生物化學(xué)課件第六章核酸化學(xué)代謝DNA合成

第七節(jié)DNA的生物合成（復(fù)制）

DNAReplicationP361

第七節(jié)DNA的生物合成（復(fù)制）

DNAReplica1

DNA是絕大多數(shù)生物體遺傳信息的載體，繼1953年Watson&Crick提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型后，1958年Crick提出了“中心法則”(Centraldogma)揭示了遺傳信息的傳遞規(guī)律。DNARNA蛋白質(zhì)復(fù)制復(fù)制轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄翻譯遺傳信息傳遞的中心法則病毒

DNA是絕大多數(shù)生物體遺傳信息的載體，繼192DNA的生物合成：細(xì)胞內(nèi)合成DNA的過程1、復(fù)制：以DNA作為模板指導(dǎo)的DNA合成，即將DNA攜帶的信息傳至子代DNA。

四種核苷酸（dATP\dTTP\dCTP\dGTP）

2、反轉(zhuǎn)錄：DNA合成也可以RNA為模扳指導(dǎo)合成作用，見于RNA病毒。3、修復(fù)合成：當(dāng)各種因素引起DNA損傷時(shí)，損傷DNA可修復(fù)合成，校正錯(cuò)誤，完成正確合成，以保持DNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和遺傳信息的準(zhǔn)確性。DNA的生物合成：細(xì)胞內(nèi)合成DNA的過程31、DNA的半保留復(fù)制

DNA在復(fù)制時(shí)，兩條鏈解開分別作為模板，在DNA聚合酶的催化下按堿基互補(bǔ)的原則合成兩條與模板鏈互補(bǔ)的新鏈，以組成新的DNA分子。這樣新形成的兩個(gè)DNA分子與親代DNA分子的堿基順序完全一樣。由于子代DNA分子中一條鏈來自親代，另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻?，這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制。一、DNA復(fù)制1、DNA的半保留復(fù)制

DNA在復(fù)制時(shí)，兩條4DNA的半保留復(fù)制實(shí)驗(yàn)依據(jù)

1958年M.Meselson和F.W.Stahl用大腸桿菌為材料，在含15N和14N的NH4cl中培養(yǎng)證實(shí)，用同位素示蹤標(biāo)記加密度梯度離心技術(shù)實(shí)驗(yàn),證明了DNA是采取半保留的方式進(jìn)行復(fù)制.[15N]DNA[14N-15N]DNA[14N]DNA[14N-15N]DNADNA在離心管中的沉降位置P361培養(yǎng)12代培養(yǎng)1代培養(yǎng)2代DNA的半保留復(fù)制實(shí)驗(yàn)依據(jù)1958年M.Mesels52、原核生物DNA聚合反應(yīng)有關(guān)的酶類

（1）DNA聚合酶(DNApolymetases)（2）引物酶(peimase)和引發(fā)體primosome

：啟動(dòng)RNA引物鏈的合成。

(3）DNA連接酶（DNAligas（4）DNA解鏈酶：ATP供能解開DNA雙鏈(5）單鏈結(jié)合蛋白(single-strandbindingprotein,SSB)：結(jié)合在解開的DNA單鏈上，防止重新形成雙螺旋。

(6）拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoisomerase):兼具內(nèi)切酶和連接酶活力，能迅速將DNA超螺旋或雙螺旋緊張狀態(tài)變成松馳狀態(tài)，便于解鏈。能改變DNA空間構(gòu)型的酶，合成后再引向超螺旋。機(jī)制：切開環(huán)狀一條鏈解旋酶DNA聚合酶III解鏈酶RNA引物引物酶和引發(fā)體DNA聚合酶ISSB3′3′5′3′5′5′RNA引物2、原核生物DNA聚合反應(yīng)有關(guān)的酶類

（1）DNA聚合酶(D6（1）DNA聚合酶催化的鏈延長反應(yīng)5′RNA引物子鏈3′3′5′5′3′3′5′5′3′3′5′模板鏈只能加到已有核苷酸的游離3’羥基上，不能自身聚合，需引物p363（1）DNA聚合酶催化的鏈延長反應(yīng)5′RNA引物子鏈3′3′7大腸桿菌三種DNA聚合酶比較DNA聚合酶Ⅱ分子量每個(gè)細(xì)胞的酶分子統(tǒng)計(jì)數(shù)5′-3′聚合酶作用3′-5′核酸外切酶作用5′-3′核酸外切酶作用聚合速率（nt/s）DNA聚合酶Ⅰ109000單鏈多肽400+++16-20120000單鏈多肽100++-40400，000（10種亞基）10-20++-250-1000比較項(xiàng)目DNA聚合酶III切除引物,校對，修復(fù)修復(fù)復(fù)制功能

1999年發(fā)現(xiàn)聚合酶和，它們涉及DNA的錯(cuò)誤傾向修復(fù)（erroounerepair）P364大腸桿菌三種DNA聚合酶比較DNA分子量DNA109000單8DNA聚合酶的3′-5′外切酶水解位點(diǎn)（I、II、III）3′3′5′5′錯(cuò)配堿基3′-5′核酸外切酶水解位點(diǎn)DNA聚合酶的3′-5′外切酶水解位點(diǎn)（I、II、III）9DNA聚合酶5′-3′外切酶活力（I）

5′-3′核酸外切酶水解位點(diǎn)單鏈缺口5′切除引物,修復(fù)DNA聚合酶5′-3′外切酶活力（I）

5′-3′核酸外10大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ全酶的結(jié)構(gòu)和功能（10個(gè)亞基）延長因子DNA聚合酶Ⅲ兩個(gè)亞基夾住DNA核心酶校對引物的結(jié)合和識(shí)別促使核心酶二聚化組建核心酶P364大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ全酶的結(jié)構(gòu)和功能（10個(gè)亞基）11圖11-8DNAPolIII的二聚體作用生物化學(xué)課件第六章核酸化學(xué)代謝DNA合成12（2）連接酶連接切口Mg2+連接酶ATP（噬菌體和動(dòng)物）或NADH（細(xì)菌）AMP+PPiATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPPOHTGGATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGP缺口3'3'5'5'5'5'3'3'模板鏈模板鏈DNA復(fù)制、損傷修復(fù)、重組P367（2）連接酶連接切口Mg2+連接酶ATP（噬菌體和動(dòng)物）AM133、原核細(xì)胞DNA的半不連續(xù)復(fù)制復(fù)制過程

semidiscontinuousreplication

P3683、原核細(xì)胞DNA的半不連續(xù)復(fù)制P36814（1）復(fù)制的起始點(diǎn)與方向

親代DNA開鏈，復(fù)制起始點(diǎn)呈叉型移動(dòng)?！褟?fù)制起始點(diǎn)：DNA復(fù)制要從DNA分子的特定部位開始，此部位稱復(fù)制起始點(diǎn)。原核：僅含一個(gè)，約245bp,特殊的重復(fù)序列。真核：多個(gè)起始點(diǎn)例：酵母17號(hào)染色體含400個(gè)?！褟?fù)制方向：含三種機(jī)制一個(gè)起點(diǎn)2個(gè)叉，不同方向合成兩條鏈，此為常見方式。2個(gè)起點(diǎn)，2個(gè)叉，各合一條鏈（腺病毒）。一個(gè)起點(diǎn)一個(gè)叉，同方向合成兩條鏈（質(zhì)粒ColEI）--單向復(fù)制（1）復(fù)制的起始點(diǎn)與方向15DNA的雙向和單向復(fù)制----起始環(huán)狀

DNA復(fù)制時(shí)所形成的O結(jié)構(gòu)起始點(diǎn)復(fù)制叉的推進(jìn)復(fù)制叉起始點(diǎn)起始點(diǎn)起始點(diǎn)復(fù)制叉復(fù)制叉未復(fù)制DNA單向復(fù)制雙向復(fù)制DNA的雙向和單向復(fù)制----起始環(huán)狀DNA復(fù)制時(shí)所形成的16大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)成串排列的重復(fù)序列

GATCTNTTNTTT成串排列的三個(gè)13bp序列共有序列共有序列TTATCCACA

DnaA蛋白結(jié)合位點(diǎn)四個(gè)9bp序列DnaB(解螺旋酶)SSB大腸桿菌DNA復(fù)制起點(diǎn)在起始階段的結(jié)構(gòu)模型DnaA識(shí)別起始點(diǎn)在復(fù)制起點(diǎn)特異部位解開雙鏈DNAP368大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)成串排列的重復(fù)序列

GATCTNTTNTTT17（2）原核細(xì)胞DNA的半不連續(xù)復(fù)制復(fù)制過程

復(fù)制叉的移動(dòng)方向解旋酶解鏈酶RNA引物引物體DNA聚合酶ISSB3′3′5′前導(dǎo)鏈隨后鏈3′5′復(fù)制的起始DNA鏈的延長DNA鏈終止5′RNA引物3′3′P369,393,274DNA聚合酶III切除引物、缺口填補(bǔ)、校對（2）原核細(xì)胞DNA的半不連續(xù)復(fù)制復(fù)制過程

復(fù)制叉的移動(dòng)方向18聚合酶III核心酶大腸桿菌復(fù)制體結(jié)構(gòu)示意圖聚合酶I聚合酶III核心酶滯后鏈前導(dǎo)鏈解螺旋酶引物合成酶RNA引物引發(fā)體拓?fù)洚悩?gòu)酶II-夾子-聚體-夾子-復(fù)合物RNA引物單鏈結(jié)合蛋白（SSB）活化引物合成酶P370聚合酶III核心酶大腸桿菌復(fù)制體結(jié)構(gòu)示意圖聚合酶I聚合酶II19復(fù)制叉處前導(dǎo)鏈和隨后鏈同時(shí)合成的工作模型聚合酶III全酶引物聚合酶III全酶引物引物體引物體解旋酶解旋酶引物合成酶DnaG蛋白前導(dǎo)鏈和隨后鏈被同一個(gè)DNA聚合酶III不對稱二聚體合成復(fù)制叉處前導(dǎo)鏈和隨后鏈同時(shí)合成的工作模型聚合酶III全酶引物20（3）大腸桿菌染色體復(fù)制的終止oric復(fù)制叉2復(fù)制叉1終止復(fù)制叉2終止復(fù)制叉1復(fù)制叉1復(fù)制叉2完成復(fù)制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶連鎖體終止子位點(diǎn)連鎖體在細(xì)胞分裂前必須解開，否則導(dǎo)致細(xì)胞分裂失敗，細(xì)胞死亡。兩個(gè)復(fù)制叉從起始反向移動(dòng)至約180O的對面終止區(qū)相遇（3）大腸桿菌染色體復(fù)制的終止oric復(fù)制叉2復(fù)制叉1終止21（4）復(fù)制的忠實(shí)性

DNA復(fù)制過程是一個(gè)高度精確的過程，據(jù)估計(jì)，大腸桿菌DNA復(fù)制5X109堿基對僅出現(xiàn)一個(gè)誤差，保證復(fù)制忠實(shí)性的原因主要有以下三點(diǎn):

DNA聚合酶的高度專一性（嚴(yán)格遵循堿基配對原則，但錯(cuò)配率為7

X10-6

）

DNA聚合酶的校對功能（錯(cuò)配堿基被3’-5’

外切酶切除）起始時(shí)以RNA作為引物P374（4）復(fù)制的忠實(shí)性DNA復(fù)制過程是一個(gè)高度精22DNA聚合酶的校對功能聚合酶錯(cuò)配鹼基復(fù)制方向正確核苷酸5′5′5′3′3′3′切除錯(cuò)配核苷酸DNA聚合酶的校對功能聚合酶錯(cuò)配鹼基復(fù)制方向正確核苷酸5′23

起始時(shí)以RNA作為引物的作用

DNA復(fù)制為什么要合成一個(gè)RNA引物，而后又把這個(gè)引物消除呢？這是保證DNA聚合過程高度精確的又一措施。已知DNA聚合酶具有3’-5’外切酶功能校對復(fù)制過程中的核苷酸，也就是說聚合酶在開始形成一個(gè)新的磷酸二酯鍵前，總是檢查前一個(gè)堿基是否正確，這就決定了它不能從頭開始合成。因此先合成一條低忠實(shí)性的多核苷酸來開始DNA的合成，并以核糖核苷酸來表示是“暫時(shí)”的，當(dāng)DNA開始聚合以后再以5’-3’外切酶的功能切除，以高忠實(shí)性的脫氧核苷酸取而代之，確保復(fù)制的忠實(shí)性。（RNA聚合酶無校對功能，不需引物，可以從頭合成）

起始時(shí)以RNA作為引物的作用

DNA復(fù)制為244、真核生物復(fù)制的特點(diǎn)（1）復(fù)制速度：是原核的1/10，但復(fù)制起始點(diǎn)多。（2）引物和岡琦片段小于原核，引物為10個(gè)，片段100~200；原核引物十幾~幾十，片段1000~2000。（3）復(fù)制需DNApol及多種因子參加，pol

pol在核內(nèi)起主要作用。（4）pol為線粒體復(fù)制酶。（5）DNA復(fù)制位于細(xì)胞周期的S期。4、真核生物復(fù)制的特點(diǎn)25真核細(xì)胞DNA復(fù)制的特點(diǎn)多個(gè)起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn)起點(diǎn)起點(diǎn)起點(diǎn)起點(diǎn)起點(diǎn)真核生物DNA聚合酶端粒（telemere）的復(fù)制真核細(xì)胞DNA復(fù)制的特點(diǎn)多個(gè)起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn)起點(diǎn)起點(diǎn)起點(diǎn)起點(diǎn)26真核生物的DNA聚合酶DNA聚合酶分子量亞基數(shù)細(xì)胞內(nèi)分布酶活力百分比外切酶活力DNA聚合酶110-23，000多個(gè)細(xì)胞核～80%無120，000二個(gè)細(xì)胞核和線粒體2～15%3-5外切酶400，000二個(gè)細(xì)胞核+10～25%3-5外切酶DNA聚合酶DNA聚合酶45，000一個(gè)細(xì)胞核10～15%無核DNA合成線粒體DNA合成引物合成

修復(fù)功能真核生物的DNA聚合酶DNA分子量DNA110-23，00027

真核生物DNA復(fù)制與核小體裝配同步進(jìn)行，復(fù)制完成后隨即組合成染色體并從G2期過渡到M期。染色體DNA是線性結(jié)構(gòu)。染色體兩端DNA子鏈上最后復(fù)制的RNA引物，去除后留下空隙。剩下的DNA單鏈母鏈如果不填補(bǔ)成雙鏈，就會(huì)被核內(nèi)Dnase酶解。某些低等生物染色體經(jīng)多次復(fù)制會(huì)越來越短。

真核生物DNA復(fù)制與核小體裝配同步進(jìn)行，復(fù)制完成后28端粒端粒：真核生物線性染色體的兩個(gè)末端具有特殊結(jié)構(gòu)稱為端粒。端粒由許多成串的短的重復(fù)序列組成。一條鏈上富含G，如人的端粒TTAGGG，原生動(dòng)物四膜蟲為TTGGGG,植物

TTTAGGG。端粒的功能：穩(wěn)定染色體末端結(jié)構(gòu)，防止末端染色體降解；防止染色體間末端連接。（原核生物染色體是環(huán)狀的，5′末端岡奇片段的RNA引物被除去后可借助另半圈DNA鏈向前延伸填補(bǔ)。）端粒29端粒酶（telomerase）DNA復(fù)制需要引物，但在線形DNA分子末端不可能通過正常的機(jī)制在引物被降解后合成相應(yīng)的片段.如果沒有特殊的機(jī)制合成末端序列，染色體就會(huì)在細(xì)胞傳代中變得越來越短。這一難題是通過端粒酶的發(fā)現(xiàn)才得到了澄清。

端粒酶是一種含RNA的蛋白復(fù)合物，實(shí)質(zhì)上是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，它以自身攜帶的RNA為模板，催化互補(bǔ)鏈DNA片段的合成，使復(fù)制以后的線形DNA分子的末端保持不變。

端粒酶含150個(gè)堿基RNA鏈。端粒酶結(jié)合到端粒的3′末端上，以RNA鏈5′末端識(shí)別DNA3′末端并合成互補(bǔ)鏈，端粒3′單鏈末端回折作為引物合成其互補(bǔ)鏈。端粒酶（telomerase）DNA復(fù)制需要引物30

缺乏端粒酶活性時(shí)，細(xì)胞分裂將端粒不斷縮短，引起細(xì)胞生長停止甚至死亡。腫瘤細(xì)胞端?；钚愿?，設(shè)想端粒酶作為抗癌治療的靶位點(diǎn)。5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCA端粒酶

初步研究表明，人體中生殖細(xì)胞的端粒長度保持不變，而體細(xì)胞的端粒長度則隨個(gè)體的老化而逐步縮短。對此的一個(gè)推論是：人的生殖細(xì)胞具端粒酶的活力，體細(xì)胞則否。這一問題的解決無疑會(huì)有助于對生命衰老的認(rèn)識(shí)。

缺乏端粒酶活性時(shí)，細(xì)胞分裂將端粒不斷縮短，引起細(xì)胞生31

端粒和端粒酶的發(fā)現(xiàn)歷程——記諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)諾貝爾獎(jiǎng)主頁上介紹她/他們獲獎(jiǎng)的原因是揭示了“howchromosomesareprotectedbytelomeresandtheenzymetelomerase”（染色體是如何被端粒和端粒酶保護(hù)的）

端粒和端粒酶的發(fā)現(xiàn)歷程——記諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)諾貝爾獎(jiǎng)主32

p373

p37333

34真核和原核DNA細(xì)胞復(fù)制比較

拓?fù)涿窪NA復(fù)制后DNA超螺旋裝配成染色體真核和原核DNA細(xì)胞復(fù)制比較35小結(jié)：一、半不連續(xù)合成在DNA復(fù)制過程中，一條鏈?zhǔn)沁B續(xù)合成的，而另一條鏈?zhǔn)遣贿B續(xù)合成。體內(nèi)僅含催化5’3’合成的DNA酶。60年代岡琦片段的發(fā)現(xiàn)解決了這個(gè)問題：合成5’3’前導(dǎo)鏈（leadingstrand）是連續(xù)的，方向與復(fù)制叉一致。合成3’

5’隨從鏈時(shí)，方向與叉相反，合成不連續(xù)，各片段連成一條鏈。小結(jié)：在DNA復(fù)制過程中，一條鏈?zhǔn)沁B續(xù)合成的，而另36二、復(fù)制過程和參與酶及因子（一）復(fù)制的起始（分兩步）1、螺旋的松弛與解鏈（1）拓?fù)洚悩?gòu)酶---能改變DNA空間構(gòu)型的酶作用：DNA復(fù)制時(shí)松弛超螺旋，以利復(fù)制叉的行進(jìn)及DNA合成，合成后再引向超螺旋。功能：不清楚，可催化體外拓?fù)洚悩?gòu)化反應(yīng)，分兩型。二、復(fù)制過程和參與酶及因子37拓?fù)洚悩?gòu)酶I

（topoisomerase--I）作用：松弛超螺旋，不需ATP,

機(jī)制：切開環(huán)狀一條鏈打結(jié)與解結(jié)環(huán)狀雙鏈DNA的合成環(huán)連與解環(huán)連原核：對負(fù)超螺旋正真核：對正、負(fù)均有作用。拓?fù)洚悩?gòu)酶II----旋轉(zhuǎn)酶（gyrase）作用：松弛超螺旋松+ATP

超（-）切開環(huán)狀兩條鏈打結(jié)與解結(jié)環(huán)連與解環(huán)連拓?fù)洚悩?gòu)酶I（topoisomerase--I）作38（2）解鏈酶（helicase）------復(fù)制蛋白rep作用：ATP供能時(shí)，解開DNA雙鏈。原核：編碼解鏈酶的基因是dnaB,DnaB表示蛋白產(chǎn)物。前導(dǎo)鏈結(jié)合rep蛋白，隨從鏈結(jié)合解鏈酶IIⅢ。（3）單鏈結(jié)合蛋白-singlestrandbindingprotein-SSB作用：SSB與解開DNA單鏈結(jié)合，保護(hù)穩(wěn)定DNA。與新復(fù)制DNA單鏈結(jié)合，以防降解。超螺旋DNA拓?fù)涿杆沙诮怄溍附忾_雙鏈

SSB復(fù)制開始生物化學(xué)課件第六章核酸化學(xué)代謝DNA合成392、引發(fā)（需引發(fā)酶及引發(fā)前體參與）（1）引物酶（primase）作用：以DNA為模板，自5’3’合成RNA小片段,3’末端為-OH，長短：十幾到幾十個(gè)核苷酸。原核：dnaG基因編碼DnaG蛋白即引物酶。（2）引發(fā)前體（preprimosome）由多種蛋白因子組成復(fù)合物。作用：合成RNA引物，沿隨從鏈復(fù)制叉的行進(jìn)方向移動(dòng)，在不同部位，合成RNA引物?？偨Y(jié)：合成RNA引物，在引物3’-OH末段進(jìn)行DNA片段合成。（二）DNA鏈的延長反應(yīng)體系：DNA模板，DNA聚合酶，

dNTP，引物，Mg2+離子

2、引發(fā)（需引發(fā)酶及引發(fā)前體參與）40過程：引物3’-OHdNTPppi引物-dNMP反應(yīng)式：DNA+dNTP（DNA）n+1+ppi反應(yīng)機(jī)理：磷親核攻擊。真核與原核中DNA聚合酶有幾種類型，作用方式相同，但各具特性及功能。1、大腸桿菌DNA聚合酶（3種）（1）pol：催化5’3’的聚合作用，合成20個(gè)核苷酸即離開模板，填充空隙。有3’5’外切酶活性，去除錯(cuò)誤堿基的校對作用。有5’3’外切酶活性，去除RNA引物及修正錯(cuò)誤堿基。（2）pol：5’3’DNA合成及3’5’外切酶活性，體內(nèi)功能不清楚。（3）polⅢ:DNA鏈延長起主要作用，細(xì)菌中1000個(gè)dNTP/秒加入。3’5’外切酶活性，校對作用，與pol配合錯(cuò)誤率降至10-6。（4）DNA復(fù)制的保真性：過程：引物3’-OHdNTPppi引物-41Pol:與引發(fā)酶配合，參與隨從鏈的合成。RFA(replicationfactorA):DNA延長中RFA與單鏈結(jié)合起到SSB的作用。（三）終止

連接酶：作用--使相鄰的DNA片段,以3’5’磷酸二酯鍵相連，需ATP。

前導(dǎo)鏈?zhǔn)沁B續(xù)合成的，隨從鏈在連接酶作用下連成一條鏈。

拓?fù)涿窪NA復(fù)制后DNA超螺旋裝配成染色體2、真核生物DNApol特性與大腸桿菌相似，共五種：pol：催化前導(dǎo)鏈及隨從連的合成，需增殖細(xì)胞核抗原蛋白PCNA（proliferatatingcellnucleusantigen-PCNA）的參與。Pol:與引發(fā)酶配合，參與隨從鏈的合成。42二、

逆轉(zhuǎn)錄作用1、概念2、逆轉(zhuǎn)錄酶3、逆轉(zhuǎn)錄的生物學(xué)意義擴(kuò)充了中心法則有助于對病毒致癌機(jī)制的了解與真核細(xì)胞分裂和胚胎發(fā)育有關(guān)逆轉(zhuǎn)錄酶是分子生物學(xué)重要工具酶三種功能依賴RNA的DNA聚合酶活力

以RNA為模板合成DNA，這與通常轉(zhuǎn)錄過程中遺傳信息從DNA到RNA的方向相反，故稱為逆轉(zhuǎn)錄作用。P276核糖核酸酶H活力：水解RNA-DNA分子中RNA；具有

3’--5’和5’--3’核酸外切酶作用依賴DNA指導(dǎo)下的DNA聚合酶活力二、逆轉(zhuǎn)錄作用1、概念2、逆轉(zhuǎn)錄酶3、逆轉(zhuǎn)錄的生物43逆轉(zhuǎn)錄過程中cDNA的合成

依賴RNA的DNA聚合酶核糖核酸酶H活力水解RNA依賴DNA的DNA聚合酶逆轉(zhuǎn)錄過程中cDNA的合成

依賴RNA的DNA聚合酶核糖核44

反轉(zhuǎn)錄酶病毒（retrovirus）

性質(zhì)：一類RNA病毒，含反轉(zhuǎn)錄酶，因致癌又稱RNA腫瘤病毒。

組成：核心RNA，蛋白外殼。

病毒生活周期：早、晚兩期早期：進(jìn)入細(xì)胞后放出病毒RNADNA整合進(jìn)宿主染色體。晚期：轉(zhuǎn)錄和翻譯。HIV-人類免疫缺陷病毒：感染人T4淋巴細(xì)胞,使病人喪失免疫能力,死于感染。不與外界接觸的胸腺、骨髓、脾臟、扁桃腺及淋巴結(jié)等稱內(nèi)分泌淋巴系統(tǒng)。胸腺位于胸骨后，能生產(chǎn)淋巴細(xì)胞（T細(xì)胞），能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，調(diào)動(dòng)吞噬細(xì)胞等包圍、吞噬并將病原菌消滅。

反轉(zhuǎn)錄酶病毒（retrovirus）45逆逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活周期生活周期RNA衣殼被膜逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)譯整合入宿主細(xì)胞染色體DNA進(jìn)入細(xì)胞丟失被膜丟失衣殼逆轉(zhuǎn)錄RNARNAcDNA衣殼蛋白被膜蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶逆逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活周期生活周期RNA衣殼被膜逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)譯46三、

DNA的損傷與修復(fù)

某些物理化學(xué)因子，如紫外線、電離輻射和化學(xué)誘變劑等，都有引起生物突變和致死的作用，其機(jī)理是作用于DNA，造成DNA結(jié)構(gòu)和功能的破壞，稱為DNA的損傷.DNA的修復(fù)主要有以下類型:暗修復(fù)1、光裂合酶修復(fù)2、切除修復(fù)3、重組修復(fù)三、DNA的損傷與修復(fù)某些物理化學(xué)因47DNA紫外線損傷的光裂合酶修復(fù)1、形成嘧啶二聚體2、光復(fù)合酶結(jié)合于損傷部位3、酶被可見光激活4、修復(fù)后酶被釋放DNA紫外線損傷的光裂合酶修復(fù)1、形成嘧啶二聚體2、光復(fù)合酶48DNA的損傷和切除修復(fù)堿基丟失堿基缺陷或錯(cuò)配結(jié)構(gòu)缺陷切開核酸內(nèi)切酶核酸外切酶切除DNA聚合酶DNA連接酶核酸內(nèi)切酶核酸外切酶切開切除修復(fù)連接糖苷酶插入酶堿基取代DNA的損傷和切除修復(fù)堿基丟失堿基缺陷或錯(cuò)配結(jié)構(gòu)缺陷切開核酸49DNA的重組修復(fù)胸腺嘧啶二聚體復(fù)制核酸酶及重組蛋白修復(fù)復(fù)制DNA聚合酶DNA連接酶重組DNA的重組修復(fù)胸腺嘧啶二聚體復(fù)制核酸酶及重組蛋白修復(fù)復(fù)制D50

四、DNA的突變

DNA分子中的核苷酸序列發(fā)生突然而穩(wěn)定的改變，從而導(dǎo)致DNA的復(fù)制以及后來的轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)物隨之發(fā)生變化，表現(xiàn)出異常的遺傳特性，稱為DNA的突變。它包括由于DNA損傷和錯(cuò)配得不到修復(fù)而引起的突變，以及由于不同DNA分子之間的交換而引起的遺傳重組。（一）突變的類型

堿基對的置換(substitution)

移碼突變(framesshiftmutation)四、DNA的突變

DNA分子中的核苷酸序列51

DNA突變的類型

-T-C-T-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-A-C-G-A-C-A-T-G-C-轉(zhuǎn)換野生型基因

-T-C-G-A-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-T-G-A-C-A-T-G-C-

-T-C-T-T-C-T-G-T-A-C-G--A-G-A-A-G-A-C-A-T-G-C-顛換堿基對的置換(substitution)移碼突變(framesshiftmutation)

-T-C-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-插入

-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-缺失AT嘧啶間、嘌呤間嘧啶與嘌呤間DNA突變的類型

-T-C-T-G-C-T-G-T-A-52

（二）突變的意義1、進(jìn)化、分化的分子基礎(chǔ)。2、基因型改變。（表型不變）3、致死性的突變。（消滅病原體）4、某些疾病的發(fā)病基礎(chǔ)。（三）誘變劑堿基類似物(baseanalog)

堿基修飾劑(basemodifier)嵌入染料(intercalationdye)

紫外線(ultraviolet)和電離輻射(ionizingradiation)

（二）突變的意義（三）誘變劑53

54

55

第七節(jié)DNA的生物合成（復(fù)制）

DNAReplicationP361

第七節(jié)DNA的生物合成（復(fù)制）

DNAReplica56

DNA是絕大多數(shù)生物體遺傳信息的載體，繼1953年Watson&Crick提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型后，1958年Crick提出了“中心法則”(Centraldogma)揭示了遺傳信息的傳遞規(guī)律。DNARNA蛋白質(zhì)復(fù)制復(fù)制轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄翻譯遺傳信息傳遞的中心法則病毒

DNA是絕大多數(shù)生物體遺傳信息的載體，繼1957DNA的生物合成：細(xì)胞內(nèi)合成DNA的過程1、復(fù)制：以DNA作為模板指導(dǎo)的DNA合成，即將DNA攜帶的信息傳至子代DNA。

四種核苷酸（dATP\dTTP\dCTP\dGTP）

2、反轉(zhuǎn)錄：DNA合成也可以RNA為模扳指導(dǎo)合成作用，見于RNA病毒。3、修復(fù)合成：當(dāng)各種因素引起DNA損傷時(shí)，損傷DNA可修復(fù)合成，校正錯(cuò)誤，完成正確合成，以保持DNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和遺傳信息的準(zhǔn)確性。DNA的生物合成：細(xì)胞內(nèi)合成DNA的過程581、DNA的半保留復(fù)制

DNA在復(fù)制時(shí)，兩條鏈解開分別作為模板，在DNA聚合酶的催化下按堿基互補(bǔ)的原則合成兩條與模板鏈互補(bǔ)的新鏈，以組成新的DNA分子。這樣新形成的兩個(gè)DNA分子與親代DNA分子的堿基順序完全一樣。由于子代DNA分子中一條鏈來自親代，另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻模@種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制。一、DNA復(fù)制1、DNA的半保留復(fù)制

DNA在復(fù)制時(shí)，兩條59DNA的半保留復(fù)制實(shí)驗(yàn)依據(jù)

1958年M.Meselson和F.W.Stahl用大腸桿菌為材料，在含15N和14N的NH4cl中培養(yǎng)證實(shí)，用同位素示蹤標(biāo)記加密度梯度離心技術(shù)實(shí)驗(yàn),證明了DNA是采取半保留的方式進(jìn)行復(fù)制.[15N]DNA[14N-15N]DNA[14N]DNA[14N-15N]DNADNA在離心管中的沉降位置P361培養(yǎng)12代培養(yǎng)1代培養(yǎng)2代DNA的半保留復(fù)制實(shí)驗(yàn)依據(jù)1958年M.Mesels602、原核生物DNA聚合反應(yīng)有關(guān)的酶類

（1）DNA聚合酶(DNApolymetases)（2）引物酶(peimase)和引發(fā)體primosome

：啟動(dòng)RNA引物鏈的合成。

(3）DNA連接酶（DNAligas（4）DNA解鏈酶：ATP供能解開DNA雙鏈(5）單鏈結(jié)合蛋白(single-strandbindingprotein,SSB)：結(jié)合在解開的DNA單鏈上，防止重新形成雙螺旋。

(6）拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoisomerase):兼具內(nèi)切酶和連接酶活力，能迅速將DNA超螺旋或雙螺旋緊張狀態(tài)變成松馳狀態(tài)，便于解鏈。能改變DNA空間構(gòu)型的酶，合成后再引向超螺旋。機(jī)制：切開環(huán)狀一條鏈解旋酶DNA聚合酶III解鏈酶RNA引物引物酶和引發(fā)體DNA聚合酶ISSB3′3′5′3′5′5′RNA引物2、原核生物DNA聚合反應(yīng)有關(guān)的酶類

（1）DNA聚合酶(D61（1）DNA聚合酶催化的鏈延長反應(yīng)5′RNA引物子鏈3′3′5′5′3′3′5′5′3′3′5′模板鏈只能加到已有核苷酸的游離3’羥基上，不能自身聚合，需引物p363（1）DNA聚合酶催化的鏈延長反應(yīng)5′RNA引物子鏈3′3′62大腸桿菌三種DNA聚合酶比較DNA聚合酶Ⅱ分子量每個(gè)細(xì)胞的酶分子統(tǒng)計(jì)數(shù)5′-3′聚合酶作用3′-5′核酸外切酶作用5′-3′核酸外切酶作用聚合速率（nt/s）DNA聚合酶Ⅰ109000單鏈多肽400+++16-20120000單鏈多肽100++-40400，000（10種亞基）10-20++-250-1000比較項(xiàng)目DNA聚合酶III切除引物,校對，修復(fù)修復(fù)復(fù)制功能

1999年發(fā)現(xiàn)聚合酶和，它們涉及DNA的錯(cuò)誤傾向修復(fù)（erroounerepair）P364大腸桿菌三種DNA聚合酶比較DNA分子量DNA109000單63DNA聚合酶的3′-5′外切酶水解位點(diǎn)（I、II、III）3′3′5′5′錯(cuò)配堿基3′-5′核酸外切酶水解位點(diǎn)DNA聚合酶的3′-5′外切酶水解位點(diǎn)（I、II、III）64DNA聚合酶5′-3′外切酶活力（I）

5′-3′核酸外切酶水解位點(diǎn)單鏈缺口5′切除引物,修復(fù)DNA聚合酶5′-3′外切酶活力（I）

5′-3′核酸外65大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ全酶的結(jié)構(gòu)和功能（10個(gè)亞基）延長因子DNA聚合酶Ⅲ兩個(gè)亞基夾住DNA核心酶校對引物的結(jié)合和識(shí)別促使核心酶二聚化組建核心酶P364大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ全酶的結(jié)構(gòu)和功能（10個(gè)亞基）66圖11-8DNAPolIII的二聚體作用生物化學(xué)課件第六章核酸化學(xué)代謝DNA合成67（2）連接酶連接切口Mg2+連接酶ATP（噬菌體和動(dòng)物）或NADH（細(xì)菌）AMP+PPiATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPPOHTGGATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGP缺口3'3'5'5'5'5'3'3'模板鏈模板鏈DNA復(fù)制、損傷修復(fù)、重組P367（2）連接酶連接切口Mg2+連接酶ATP（噬菌體和動(dòng)物）AM683、原核細(xì)胞DNA的半不連續(xù)復(fù)制復(fù)制過程

semidiscontinuousreplication

P3683、原核細(xì)胞DNA的半不連續(xù)復(fù)制P36869（1）復(fù)制的起始點(diǎn)與方向

親代DNA開鏈，復(fù)制起始點(diǎn)呈叉型移動(dòng)?！褟?fù)制起始點(diǎn)：DNA復(fù)制要從DNA分子的特定部位開始，此部位稱復(fù)制起始點(diǎn)。原核：僅含一個(gè)，約245bp,特殊的重復(fù)序列。真核：多個(gè)起始點(diǎn)例：酵母17號(hào)染色體含400個(gè)。⊙復(fù)制方向：含三種機(jī)制一個(gè)起點(diǎn)2個(gè)叉，不同方向合成兩條鏈，此為常見方式。2個(gè)起點(diǎn)，2個(gè)叉，各合一條鏈（腺病毒）。一個(gè)起點(diǎn)一個(gè)叉，同方向合成兩條鏈（質(zhì)粒ColEI）--單向復(fù)制（1）復(fù)制的起始點(diǎn)與方向70DNA的雙向和單向復(fù)制----起始環(huán)狀

DNA復(fù)制時(shí)所形成的O結(jié)構(gòu)起始點(diǎn)復(fù)制叉的推進(jìn)復(fù)制叉起始點(diǎn)起始點(diǎn)起始點(diǎn)復(fù)制叉復(fù)制叉未復(fù)制DNA單向復(fù)制雙向復(fù)制DNA的雙向和單向復(fù)制----起始環(huán)狀DNA復(fù)制時(shí)所形成的71大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)成串排列的重復(fù)序列

GATCTNTTNTTT成串排列的三個(gè)13bp序列共有序列共有序列TTATCCACA

DnaA蛋白結(jié)合位點(diǎn)四個(gè)9bp序列DnaB(解螺旋酶)SSB大腸桿菌DNA復(fù)制起點(diǎn)在起始階段的結(jié)構(gòu)模型DnaA識(shí)別起始點(diǎn)在復(fù)制起點(diǎn)特異部位解開雙鏈DNAP368大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)成串排列的重復(fù)序列

GATCTNTTNTTT72（2）原核細(xì)胞DNA的半不連續(xù)復(fù)制復(fù)制過程

復(fù)制叉的移動(dòng)方向解旋酶解鏈酶RNA引物引物體DNA聚合酶ISSB3′3′5′前導(dǎo)鏈隨后鏈3′5′復(fù)制的起始DNA鏈的延長DNA鏈終止5′RNA引物3′3′P369,393,274DNA聚合酶III切除引物、缺口填補(bǔ)、校對（2）原核細(xì)胞DNA的半不連續(xù)復(fù)制復(fù)制過程

復(fù)制叉的移動(dòng)方向73聚合酶III核心酶大腸桿菌復(fù)制體結(jié)構(gòu)示意圖聚合酶I聚合酶III核心酶滯后鏈前導(dǎo)鏈解螺旋酶引物合成酶RNA引物引發(fā)體拓?fù)洚悩?gòu)酶II-夾子-聚體-夾子-復(fù)合物RNA引物單鏈結(jié)合蛋白（SSB）活化引物合成酶P370聚合酶III核心酶大腸桿菌復(fù)制體結(jié)構(gòu)示意圖聚合酶I聚合酶II74復(fù)制叉處前導(dǎo)鏈和隨后鏈同時(shí)合成的工作模型聚合酶III全酶引物聚合酶III全酶引物引物體引物體解旋酶解旋酶引物合成酶DnaG蛋白前導(dǎo)鏈和隨后鏈被同一個(gè)DNA聚合酶III不對稱二聚體合成復(fù)制叉處前導(dǎo)鏈和隨后鏈同時(shí)合成的工作模型聚合酶III全酶引物75（3）大腸桿菌染色體復(fù)制的終止oric復(fù)制叉2復(fù)制叉1終止復(fù)制叉2終止復(fù)制叉1復(fù)制叉1復(fù)制叉2完成復(fù)制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶連鎖體終止子位點(diǎn)連鎖體在細(xì)胞分裂前必須解開，否則導(dǎo)致細(xì)胞分裂失敗，細(xì)胞死亡。兩個(gè)復(fù)制叉從起始反向移動(dòng)至約180O的對面終止區(qū)相遇（3）大腸桿菌染色體復(fù)制的終止oric復(fù)制叉2復(fù)制叉1終止76（4）復(fù)制的忠實(shí)性

DNA復(fù)制過程是一個(gè)高度精確的過程，據(jù)估計(jì)，大腸桿菌DNA復(fù)制5X109堿基對僅出現(xiàn)一個(gè)誤差，保證復(fù)制忠實(shí)性的原因主要有以下三點(diǎn):

DNA聚合酶的高度專一性（嚴(yán)格遵循堿基配對原則，但錯(cuò)配率為7

X10-6

）

DNA聚合酶的校對功能（錯(cuò)配堿基被3’-5’

外切酶切除）起始時(shí)以RNA作為引物P374（4）復(fù)制的忠實(shí)性DNA復(fù)制過程是一個(gè)高度精77DNA聚合酶的校對功能聚合酶錯(cuò)配鹼基復(fù)制方向正確核苷酸5′5′5′3′3′3′切除錯(cuò)配核苷酸DNA聚合酶的校對功能聚合酶錯(cuò)配鹼基復(fù)制方向正確核苷酸5′78

起始時(shí)以RNA作為引物的作用

DNA復(fù)制為什么要合成一個(gè)RNA引物，而后又把這個(gè)引物消除呢？這是保證DNA聚合過程高度精確的又一措施。已知DNA聚合酶具有3’-5’外切酶功能校對復(fù)制過程中的核苷酸，也就是說聚合酶在開始形成一個(gè)新的磷酸二酯鍵前，總是檢查前一個(gè)堿基是否正確，這就決定了它不能從頭開始合成。因此先合成一條低忠實(shí)性的多核苷酸來開始DNA的合成，并以核糖核苷酸來表示是“暫時(shí)”的，當(dāng)DNA開始聚合以后再以5’-3’外切酶的功能切除，以高忠實(shí)性的脫氧核苷酸取而代之，確保復(fù)制的忠實(shí)性。（RNA聚合酶無校對功能，不需引物，可以從頭合成）

起始時(shí)以RNA作為引物的作用

DNA復(fù)制為794、真核生物復(fù)制的特點(diǎn)（1）復(fù)制速度：是原核的1/10，但復(fù)制起始點(diǎn)多。（2）引物和岡琦片段小于原核，引物為10個(gè)，片段100~200；原核引物十幾~幾十，片段1000~2000。（3）復(fù)制需DNApol及多種因子參加，pol

pol在核內(nèi)起主要作用。（4）pol為線粒體復(fù)制酶。（5）DNA復(fù)制位于細(xì)胞周期的S期。4、真核生物復(fù)制的特點(diǎn)80真核細(xì)胞DNA復(fù)制的特點(diǎn)多個(gè)起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn)起點(diǎn)起點(diǎn)起點(diǎn)起點(diǎn)起點(diǎn)真核生物DNA聚合酶端粒（telemere）的復(fù)制真核細(xì)胞DNA復(fù)制的特點(diǎn)多個(gè)起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn)起點(diǎn)起點(diǎn)起點(diǎn)起點(diǎn)81真核生物的DNA聚合酶DNA聚合酶分子量亞基數(shù)細(xì)胞內(nèi)分布酶活力百分比外切酶活力DNA聚合酶110-23，000多個(gè)細(xì)胞核～80%無120，000二個(gè)細(xì)胞核和線粒體2～15%3-5外切酶400，000二個(gè)細(xì)胞核+10～25%3-5外切酶DNA聚合酶DNA聚合酶45，000一個(gè)細(xì)胞核10～15%無核DNA合成線粒體DNA合成引物合成

修復(fù)功能真核生物的DNA聚合酶DNA分子量DNA110-23，00082

真核生物DNA復(fù)制與核小體裝配同步進(jìn)行，復(fù)制完成后隨即組合成染色體并從G2期過渡到M期。染色體DNA是線性結(jié)構(gòu)。染色體兩端DNA子鏈上最后復(fù)制的RNA引物，去除后留下空隙。剩下的DNA單鏈母鏈如果不填補(bǔ)成雙鏈，就會(huì)被核內(nèi)Dnase酶解。某些低等生物染色體經(jīng)多次復(fù)制會(huì)越來越短。

真核生物DNA復(fù)制與核小體裝配同步進(jìn)行，復(fù)制完成后83端粒端粒：真核生物線性染色體的兩個(gè)末端具有特殊結(jié)構(gòu)稱為端粒。端粒由許多成串的短的重復(fù)序列組成。一條鏈上富含G，如人的端粒TTAGGG，原生動(dòng)物四膜蟲為TTGGGG,植物

TTTAGGG。端粒的功能：穩(wěn)定染色體末端結(jié)構(gòu)，防止末端染色體降解；防止染色體間末端連接。（原核生物染色體是環(huán)狀的，5′末端岡奇片段的RNA引物被除去后可借助另半圈DNA鏈向前延伸填補(bǔ)。）端粒84端粒酶（telomerase）DNA復(fù)制需要引物，但在線形DNA分子末端不可能通過正常的機(jī)制在引物被降解后合成相應(yīng)的片段.如果沒有特殊的機(jī)制合成末端序列，染色體就會(huì)在細(xì)胞傳代中變得越來越短。這一難題是通過端粒酶的發(fā)現(xiàn)才得到了澄清。

端粒酶是一種含RNA的蛋白復(fù)合物，實(shí)質(zhì)上是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，它以自身攜帶的RNA為模板，催化互補(bǔ)鏈DNA片段的合成，使復(fù)制以后的線形DNA分子的末端保持不變。

端粒酶含150個(gè)堿基RNA鏈。端粒酶結(jié)合到端粒的3′末端上，以RNA鏈5′末端識(shí)別DNA3′末端并合成互補(bǔ)鏈，端粒3′單鏈末端回折作為引物合成其互補(bǔ)鏈。端粒酶（telomerase）DNA復(fù)制需要引物85

缺乏端粒酶活性時(shí)，細(xì)胞分裂將端粒不斷縮短，引起細(xì)胞生長停止甚至死亡。腫瘤細(xì)胞端?；钚愿?，設(shè)想端粒酶作為抗癌治療的靶位點(diǎn)。5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCA端粒酶

初步研究表明，人體中生殖細(xì)胞的端粒長度保持不變，而體細(xì)胞的端粒長度則隨個(gè)體的老化而逐步縮短。對此的一個(gè)推論是：人的生殖細(xì)胞具端粒酶的活力，體細(xì)胞則否。這一問題的解決無疑會(huì)有助于對生命衰老的認(rèn)識(shí)。

缺乏端粒酶活性時(shí)，細(xì)胞分裂將端粒不斷縮短，引起細(xì)胞生86

端粒和端粒酶的發(fā)現(xiàn)歷程——記諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)諾貝爾獎(jiǎng)主頁上介紹她/他們獲獎(jiǎng)的原因是揭示了“howchromosomesareprotectedbytelomeresandtheenzymetelomerase”（染色體是如何被端粒和端粒酶保護(hù)的）

端粒和端粒酶的發(fā)現(xiàn)歷程——記諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)諾貝爾獎(jiǎng)主87

p373

p37388

89真核和原核DNA細(xì)胞復(fù)制比較

拓?fù)涿窪NA復(fù)制后DNA超螺旋裝配成染色體真核和原核DNA細(xì)胞復(fù)制比較90小結(jié)：一、半不連續(xù)合成在DNA復(fù)制過程中，一條鏈?zhǔn)沁B續(xù)合成的，而另一條鏈?zhǔn)遣贿B續(xù)合成。體內(nèi)僅含催化5’3’合成的DNA酶。60年代岡琦片段的發(fā)現(xiàn)解決了這個(gè)問題：合成5’3’前導(dǎo)鏈（leadingstrand）是連續(xù)的，方向與復(fù)制叉一致。合成3’

5’隨從鏈時(shí)，方向與叉相反，合成不連續(xù)，各片段連成一條鏈。小結(jié)：在DNA復(fù)制過程中，一條鏈?zhǔn)沁B續(xù)合成的，而另91二、復(fù)制過程和參與酶及因子（一）復(fù)制的起始（分兩步）1、螺旋的松弛與解鏈（1）拓?fù)洚悩?gòu)酶---能改變DNA空間構(gòu)型的酶作用：DNA復(fù)制時(shí)松弛超螺旋，以利復(fù)制叉的行進(jìn)及DNA合成，合成后再引向超螺旋。功能：不清楚，可催化體外拓?fù)洚悩?gòu)化反應(yīng)，分兩型。二、復(fù)制過程和參與酶及因子92拓?fù)洚悩?gòu)酶I

（topoisomerase--I）作用：松弛超螺旋，不需ATP,

機(jī)制：切開環(huán)狀一條鏈打結(jié)與解結(jié)環(huán)狀雙鏈DNA的合成環(huán)連與解環(huán)連原核：對負(fù)超螺旋正真核：對正、負(fù)均有作用。拓?fù)洚悩?gòu)酶II----旋轉(zhuǎn)酶（gyrase）作用：松弛超螺旋松+ATP

超（-）切開環(huán)狀兩條鏈打結(jié)與解結(jié)環(huán)連與解環(huán)連拓?fù)洚悩?gòu)酶I（topoisomerase--I）作93（2）解鏈酶（helicase）------復(fù)制蛋白rep作用：ATP供能時(shí)，解開DNA雙鏈。原核：編碼解鏈酶的基因是dnaB,DnaB表示蛋白產(chǎn)物。前導(dǎo)鏈結(jié)合rep蛋白，隨從鏈結(jié)合解鏈酶IIⅢ。（3）單鏈結(jié)合蛋白-singlestrandbindingprotein-SSB作用：SSB與解開DNA單鏈結(jié)合，保護(hù)穩(wěn)定DNA。與新復(fù)制DNA單鏈結(jié)合，以防降解。超螺旋DNA拓?fù)涿杆沙诮怄溍附忾_雙鏈

SSB復(fù)制開始生物化學(xué)課件第六章核酸化學(xué)代謝DNA合成942、引發(fā)（需引發(fā)酶及引發(fā)前體參與）（1）引物酶（primase）作用：以DNA為模板，自5’3’合成RNA小片段,3’末端為-OH，長短：十幾到幾十個(gè)核苷酸。原核：dnaG基因編碼DnaG蛋白即引物酶。（2）引發(fā)前體（preprimosome）由多種蛋白因子組成復(fù)合物。作用：合成RNA引物，沿隨從鏈復(fù)制叉的行進(jìn)方向移動(dòng)，在不同部位，合成RNA引物?？偨Y(jié)：合成RNA引物，在引物3’-OH末段進(jìn)行DNA片段合成。（二）DNA鏈的延長反應(yīng)體系：DNA模板，DNA聚合酶，

dNTP，引物，Mg2+離子

2、引發(fā)（需引發(fā)酶及引發(fā)前體參與）95過程：引物3’-OHdNTPppi引物-dNMP反應(yīng)式：DNA+dNTP（DNA）n+1+ppi反應(yīng)機(jī)理：磷親核攻擊。真核與原核中DNA聚合酶有幾種類型，作用方式相同，但各具特性及功能。1、大腸桿菌DNA聚合酶（3種）（1）pol：催化5’3’的聚合作用，合成20個(gè)核苷酸即離開模板，填充空隙。有3’5’外切酶活性，去除錯(cuò)誤堿基的校對作用。有5’3’外切酶活性，去除RNA引物及修正錯(cuò)誤堿基。（2）pol：5’3’DNA合成及3’5’外切酶活性，體內(nèi)功能不清楚。（3）polⅢ:DNA鏈延長起主要作用，細(xì)菌中1000個(gè)dNTP/秒加入。3’5’外切酶活性，校對作用，與pol配合錯(cuò)誤率降至10-6。（4）DNA復(fù)制的保真性：過程：引物3’-OHdNTPppi引物-96Pol:與引發(fā)酶配合，參與隨從鏈的合成。RFA(replicationfactorA):DNA延長中RFA與單鏈結(jié)合起到SSB的作用。（三）終止

連接酶：作用--使相鄰的DNA片段,以3’5’磷酸二酯鍵相連，需ATP。

前導(dǎo)鏈?zhǔn)沁B續(xù)合成的，隨從鏈在連接酶作用下連成一條鏈。

拓?fù)涿窪NA復(fù)制后DNA超螺旋裝配成染色體2、真核生物DNApol特性與大腸桿菌相似，共五種：pol：催化前導(dǎo)鏈及隨從連的合成，需增殖細(xì)胞核抗原蛋白PCNA（proliferatatingcellnucleusantigen-PCNA）的參與。Pol:與引發(fā)酶配合，參與隨從鏈的合成。97二、

逆轉(zhuǎn)錄作用1、概念2、逆轉(zhuǎn)錄酶3、逆轉(zhuǎn)