DB43-T 2009-2021香芋莖尖脫毒技術規(guī)程

ICS65.020CCSB16 43湖 南 省 地 方 標 準DB43/T2009—2021香芋莖尖脫毒技術規(guī)程Regulationsforvirus-freetechnologyofTarostemtip20212021022020210520湖南省市場監(jiān)督管理局發(fā)布目 次前言Ⅲ112規(guī)范性引用文件······1314材料選擇與處理151627培養(yǎng)室環(huán)境調(diào)控3A（）MS4B（）PCR··············5前 言GB/T1.1—20201請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由湖南省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出。本文件由湖南省農(nóng)業(yè)標準化技術委員會歸口。本文件起草單位：湖南省蔬菜研究所。本文件主要起草人：李倩、楊建國、汪端華、吳雙花、皮向紅、王鑫、宋志偉。香芋莖尖脫毒技術規(guī)程（SN/T1538.1—2005培養(yǎng)基制備指南第1部分：實驗室培養(yǎng)基制備質(zhì)量保證通則SN/T2964—2011植物病毒檢測規(guī)范下列術語和定義適用于本文件。下列術語和定義適用于本文件。3.1莖尖脫毒Stemtipdetoxification4材料選擇與處理選擇健壯、生長旺盛、無病蟲害癥狀的母芋為莖尖脫毒材料。8007d～10。5培養(yǎng)基的配制MSMSAMS5.1.2MS6g～7gMS20mL5mL30g1LpH5.7～5.912020min；5d～7d30d。MSNAA0.15mg/L、6-BA4.0mg/L11mL/L5.1.2。MSNAA0.4mg/L6-BA4.0mg/L11mL/L5.1.2。在接種前準備酒精燈、75％酒精、NaClO、無菌濾紙或接種盤以及接種器械、培養(yǎng)基、體視顯微鏡、外植體、無菌水等。外植體、無菌水等。提前30min打開超凈工作臺紫外燈，紫外滅菌完后，打開風機和照明燈。接種人員在準備室消毒后在更衣室更換拖鞋、穿白大褂、戴上帽、口罩后方能進入接種室。操作人員用75％酒精噴或擦手，在操作臺內(nèi)自然吹干后點酒精燈，全程操作須帶手套。30s～452～310％NaClO8min～10min3～430～400.2mm～0.5mm6.2香芋莖尖的初代培養(yǎng)60d～80d后成苗，待苗長至2cm～3cm時，整株取出接入增殖培養(yǎng)基中。MosaicVirus，TMVCucumberMosaicVirus，CMVDaheenoscus,DsMV。表1病毒病檢測引物序列病害正向引物反向引物目的片段CMVCCCACTCTTAACCACCCAACCGACGCAGCATACTGATAAACCAA323TMVTAGACCCGCTAGTCACAGCAGAGGTCCAAACCAAAC237DsMVGGGCTTGGGTGATGATGGAGCCTTTCAGTGTTCTCGCCTTG357PCR。dd25d～35d，增殖率為3～6，連續(xù)繼代不超過10次。6.5病毒檢測病毒檢測同6.3。7培養(yǎng)室環(huán)境調(diào)控28℃±240％～6054μmol?m2?s，光照培養(yǎng)周期為12h/12h。附錄A（規(guī)范性）MS培養(yǎng)基母液配制表母液種類成分稱取量（mg/L）擴大倍數(shù)母液體積（L）吸取量（mL/L）大量元素KNO3190050×120NH4NO31650MgSO4﹒7HO2370KH2PO4170CaCl2﹒2H2O44050×120微量元素MnSO4﹒4H2O2.23200×15ZnSO4﹒7H2O860H3BO36.2KI0.83NaMoO4﹒2H2O0.25CuSO4﹒5H2O0.025CoCl﹒6H2O0.025鐵鹽Na2-EDTA37.3200×15FeSO4﹒7H2O27.8維生素甘氨酸2200×15鹽酸吡哆醇（B1）0.1鹽酸硫胺素（B6）0.5煙酸0.5肌醇100IBA0.005MET0.005附錄B（資料性）PCR（PolymeraseChainReaction）法檢測病毒病B1香芋病毒病檢測PCRTMV)CMV（DsMV）B2儀器和設備3000r/min1.5mL～2mL，50μL2μL～10μL，10μL～50μL，10μL～200μLPCRB3試劑主要試劑包括植物RNA5×PrimeScriptIIBufferdNTP2.5units/μLTaqDNA10×Buffer、TAE1g～2g1g～2gRNARNA-80B5cDNA合成參照說明書，利用反轉錄試劑盒合成cDNA。B6PCR擴增B6.1反應體系（總體積20L）PCR反應體系為：10×Buffer2.0μL；dNTP(2mmol/L)1.5μL；Primer(2μmol/L)1.5μL；模板DNA4.0μL；Taq(2.5units/μL)1U；加ddH2O至20μL。B6.2擴增反應程序PCR擴增反應程