毒物分析第五章課件

第五章毒物分析常用方法-免疫分析

1959年Berson等建立放射免疫分析(RadioImmunoassay,RIA)，是一種將同位素放射測(cè)量與免疫原理相結(jié)合的分析方法。用于微量分析，檢測(cè)限達(dá)到pg級(jí)(1×10-12g)。1971年Engvall等在RIA的基礎(chǔ)上,建立酶標(biāo)免疫分析(Enzyme-LabledImmunoassay,EIA)。用酶標(biāo)代替放射性同位素標(biāo)記。無(wú)放射危害，操作方便、安全。

1，基本原理免疫分析的本質(zhì)是抗原(Antigen,Ag)-抗體(Antibody,Ab)的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)。將純化的待測(cè)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品作為抗原,免疫動(dòng)物，使其產(chǎn)生特異性抗體，然后根據(jù)Ag與其標(biāo)記物（*Ag：標(biāo)記抗原）對(duì)Ab的特異性競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的程度測(cè)定Ag的含量。

2022/12/51新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥分/分析教研室由于Ag和*Ag對(duì)Ab具有同等的親和力，因此在免疫反應(yīng)中，當(dāng)*Ag，Ab濃度恒定，并且[*Ag]＞[Ab]時(shí)，若加入Ag將發(fā)生以下反應(yīng)：2022/12/52新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥分/分析教研室設(shè)：F/B=1:1

2*Agt+2Agt+2Ab→*Agf+Agf+*AgAb+AgAb2022/12/53新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥分/分析教研室RIA標(biāo)準(zhǔn)曲線

待測(cè)物濃度(Ag,conc.)與所測(cè)得的反應(yīng)計(jì)量值(*Ag-Ab)呈反比

2022/12/55新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥分/分析教研室2，方法

2.1，抗原制備高度純化的Ag（＞純度90%）是建立RIA的關(guān)鍵。分子量小的一些小分子缺乏抗原性

(如多數(shù)藥物、甾體激素等分子量較小的物質(zhì))稱半抗原（Hapten），接到carrier後也可誘生抗體。如通過(guò)戊二醛等與蛋白質(zhì)或多肽等大分子（如牛血清白蛋白等）共價(jià)結(jié)合,提高動(dòng)物免疫性，使其產(chǎn)生特異抗體(Ab)。例如嗎啡分子結(jié)構(gòu)有多個(gè)位點(diǎn)可連接蛋白質(zhì)。2022/12/56新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥分/分析教研室

2.2，標(biāo)記

⑴、放射性同位素標(biāo)記通常半抗原先與酪氨酸偶合，然后標(biāo)記。目前最常用的放射性同位素是碘-125（半衰期60天，含量：95﹪，能量低：約40KeV）?；?H標(biāo)記Ag。能譜儀檢測(cè)（3H標(biāo)記，用液閃測(cè)定）。

⑵、酶標(biāo)免疫分析用特異性酶作標(biāo)記，例如嗎啡用蘋果酸脫氫酶(malatedehy-drogenase,MD)標(biāo)記，形成嗎啡-MD。測(cè)定時(shí)被測(cè)嗎啡與嗎啡-MD競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合嗎啡抗體。由于嗎啡-MD結(jié)合愈多其活性愈小，測(cè)定底物濃度即可計(jì)算分析物含量。2022/12/57新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥分/分析教研室

名稱來(lái)源分子量底物測(cè)定方法溶菌酶雞蛋清14000細(xì)胞壁比色法葡萄糖淀粉酶酵母淀粉比色法辣根過(guò)氧化物酶辣根40000H2O2/5-氨基水楊酸比色法b-半乳糖苷酶大腸桿菌51800鄰硝基酚比色法、熒光法2022/12/58新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥分/分析教研室3、應(yīng)用3.1、放射免疫分析

尿中D9-THC(四氫大麻酚)的測(cè)定：檢測(cè)限15mg/L，誤差±4%。吸食后尿中排出高峰在2-6hr，持續(xù)排出24hr。藥物靈敏度藥物靈敏度嗎啡100pg咖啡因30pg巴比妥30pg箭毒5pg洋地黃毒甙2ng氯丙嗪5ng2022/12/510新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥分/分析教研室1.空白試驗(yàn):空白試驗(yàn)是在實(shí)行一個(gè)檢測(cè)方法時(shí),除了不加入已知欲檢測(cè)物以外,其他所用檢驗(yàn)材料,溶劑,試劑,器皿,設(shè)備,操作步驟等等都完全與所作檢驗(yàn)中的相同;也稱為空白對(duì)照試驗(yàn).

2.毒性作用:生物體受到一定量的毒物作用而引起功能性和器質(zhì)性改變后出現(xiàn)的疾病狀態(tài)稱為中毒,由毒物所