈉、檸檬酸鈉為碳源，貧營養(yǎng)反硝化性能測定培養(yǎng)基中的其他成分不變，接種MCW148菌株，在30℃、120r/min搖床條件下培養(yǎng)2d，準(zhǔn)時(shí)取樣測定NO3--N濃度。圖3的結(jié)果表示，菌株MCW148可以利用多種碳源進(jìn)行脫硝酸鹽氮，其中，碳源為葡萄糖時(shí)，NO3--N的去除收效最正確，培養(yǎng)12h去除率便達(dá)到了62.4%；其次是檸檬酸鈉，NO3--N在培養(yǎng)12h時(shí)去除率為34.2%，24h去除率達(dá)到了59.7%；丁二酸鈉、草酸鈉24h的NO3--N去除率分別為45.8%和33.7%；而菌株MCW148基本不利用乙酸鈉為碳源。因此，葡萄糖為菌株MCW148的最適碳源。2.4.2最適溫度由圖4可知，MCW148菌體生長和反硝化的溫度適宜范圍為30～40℃，在35℃時(shí)NO3--N去除率最高，為74%。別的，由圖4可以看出，MCW148的生長和反硝化存在一個(gè)臨界溫度，即25℃，一旦低于這個(gè)溫度，MCW148的生長和代謝活性顯然降低，因此，該菌嗜高溫而對(duì)低溫特別敏感，建議35℃為其最適生長溫度。2.4.3最適初始pH由圖5可知，MCW148菌株在pH5～9的范圍內(nèi)對(duì)

NO3--N

的代謝去除活性均較高，其最正確

pH

為

6，此時(shí)的

NO3--N

去除率為

60%。3小結(jié)本研究從渤海某海水養(yǎng)殖場（北美白對(duì)蝦）底泥中分別到1株耐鹽高效好氧反硝化細(xì)菌，經(jīng)過對(duì)其形態(tài)特點(diǎn)、生理生化以及16SrDNA序列分析，初步判斷為巨大芽孢桿菌。該菌株在去除NO3--N的同時(shí)，也能降解COD。菌株MCW148在不同樣種類碳源下去除NO3--N的能力由大到小依次為葡萄糖、檸檬酸鈉、丁二酸鈉、草酸鈉、乙酸鈉。其生長和代謝NO3--N的最正確條件是溫