生化試驗(yàn)課件實(shí)驗(yàn)八：質(zhì)粒提取與瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)八質(zhì)粒提取與電泳ExtractionandIdentificationofRecombinantPlasmid劉向華南京醫(yī)科大學(xué)生化與分子生物學(xué)系NanjingmedicaluniversityDepartmentofbiochemistryandmolecularbiology實(shí)驗(yàn)八劉向華1實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)堿裂解法提取質(zhì)粒的原理2、學(xué)習(xí)DNA瓊脂糖凝膠電泳的原理和方法3、掌握質(zhì)粒提取及鑒定的基本操作實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)堿裂解法提取質(zhì)粒的原理2實(shí)驗(yàn)原理質(zhì)粒(Plasmid)

是細(xì)菌染色體外的遺傳物質(zhì)，為環(huán)形閉合的雙股DNA。質(zhì)粒具有可自主復(fù)制、傳給子代、也可丟失及在細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移等特性，與細(xì)菌的遺傳變異有關(guān)。

在基因工程中質(zhì)粒常被用做基因的載體。

實(shí)驗(yàn)原理質(zhì)粒(Plasmid)3DNA瓊脂糖凝膠電泳：電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)核酸從負(fù)極向正極泳動(dòng)，小分子泳動(dòng)速度較快質(zhì)粒DNA較染色體DNA小，且具有超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的特點(diǎn)。pH調(diào)至中性，變性的質(zhì)粒DNA恢復(fù)到原來(lái)的構(gòu)型，而染色體DNA不能復(fù)性，與蛋白質(zhì)一起沉淀。堿變性條件下,染色體DNA雙螺旋解開(kāi)而變性，而質(zhì)粒DNA部分解開(kāi),雙鏈不會(huì)完全分離。DNA瓊脂糖凝膠電泳：質(zhì)粒DNA較染色體DN4實(shí)驗(yàn)步驟取1.5ml菌液，9000rpm離心30秒，盡可能的倒干上清。用250μl溶液P1重懸菌體沉淀，槍頭反復(fù)抽吸至菌體徹底懸浮。P1：葡萄糖：制造低滲環(huán)境，增加細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性；增加溶液的粘稠度，使懸浮后的大腸桿菌不會(huì)快速沉底。EDTA：螯合核酸酶加250μl溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)10次使菌體充分裂解至清亮。P2：NaOH/SDS溶液，是最佳的溶解細(xì)胞的試劑。NaOH使DNA變性，SDS使蛋白質(zhì)變性。染色體與蛋白質(zhì)纏繞。加400μl溶液P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)10次，放置5min。13000rpm離心10min，小心取上清。P3：醋酸/醋酸鉀溶液，使溶液pH值恢復(fù)接近中性。此時(shí)質(zhì)粒DNA復(fù)性，而染色體DNA難以復(fù)性。SDS遇到K+變成十二烷基硫酸鉀，不溶于水，連同結(jié)合的蛋白質(zhì)和纏繞其上的染色體DNA共同沉淀。實(shí)驗(yàn)步驟取1.5ml菌液，9000rpm離心30秒，盡5加500μl去蛋白液PE，13000rpm離心60sec，棄濾液。加500μl漂洗液WB，13000rpm離心60sec，棄濾液。（重復(fù)一遍）取出吸附柱，放入干凈離心管中，在吸附膜中間部位加40μl洗脫緩沖液EB，放置1min，13000rpm離心1min洗脫DNA，-20℃保存?？罩?3000rpm離心2min。敞口放置3min，除去殘留乙醇。將上清液加入吸附柱中，13000rpm離心1min，棄濾液。注意：吸附柱使用前需先處理。將吸附柱置于收集管上，加500μl溶液P4，13000rpm離心1min，棄濾液。P4：緩沖液，濕潤(rùn)、平衡吸附膜加500μl去蛋白液PE，13000rpm離心60sec，棄6加250μl溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6~10次使菌體充分裂解，至溶液變清亮。取1.5ml菌液，9000rpm離心30秒，盡可能的倒干上清。用250μl溶液P1重懸菌體沉淀，槍頭反復(fù)抽吸至菌體徹底懸浮。加400μl溶液P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6~10次，放置5min。13000rpm離心10min，小心取上清。吸附柱置于收集管上，加500μl溶液P4，13000rpm離心1min，棄濾液。加500μl去蛋白液PE，13000rpm離心30~60sec，棄濾液。加500μl漂洗液WB，13000rpm離心30~60sec，棄濾液。（重復(fù)一次）取出吸附柱，放入干凈離心管中，在吸附膜中間部位加40μl洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在65~70℃水浴中加熱效果更好），放置1min，13000rpm離心1min洗脫DNA，-20℃保存?？罩?3000rpm離心2min。放置3~5min，除去殘留乙醇。將上清液加入吸附柱中，13000rpm離心1min，棄濾液。加250μl溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6~10次使菌體充分裂解7瓊脂糖凝膠電泳樣品：10μl質(zhì)粒樣品+2μl上樣緩沖液，混勻電泳：90~120mA，電泳20~40分鐘配膠：瓊脂糖凝膠粉，溶于TBE緩沖液中，配成1%~1.2%的瓊脂糖凝膠上樣：將樣品用微量移液器加入凝膠孔中瓊脂糖凝膠電泳樣品：10μl質(zhì)粒樣品+2μl上樣緩沖82000bp1000bp750bp500bp250bp100bpMarkerPEP－＋實(shí)驗(yàn)結(jié)果2000bp1000bp750bp500bp250bp109負(fù)極正極負(fù)極正極10注意事項(xiàng)1、注意無(wú)菌操作，避免細(xì)菌污染質(zhì)粒；2、瓊脂糖凝膠的配制、使用過(guò)程中用到溴化乙錠(EB)是強(qiáng)誘變劑，具有高致癌性，注意自我防護(hù)；3、所有接觸到瓊脂糖凝膠的器械均須專用；4、制備質(zhì)粒過(guò)程中，操作必須緩和，不可劇烈蕩，避免機(jī)械剪切力對(duì)DNA的斷裂作用。注意事項(xiàng)1、注意無(wú)菌操作，避免細(xì)菌污染質(zhì)粒；11超凈工作臺(tái)超凈工作臺(tái)12開(kāi)始實(shí)驗(yàn)開(kāi)始實(shí)驗(yàn)13實(shí)驗(yàn)八質(zhì)粒提取與電泳ExtractionandIdentificationofRecombinantPlasmid劉向華南京醫(yī)科大學(xué)生化與分子生物學(xué)系NanjingmedicaluniversityDepartmentofbiochemistryandmolecularbiology實(shí)驗(yàn)八劉向華14實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)堿裂解法提取質(zhì)粒的原理2、學(xué)習(xí)DNA瓊脂糖凝膠電泳的原理和方法3、掌握質(zhì)粒提取及鑒定的基本操作實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)堿裂解法提取質(zhì)粒的原理15實(shí)驗(yàn)原理質(zhì)粒(Plasmid)

是細(xì)菌染色體外的遺傳物質(zhì)，為環(huán)形閉合的雙股DNA。質(zhì)粒具有可自主復(fù)制、傳給子代、也可丟失及在細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移等特性，與細(xì)菌的遺傳變異有關(guān)。

在基因工程中質(zhì)粒常被用做基因的載體。

實(shí)驗(yàn)原理質(zhì)粒(Plasmid)16DNA瓊脂糖凝膠電泳：電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)核酸從負(fù)極向正極泳動(dòng)，小分子泳動(dòng)速度較快質(zhì)粒DNA較染色體DNA小，且具有超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的特點(diǎn)。pH調(diào)至中性，變性的質(zhì)粒DNA恢復(fù)到原來(lái)的構(gòu)型，而染色體DNA不能復(fù)性，與蛋白質(zhì)一起沉淀。堿變性條件下,染色體DNA雙螺旋解開(kāi)而變性，而質(zhì)粒DNA部分解開(kāi),雙鏈不會(huì)完全分離。DNA瓊脂糖凝膠電泳：質(zhì)粒DNA較染色體DN17實(shí)驗(yàn)步驟取1.5ml菌液，9000rpm離心30秒，盡可能的倒干上清。用250μl溶液P1重懸菌體沉淀，槍頭反復(fù)抽吸至菌體徹底懸浮。P1：葡萄糖：制造低滲環(huán)境，增加細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性；增加溶液的粘稠度，使懸浮后的大腸桿菌不會(huì)快速沉底。EDTA：螯合核酸酶加250μl溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)10次使菌體充分裂解至清亮。P2：NaOH/SDS溶液，是最佳的溶解細(xì)胞的試劑。NaOH使DNA變性，SDS使蛋白質(zhì)變性。染色體與蛋白質(zhì)纏繞。加400μl溶液P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)10次，放置5min。13000rpm離心10min，小心取上清。P3：醋酸/醋酸鉀溶液，使溶液pH值恢復(fù)接近中性。此時(shí)質(zhì)粒DNA復(fù)性，而染色體DNA難以復(fù)性。SDS遇到K+變成十二烷基硫酸鉀，不溶于水，連同結(jié)合的蛋白質(zhì)和纏繞其上的染色體DNA共同沉淀。實(shí)驗(yàn)步驟取1.5ml菌液，9000rpm離心30秒，盡18加500μl去蛋白液PE，13000rpm離心60sec，棄濾液。加500μl漂洗液WB，13000rpm離心60sec，棄濾液。（重復(fù)一遍）取出吸附柱，放入干凈離心管中，在吸附膜中間部位加40μl洗脫緩沖液EB，放置1min，13000rpm離心1min洗脫DNA，-20℃保存?？罩?3000rpm離心2min。敞口放置3min，除去殘留乙醇。將上清液加入吸附柱中，13000rpm離心1min，棄濾液。注意：吸附柱使用前需先處理。將吸附柱置于收集管上，加500μl溶液P4，13000rpm離心1min，棄濾液。P4：緩沖液，濕潤(rùn)、平衡吸附膜加500μl去蛋白液PE，13000rpm離心60sec，棄19加250μl溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6~10次使菌體充分裂解，至溶液變清亮。取1.5ml菌液，9000rpm離心30秒，盡可能的倒干上清。用250μl溶液P1重懸菌體沉淀，槍頭反復(fù)抽吸至菌體徹底懸浮。加400μl溶液P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6~10次，放置5min。13000rpm離心10min，小心取上清。吸附柱置于收集管上，加500μl溶液P4，13000rpm離心1min，棄濾液。加500μl去蛋白液PE，13000rpm離心30~60sec，棄濾液。加500μl漂洗液WB，13000rpm離心30~60sec，棄濾液。（重復(fù)一次）取出吸附柱，放入干凈離心管中，在吸附膜中間部位加40μl洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在65~70℃水浴中加熱效果更好），放置1min，13000rpm離心1min洗脫DNA，-20℃保存?？罩?3000rpm離心2min。放置3~5min，除去殘留乙醇。將上清液加入吸附柱中，13000rpm離心1min，棄濾液。加250μl溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6~10次使菌體充分裂解20瓊脂糖凝膠電泳樣品：10μl質(zhì)粒樣品+2μl上樣緩沖液，混勻電泳：90~120mA，電泳20~40分鐘配膠：瓊脂糖凝膠粉，溶于TBE緩沖液中，配成1%~1.2%的瓊脂糖凝膠上樣：將樣品用微量移液器加入凝膠孔中瓊脂糖凝膠電泳樣品：10μl質(zhì)粒樣品+2μl上樣緩沖212000bp1000bp750bp500bp250bp100bpMarkerPEP－＋實(shí)驗(yàn)結(jié)果2000bp1000bp