檢疫檢驗實驗課件

項目一大學城廣州大學校區(qū)空氣微生物污染調查項目二水、食品中菌落總數(shù)及霉菌酵母總數(shù)檢測項目三水和食品中大腸菌群的檢測項目四食品中金黃色葡萄球菌的檢驗項目五食品中產毒霉菌的分離與鑒定項目六化妝品微生物污染狀況檢測《檢驗檢疫技術實驗》微生物檢驗部分實驗項目實驗一

大學城廣州大學校區(qū)空氣微生物污染調查一、目的要求1、了解大學城空氣中微生物的分布狀況，比較廣州大學校區(qū)不同場所的微生物的污染狀況。2、掌握空氣中細菌總數(shù)的檢測方法。二、實驗原理

當空氣中個體微小的微生物落到適合于它們生長繁殖的固體培養(yǎng)基的表面時，在適當溫度培養(yǎng)一段時間后，每一個分散的菌體就會形成一個個肉眼可見的菌落。檢測空氣中細菌總數(shù)的方法有沉降法、撞擊法等，本實驗采用平皿沉降法。平皿沉降法（平板暴露法）：利用空氣中微生物粒子的重力作用，測定在一定時間內自然沉降于帶有培養(yǎng)基平皿上的細菌。以空氣微生物粒子沉降量近似地判斷空氣被微生物污染的狀況。平皿沉降屬重力沉降,是其中最常用的、最經典的方法,此法只能采集到10um左右的粒子附著于各種塵埃和空氣氣溶膠表面的細菌,不能作精確定量,故平皿沉降法監(jiān)測空氣細菌不是理想的采樣方法,目前國外很少使用.但國標法仍然普遍采用。適合于靜止無風的室內一般環(huán)境中采樣。暴露時間：按測定的環(huán)境空氣清潔程度和測定目的而定。清潔的室內，通常暴露5分鐘。撞擊法：是采用撞擊式空氣微生物采樣器采樣,通過抽氣動力作用,使空氣通過鋏縫或小孔而產生高速氣流,使懸浮在空氣中的帶菌粒子撞擊到營養(yǎng)瓊脂平板上,經37C、48h培養(yǎng)后，計算出每立方米空氣中所含的細菌菌落數(shù)的采樣測定方法。根據(jù)撞擊原理，當氣流以足夠的線速度向固體或半固體表面運動時,氣溶膠粒子可由于慣力撞擊在采樣面上，如果采樣面由培養(yǎng)基構成,可直接培養(yǎng)出各種菌落,并做定量計數(shù),但存在著對空氣較大的粒子捕獲率不高。

三、實驗器材培養(yǎng)皿，移液槍；Tip頭；培養(yǎng)箱；水浴鍋；超凈工作臺；微生物采樣器；高壓蒸汽滅菌鍋等。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基成分（室內空氣2002國標）：

蛋白胨

20g

牛肉浸膏3g

氯化鈉

5g

瓊脂

15g-20g

蒸餾水

1000mL

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基成分（公共場所空氣2000國標）：蛋白胨

10g，其它同上。

四、實驗方法和步驟

（一）公共場所空氣及室內空氣菌落總數(shù)的檢測1、選點要求

（1）采樣點的數(shù)量：采樣點的數(shù)量根據(jù)監(jiān)測室內面積大小和現(xiàn)場情況而確定。以期能正確反映室內空氣污染物的水平。原則上小于30m2的房間應設(1～3)個點；30m2-100m2設(3-5)個點：100m2以上至少設5個點。在對角線上或梅花式均勻分布。（2）采樣點應避開通風口，離墻壁距離應大于1.0m。（3）采樣點的高度：原則上與人的呼吸帶高度相一致。相對高度1.2m～1.5m之間。各組采樣點安排超凈工作臺(每組必做)文科東樓2、5樓點；理工南樓1、3樓；生化樓2樓微生物實驗室、廁所無菌室操作間；圖書館自修室生活區(qū):食堂,男生宿舍,女生宿舍操場或運動場或湖區(qū)馬路邊采樣時,請記錄采樣的氣象條件及人流情況2、采樣方法（1）平板暴露法

將消毒準備好的直徑9cm的普通營養(yǎng)瓊脂平板放在室內各采樣點,采樣的高度距地面1.2-1.5m,距墻1m,布點規(guī)則：室內面積<30m2,設一條對角線按居室取3個點，中央一點，兩端距墻1米各一點；,室內面積>30m2以上,設4角及中央5點.(梅花布點)，即室內墻角對角線交點為一采樣點，該交點與四墻角連線的中點為另外4個采樣點，每一個點連續(xù)采樣兩次。每平板在每個采樣點暴露5min。采樣點應遠離墻壁lm以上，并避開空調、門窗等空氣流通處。37℃溫箱培養(yǎng)48h，取出計算菌落數(shù),以cfu／皿和cfu／m3報告結果.（2）撞擊法將采樣器消毒，按儀器使用說明進行采樣。一般情況下采樣量為20L-150L，應根據(jù)所用儀器性能和室內空氣微生物污染程度，酌情增加或減少空氣采樣量。樣品采完后，將帶菌營養(yǎng)瓊脂平板置36±1

℃溫箱中，培養(yǎng)48h，計數(shù)菌落數(shù)，并根據(jù)采樣器的流量和采樣時間，換算成每立方米空氣中的菌落數(shù)。以cfu／m3報告結果。3、計數(shù)及報告（1）撞擊法

根據(jù)采樣器的流量和采樣時間，換算成每立方米空氣中的菌落數(shù)。以每立方米菌落數(shù)(cfu/m3)報告結果。計算公式：細菌總數(shù)(cfu/m3)=1000×菌落數(shù)/空氣流量（L/分）×時間（分）公式中：A：所用平皿面積(cm2)，本實驗中選用9cm的平皿；T：平皿暴露于空氣中的時間(min),本次實驗采樣時間5min；N：經培養(yǎng)后培養(yǎng)基上各類菌的菌落數(shù)；（2）平板暴露法一般直接以cfu/平皿報告但也可以以每立方米菌落數(shù)(cfu/m3)報告結果。計算公式：細菌總數(shù)(cfu/m3)=50000N/AT4、評價標準(1)中科院生態(tài)研究中心空氣微生物評價分級標準(2)對于車間空氣的潔凈程度。采用普遍肉湯瓊脂，直徑為9cm平板在空氣中暴露5min后，經37℃培養(yǎng)的方法進行檢測，對室內空氣污染程度進行分級的參考數(shù)據(jù)。

平板菌落數(shù)／個

空氣污染程度評價

30以下

清潔安全

30—50

中等清潔

50～70

低等清潔應加注意

70—100

高度污染,對空氣要進行消毒

100以上

嚴重污染,禁止加工(3)日本空氣微生物分級（平皿暴露5分鐘）分級最清潔清潔普通污染臨界輕度污染嚴重污染細菌總數(shù)（cfu/皿）1-2＜3031-7576-150151-300＞301（4）公共場所空氣衛(wèi)生標準參照旅店業(yè)衛(wèi)生標準GB9663-1996，星級飯店、賓館和非星級帶空調的飯店、賓館（個/皿）≤10，普通旅店、

招待所（個/皿）≤30，文化娛樂場所衛(wèi)生標準GB9664-1996，影劇院、音樂廳、錄像廳（室）、游藝廳、舞廳（個/皿）≤40，酒吧茶座、咖啡廳（個/皿）≤30。（5）室內空氣衛(wèi)生標準：GB/T18883-2002室內空氣質量標準撞擊法：≤2500cfu/m3(二)無菌室空氣菌落總數(shù)檢測無菌室應每月檢查菌落數(shù)。在超凈工作臺開啟的狀態(tài)下，取內徑90mm的無菌培養(yǎng)皿若干，無菌操作分別注入融化并冷卻至約45℃的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約15ml，放至凝固后，倒置于30～35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時，證明無菌后，取平板3～5個，分別放置工作位置的左、中、右等處，開蓋暴露30分鐘后，倒置于30～35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時，取出檢查。100級潔凈區(qū)平板雜菌數(shù)平均不得超過1個菌落，10000級潔凈室平均不得超過3個菌落。如超過限度，應對無菌室進行徹底消毒，直至重復檢查合乎要求為止。無菌室標準：無菌室應設有無菌操作間和緩沖間，無菌操作間潔凈度應達到10000級，室內溫度保持在20-24℃，濕度保持在45-60%。超凈臺潔凈度應達到100級。潔凈度級別微生物最大允許數(shù)*沉降菌（cfu/皿*）浮游菌（cfu/m3）100級151萬級310010萬級1050030萬級15—我國醫(yī)藥行業(yè)空氣潔凈度分級標準（用直徑9cm的瓊脂平板在空氣中暴露30分鐘）五、實驗報告結合采樣點、采樣時間以表格形式記錄你的實驗數(shù)據(jù)，全班數(shù)據(jù)共享。[思考題]

根據(jù)你的實驗數(shù)據(jù)，你所檢測的大學城各場所的空氣中細菌總數(shù)有無超我國規(guī)定的衛(wèi)生學標準？并分析不同場所的空氣中細菌總數(shù)產生差異的可能原因。

實驗二水、食品中菌落總數(shù)及霉菌酵母總數(shù)檢測一、目的要求1、了解和學習水、食品中菌落總數(shù)、霉菌及酵母總數(shù)的測定原理和測定意義。2、學習和掌握用稀釋平板計數(shù)法測定水、食品中菌落總數(shù)和霉菌及酵母總數(shù)的方法。二、實驗原理1、水樣2006新國標規(guī)定生活飲用水需檢驗的微生物指標：菌落總數(shù)、總大腸菌群、糞大腸菌群、大腸埃希氏菌、賈第鞭毛蟲、隱孢子蟲等6項指標。2、食品2012新國標（GB/T4789—2012）規(guī)定食品需檢驗的微生物指標：菌落總數(shù)、總大腸菌群、糞大腸菌群、大腸埃希氏菌、致病菌.水的菌落總數(shù)：是指水樣在一定條件下培養(yǎng)后(培養(yǎng)基成分，培養(yǎng)溫度和時間、pH、需氧性質等)所得1mL水樣所含菌落的總數(shù)。菌落總數(shù)的檢測可反映出樣品被有機物污染的程度。食品的菌落總數(shù)：是指食品經過處理，在一定條件下培養(yǎng)后，所得1g或1ml檢樣中所含細菌菌落總數(shù)。菌落總數(shù)主要作為判別食品被污染程度的標志，也可以應用這一方法觀察細菌在食品中繁殖的動態(tài)，以便對被檢樣品進行衛(wèi)生學評價時提供依據(jù)。目前水樣檢測一般是采用普通肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（營養(yǎng)瓊脂）。食品檢測新國標已改為平板計數(shù)瓊脂（PCA培養(yǎng)基），食品的霉菌和酵母菌總數(shù)：是指檢樣在一定條件下培養(yǎng)后，1g或1mL食品中所污染的活的霉菌和酵母菌菌落總數(shù)，借以判明食品被霉菌和酵母菌污染程度及其一般衛(wèi)生狀況。本方法根據(jù)霉菌和酵母菌特有的形態(tài)和培養(yǎng)特性，在虎紅瓊脂培養(yǎng)基上，置28℃培養(yǎng)3-5天，計算所生長的霉菌和酵母菌數(shù)。三、實驗器材l．培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（營養(yǎng)瓊脂），檢測水的菌落總數(shù)。平板計數(shù)瓊脂（PCA培養(yǎng)基）：檢測的菌落總數(shù)虎紅培養(yǎng)基：檢測霉菌及酵母總數(shù)2.其他225ml裝無菌生理鹽水（帶玻璃珠）；9ml裝無菌生理鹽水；9cm滅菌平板，錐形瓶，玻璃涂棒，移液槍；Tip頭；大腸菌群檢測試紙；培養(yǎng)箱；水浴鍋；無菌棉簽；超凈工作臺；高壓蒸汽滅菌鍋等。四、實驗方法和步驟

（一）水的微生物學指標檢測l．水樣的采集自來水先將自來水龍頭用火焰燒灼3min滅菌，再開放水龍頭使水流5min后，以無菌三角燒瓶接取水樣200ml，以待分析。水源水（池水、河水或珠江水）應取距水面l0～15cm的深層水樣，先將滅菌的帶玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻轉過來，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛滿后，將瓶塞蓋好，再從水中取出。礦泉水或純凈水：隨機抽取廣州市市售6個品牌的礦泉水或純凈水。桶裝水：隨機抽取學校廣大牌桶裝水，對飲水機手柄及可能觸及飲用水的部分進行嚴格的滅菌(先用碘酒酒精棉球擦拭,繼而用滅菌水棉球擦拭,再用70%乙醇棉球擦拭,自然干燥后立即采樣)以防止可能造成的樣品污染;適當排水以確認飲水機管道儲水均流出時,以無菌操作取水樣200ml左右（分別取冷水及燒開后的熱水）待檢,每份水樣均做平行樣品。凈水器水直飲水:愛惠譜、美的牌凈水器生產的水2、水樣的菌落總數(shù)測定（生活飲用水按GB/T5750.12-2006進行；生活飲用水，純凈水等（新國標礦泉水不需檢驗菌落總數(shù)，只檢驗大腸菌群，糞鏈球菌，銅綠假單胞菌及產氣莢膜梭菌）

以無菌操作方法用滅菌吸管吸取1mL充分混勻的水樣，注入滅菌平皿中，傾注約15mL已融化并冷卻到45℃左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，并立即旋搖平皿，使水樣與培養(yǎng)基充分混勻。每次檢驗時應做一平行接種，同時另用一個平皿只傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基作為空白對照。待冷卻凝固后，翻轉平皿，使底面向上，置于36±1℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)48h，進行菌落計數(shù)，兩個平板的平均菌落數(shù)即為lml水樣的菌落總數(shù)。3、純凈水和礦泉水的霉菌及酵母總數(shù)測定方法同細菌總數(shù)檢測方法，不同的是傾注的培養(yǎng)基是虎紅瓊脂培養(yǎng)，,然后，把傾注有虎紅培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿倒置于28℃恒溫箱中,3-5天后取出計數(shù)。4、菌落計數(shù)及報告方法

作平皿菌落計數(shù)時，可用眼睛直接觀察，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平皿的菌落數(shù)后，應求出同稀釋度的平均菌落數(shù)，供下一步計算時應用。在求同稀釋度的平均數(shù)時，若其中一個平皿有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應以無片狀菌落生長的平皿作為該稀釋度的平均菌落數(shù)。若片狀菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落數(shù)分布又很均勻，則可將此半皿計數(shù)后乘2以代表全皿菌落數(shù)。然后再求該稀釋度的平均菌落數(shù)。

不同稀釋度的選擇及報告方法

1.7.1首先選擇平均菌落數(shù)在30～300之間者進行計算，若只有一個稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時，則將該菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之(見實例1)。1.7.2若有兩個稀釋度，其生長的菌落數(shù)均在30～300之間，則視二者之比值來決定，若其比值小于2應報告兩者的平均數(shù)(如實例2)。若大于2則報告其中稀釋度較小的菌落總數(shù)(如實例3)。若等于2亦報告其中稀釋度較小的菌落數(shù)(見實例4)。1.7.3若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，則應按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之(見實例5)。

1.7.4若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應以按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之(見實例6)。1.7.5若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30～300之間，則應以最接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之(見實例7)。1.7.6若所有稀釋度的平板上均無菌落生長，則以＜1乘以稀釋倍數(shù)報告之。1.7.7菌落計數(shù)的報告：菌落數(shù)在100以內時按實有數(shù)報告，大于100時，采用二位有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)值，以四舍五入方法計算，為了縮短數(shù)字后面的零數(shù)也可用10的指數(shù)來表示（見表1-1“報告方式”欄）。生活飲用水菌落總數(shù)報告例次

稀釋液及菌落數(shù)兩稀釋液之比菌落總數(shù)（cfu/g或ml）報告方式（cfu/g或ml）10-1

10-2

10-3

1多不可計16420—1640016000或1.6×104

2多不可計295461.63775038000或3.8×104

3多不可計271602.22710027000或2.7×104

4多不可計多不可計313—313000310000或3.0×105

527115—270270或2.7×102

6000—1<10

<10

7多不可計30512—3050031000或3.1×104

5、評價標準純凈水依據(jù)中華人民共和國GB17324-2003規(guī)定:菌落總數(shù)≤20cfu/mL,酵母、霉菌及致病菌不得檢出；礦泉水依據(jù)依據(jù)中華人民共和國GB8538-2008規(guī)定:每100mL水樣不得檢出。生活飲用水（自來水）：菌落總數(shù)≤100CFU/mL，瓶（桶）裝飲用水（經過過濾或滅菌并密封在容器中的可直接飲用的水）依據(jù)依據(jù)中華人民共和國GB17324-2003規(guī)定：菌落總數(shù)≤50cfu/mL,酵母總數(shù)≤10cfu/mL、霉菌總數(shù)≤10cfu/mL，致病菌不得檢出。（二）食品的微生物學指標檢測l．食品的采樣方法珍珠奶茶，牛奶隨機選取廣州市區(qū)珍珠奶茶店12間左右進行抽樣，每間店抽樣3瓶。采樣后，返回實驗室處理，檢測其菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌的數(shù)目并做好記錄。（一般從取樣到檢驗不應超過6小時）2、樣品稀釋液的制備

225ml25ml檢樣3、食品的菌落總數(shù)測定根據(jù)對樣品污染情況的估計，選擇2～3個適宜稀釋度，以吸取該稀釋度的吸管移取1ml稀釋液于滅菌平皿中，每個稀釋度做兩個平皿。稀釋液移入平皿后，將涼至45℃營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿約15ml，并轉動平皿，混合均勻。同時將平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有1ml稀釋液（不含樣品）的滅菌平皿內作空白對照（2個）。待瓊脂凝固后，翻轉平板，置36±1℃溫箱內培養(yǎng)48h±2，取出計算平板內菌落數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，即得每克（每毫升）樣品所含菌落總數(shù)。4、食品的霉菌和酵母總數(shù)的檢測方法5、菌落計數(shù)及報告方法

作平皿菌落計數(shù)時，可用眼睛直接觀察，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平皿的菌落數(shù)后，應求出同稀釋度的平均菌落數(shù)，供下一步計算時應用。在求同稀釋度的平均數(shù)時，若其中一個平皿有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應以無片狀菌落生長的平皿作為該稀釋度的平均菌落數(shù)。若片狀菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落數(shù)分布又很均勻，則可將此半皿計數(shù)后乘2以代表全皿菌落數(shù)。然后再求該稀釋度的平均菌落數(shù)。

食品菌落總數(shù)報告29食品霉菌及酵母總數(shù)報告295、評價標準（1）珍珠奶茶：菌落總數(shù)<10000cfu/ml；霉菌<10cfu/ml；酵母菌<10cfu/ml,大腸菌群不得檢出牛奶五、實驗報告

1、分別將實驗測出的樣品數(shù)據(jù)以表格方式報告結果。（水、食品各1個表格）2

、對樣品菌落總數(shù)作出是否符合衛(wèi)生要求的結論。

[思考題]

1、從自來水的細菌總數(shù)結果來看，是否合乎飲用水的標準？2、你所測的水源水的污穢程度如何？3、國家對自來水的細菌總數(shù)有一標準，那么各地能否自行設計其測定條件（諸如培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)時間等）來測定水樣總數(shù)呢？為什么？4、食品檢驗為什么要測定細菌菌落總數(shù)？

5、實驗操作如何使數(shù)據(jù)可靠？

6、食品中檢出的菌落總數(shù)是否代表該食品上的所有細菌數(shù)？為什么？

7.、為什么營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基在使用前要保持在46±1℃的溫度？

實驗二存在問題1、無菌操作不嚴格，污染嚴重；2、樣液與瓊脂混合不充分，混合物濺到平皿壁、皿蓋。3、每個樣品從開始稀釋到傾注最后一個平皿所用的時間超20min；4、梯度稀釋方法不正確5、菌落總數(shù)報告單位報告為個/mL

，應以菌落形成單位CFU/mL

報告；6、計數(shù)時長在平板中間的微小菌落未計算在內；7、計算數(shù)據(jù)出錯：菌落總數(shù)報告方法和公式沒理解實驗三

水和食品中大腸菌群的檢測①菌落總數(shù)《生活飲用水衛(wèi)生標準》中的微生物指標

(GB5749-2006)②總大腸菌群③耐熱大腸菌群④大腸埃希氏菌《食品衛(wèi)生標準》中的微生物指標

（GB/T4789-2010

）①菌落總數(shù)②大腸菌群③糞大腸菌群④霉菌和酵母菌總數(shù)⑤致病菌一、目的要求二、實驗原理三、實驗器材四、操作步驟五、實驗報告六、問題與思考一、目的要求1學習測定水、食品中大腸菌群數(shù)量的多管發(fā)酵法2了解大腸菌群的數(shù)量在飲水和食品監(jiān)測中的重要性二、實驗原理

大腸菌群不是細菌學上的分類命名，而是衛(wèi)生細菌領域的用語，它不代表某一個或某一屬細菌，而指的是一組與糞便污染有關的細菌，這些細菌在生化及血清學方面并非完全一致，這群細菌主要包括大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產氣克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌等。該類菌主要來自人和溫血動物的糞便，故作為糞便污染指標來評價水和食品的衛(wèi)生狀況，推斷食品中腸道致病菌污染的可能。

定義為：一群在37℃培養(yǎng)24-48h能發(fā)酵乳糖、產酸產氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。

采用多管發(fā)酵法：三步法或兩步法

三步法乳糖發(fā)酵試驗分離培養(yǎng)及革蘭氏染色證實試驗兩步法乳糖發(fā)酵試驗證實試驗

乳糖能起選擇作用，因為很多細菌不能發(fā)酵乳糖，而大腸菌群能發(fā)酵乳糖而產酸產氣。為便于觀察細菌的產酸情況，培養(yǎng)基內加有溴甲酚紫作為pH指示劑，細菌產酸后，培養(yǎng)基即由原來的紫色變?yōu)辄S色。溴甲酚紫還有抑制其他細菌如芽孢菌生長的作用。

24h內小管中如有氣體形成，并且培養(yǎng)基混濁，顏色改變，說明水中存在大腸菌群，疑為陽性結果；三步法實驗原理(GB5750.12-2006,GB/T4789.3-2003)1乳糖發(fā)酵實驗

發(fā)酵管內裝有乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基或乳糖膽鹽蛋白胨液體培養(yǎng)基，并倒置杜氏小管。

2、分離培養(yǎng)及革蘭氏染色

平板培養(yǎng)基使用伊紅美藍瓊脂（EMBagar）。伊紅美藍瓊脂平板含有伊紅和美藍染料，大腸菌群發(fā)酵乳糖造成酸性環(huán)境時，該兩種染料即結合成復合物，使大腸菌群產生以下特征的陽性菌落。

以上大腸菌群陽性菌落，經涂片革蘭氏染色為革蘭氏陰性無芽孢桿菌者，通過下一步試驗再進一步證實。EMB平板典型大腸菌群菌落特征①深紫黑色、有金屬光澤的菌落②紫黑色、不帶或略帶金屬光澤。③淡紫紅色、中心顏色較深。報告：

以每100mL(g)檢樣內大腸菌群最有可能數(shù)(MPN)表示。

MPN:為最有可能數(shù)(MostProbableNumber)的簡稱。即從規(guī)定的反應呈陽性管數(shù)的出現(xiàn)率，用概率論來推算樣品中菌數(shù)最近似的數(shù)值。3證實試驗培養(yǎng)基與初次發(fā)酵培養(yǎng)基相同，原理也與乳糖發(fā)酵試驗相同，經24h培養(yǎng)產酸又產氣的，最后確定為大腸菌群陽性結果。1、初發(fā)酵試驗兩步法實驗原理(GB/T4789.3-2010)

采用LST培養(yǎng)基。LST中提供了磷酸鹽緩沖體系，氯化鈉可維持滲透壓，月桂基硫酸鈉可抑制非大腸菌群的生長，這個緩沖蛋白胨乳糖肉湯允許“緩慢乳糖發(fā)酵”來促進菌體產氣。2、證實試驗

采用BGLB培養(yǎng)基，BGLB中膽鹽和煌綠可以抑制革蘭氏陽性細菌和除了大腸菌群的很多革蘭氏陰性細菌。三、試驗材料1、樣品：生活飲用水；不同品牌珍珠奶茶2、培養(yǎng)基：▲單料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液（內有倒置小套管）▲雙料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液（內有倒置小套管）▲伊紅美藍瓊脂▲乳糖膽鹽培養(yǎng)液▲LST培養(yǎng)基▲BGLB培養(yǎng)基▲9mL滅菌生理鹽水▲225mL滅菌生理鹽水▲滅菌培養(yǎng)皿▲滅菌搶頭▲中試管，小試管，杜氏小管▲1mL滅菌移液管，10mL滅菌移液管▲滅菌錐形瓶▲革蘭氏染色液，載波片，香柏油，顯微鏡等四、實驗內容及步驟（二）食品中大腸菌群的檢驗（一）生活飲用水中大腸菌群的檢驗2003國標方法2010國標方法生活飲用水中大腸菌群的檢驗(依據(jù)：GB5750.12-2006)

10ml水樣1ml水樣1ml10-1的水樣分裝10ml雙料培養(yǎng)基分裝5ml單料培養(yǎng)基分裝5ml單料培養(yǎng)基將產酸產氣的可疑陽性管分別劃線EMB平板37

℃24h37

℃18-24h挑取可疑菌落革蘭氏染色鏡檢證實試驗挑G-菌落初發(fā)酵試驗水樣的采集及梯度稀釋選擇不同稀釋度水樣查MPN表報告結果37

℃24h結果報告

根據(jù)證實為大腸菌群陽性的管數(shù)，查MPN檢索表，報告每100ml水樣中的大腸菌群最可能數(shù)（MPN）值。如所有乳糖發(fā)酵管均陰性，則報告大腸菌群未檢出食品中中大腸菌群的檢驗(依據(jù)：GB4789.3-2003)

將產酸產氣的可疑陽性管分別劃線EMB平板37

℃24h37

℃24h挑取可疑菌落革蘭氏染色鏡檢證實試驗挑取G-菌落接種每管分別接種1ml原液每管分別接種1ml10-1稀釋液每管分別接種1ml10-2稀釋液每管分裝5ml單料乳糖膽鹽蛋白胨培養(yǎng)基25ml檢樣選擇3個連續(xù)的稀釋度225ml乳糖蛋白胨液查MPN表報告結果37

℃24h報告根據(jù)證實為大腸菌群陽性的管數(shù)，查MPN檢索表，報告每100ml（g）檢樣中大腸菌群的MPN值。225ml25ml檢樣選擇3個連續(xù)的稀釋度10-1稀釋液10-2稀釋液10-3稀釋液將產氣的可疑陽性管BGLB驗證試驗LST初發(fā)酵試驗食品中中大腸菌群的檢驗(依據(jù)：GB4789.3-2010)查MPN表報告結果37

℃48h37

℃48h報告根據(jù)證實為大腸桿菌陽性的管數(shù)，查MPN表，報告每ml（g）大腸菌群的MPN值。

注意事項2、傾注EMB平板前應先搖勻；儲存EMB培養(yǎng)基及用EMB培養(yǎng)細菌時都應避光。1操作要在嚴格無菌的狀態(tài)下進行；且操作時間越短越好。3、樣品不同，選擇的稀釋倍數(shù)不同。MPN檢索表只給了三個稀釋度，如改用不同的稀釋度，則表內數(shù)字應相應降低或增加10倍。5、大腸菌群的產氣量，多者可以使發(fā)酵倒管全部充滿氣體，少者可以產生比小米粒還小的氣泡。4、發(fā)酵管在滅菌以后要檢查小導管內有無氣泡,如果有氣泡就不能再用了。6、挑菌落進行革蘭氏染色鏡檢時，一定要挑取典型菌落，如無典型菌落則應多挑幾個，以免出現(xiàn)假陰性。

進度安排（GB5750.12-2006，GB4789.3-2003）14日：

配置培養(yǎng)基、分裝、滅菌準備生理鹽水、槍頭、吸管等耗材，滅菌樣品采集、稀釋及接種15日：

觀察實驗現(xiàn)象將可疑陽性管劃線EMB平板16日：

觀察實驗現(xiàn)象挑可疑菌落革蘭氏染色鏡檢證實試驗（復發(fā)酵試驗）17日:

觀察實驗現(xiàn)象，統(tǒng)計陽性管數(shù)，查MPN表報告結果

進度安排（按GB4789.3-2010）14日：

配置培養(yǎng)基、分裝、滅菌準備生理鹽水、槍頭、吸管等耗材，滅菌樣品采集、稀釋及接種16日：

觀察實驗現(xiàn)象挑可疑陽性管接種GBLB進行證實試驗18日:

觀察實驗現(xiàn)象，統(tǒng)計陽性管數(shù)，查MPN表報告結果

實驗原始數(shù)據(jù)記錄表問題與思考1、如何避免放小倒管時產生氣泡？

2、客戶要求大腸菌群＜３MPN／ml(g),請問如何檢測和報告？3、如何從環(huán)境、設備及操作等方面保證你所檢樣品的結果真實可靠？4、你分別采用GB4789.3-2010、GB4789.3-2010檢測同一品牌珍珠奶茶，結果有無差異？

請分析。

本次實驗課結束

請確保無菌室干凈！

請第三組同學留下值日

實驗四食品中金黃色葡萄球菌的檢驗一、目的要求1學習測定食品中金黃色葡萄球菌檢測的程序和方法2了解金黃色葡萄球菌在食品監(jiān)測中的重要性二、實驗原理

Baird-Parker瓊脂原理

氯化鋰和亞碲酸鹽在該培養(yǎng)基中作為抑菌劑，而丙酮酸鈉和甘氨酸則刺激金葡菌的生長。

金黃色葡萄球菌有兩個明顯的特征：

1.其產生的脂酶分解了脂肪，在菌落周圍形成一不透明的混濁帶(沉淀環(huán))；

2.其產生的卵磷脂酶分解了卵磷脂，在菌落周圍形成一透明環(huán);3、因亞碲酸鹽中的碲離子被還原成金屬碲，菌落呈黑色。

金黃色葡萄球菌的單個菌落在Baird-Parker瓊脂平板上呈圓形,表面光滑、凸起、濕潤,直徑2～3mm?；液谏梁谏?有光澤,常有淺色(非白色)的邊緣,周圍繞以不透明圈(沉淀),其外常有一清晰帶。當用接種針觸及菌落時具有黃油樣粘稠感血漿凝固酶實驗原理：

凝固酶是實驗室鑒定葡萄球菌致病性的重要試驗。致病性葡萄球菌可產生兩種凝固酶，一種是結合于菌體表面并不釋放的凝聚因子，稱結合凝固酶，它直接作用于血漿中纖維蛋白原，使發(fā)生沉淀，包圍于細菌外面而凝聚成塊；另一種凝固酶是分泌至菌體外，稱為游離凝固酶，作用類似凝血酶原物質,被人或兔血漿中的協(xié)同因子激活為凝血酶類物質后，可使血漿中液態(tài)的纖維蛋白原變?yōu)槟痰睦w維蛋白，從而使血漿凝固。

凡是致病性的金黃色葡萄球菌就一定會含有凝固酶。

溶血實驗原理多數(shù)金黃色葡萄球菌致病菌株能產生溶血毒素，使血瓊脂平板菌落周圍出現(xiàn)溶血環(huán)，這些是鑒定致病性金黃色葡萄球菌的重要指標。

α溶血

菌落直徑1--2mm，草綠色溶血環(huán)，紅細胞并未完全溶解。代表菌：甲型溶血性鏈球菌，肺炎鏈球菌

β溶血

菌落直徑2--4mm，界限分明，完全透明的無色溶血環(huán)，紅細胞完全溶解。代表菌：金黃色葡萄球菌，乙型溶血性鏈球菌

γ

溶血無溶血素，無溶血環(huán)（故又稱為不溶血性鏈球菌）代表菌：丙型溶血鏈球菌金黃色葡萄球菌β溶血現(xiàn)象

三、試驗材料1、樣品：珍珠奶茶2、培養(yǎng)基：▲225mL滅菌▲滅菌培養(yǎng)皿▲滅菌搶頭▲中試管，小試管，杜氏小管▲1mL滅菌移液管，10mL滅菌移液管▲滅菌錐形瓶▲革蘭氏染色液，載波片，香柏油，顯微鏡等四、實驗內容及步驟金黃色葡萄球菌的定性檢驗

實驗五食品中產毒霉菌的分離與鑒定二、實驗原理三、實驗器材一、實驗目的四、實驗步驟五、實驗結果一、實驗目的1、學習并掌握食品中常見產毒霉菌分離純化的主要方法和技術;進一步熟練掌握食品檢樣的處理及梯度稀釋技術；2、掌握產毒霉菌的形態(tài)學鑒定技術，了解菌絲形態(tài)及其產孢結構在霉菌分類鑒定中的重要性；二、實驗原理

產毒霉菌極易在含糖的餅干、面包、糧食等類食品上生長，與食品衛(wèi)生關系密切的霉菌大部分屬于半知菌亞門中的曲霉屬、青霉屬和鐮刀菌屬。其產生的毒素主要有黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、雜色曲霉素、煙曲霉毒素、單端孢霉烯化合物、玉米赤霉烯酮、伏馬菌素以及展青霉素、桔青霉素、黃綠青霉素等。

霉菌產毒需要一定的條件，影響霉菌產毒的條件主要是食品基質中的水分、環(huán)境中的溫度和濕度及空氣的流通情況。曲霉屬：黃曲霉、赭曲霉、雜色曲霉、煙曲霉、構巢曲霉和寄生曲霉等；

青霉屬：島青霉、桔青霉、黃綠青霉、擴張青霉、圓弧青霉、皺折青霉和蕁麻青霉等；

鐮刀菌屬：犁孢鐮刀菌、擬枝孢鐮刀菌、三線鐮刀菌、雪腐鐮刀菌、粉紅鐮刀菌、禾谷鐮刀菌等；

其它菌屬：有綠色木霉、漆斑菌屬、黑色葡萄狀穗霉等。

本屬的產毒霉菌主要包括黃曲霉、寄生曲霉、雜色曲霉、構巢曲霉和棕曲霉。這些霉菌的代謝產物為黃曲霉毒素、雜色曲霉素和棕曲霉毒素。1、營養(yǎng)菌絲體由具橫隔的分枝菌絲構成；無色或有明亮的顏色,一部分埋伏型,一部分氣生型。曲霉屬2、產孢結構

分生孢子梗大都無橫隔,光滑、粗糙或有麻點。梗的頂端膨大形成棍棒形、橢圓形、半球形或球形的頂囊,在頂囊上生出一層或二層小梗,雙層時下面一層為?；?每個?；显僦鷥蓚€或幾個小梗。從每個小梗的頂端相繼生出一串分生孢子；由頂囊、小梗以及分生孢子鏈構成一個頭狀體的結構,稱為分生孢子頭。分生孢子頭有各種不同顏色和形狀,如球形、放射形、棍棒形或直柱形等。曲霉屬黃曲霉構巢曲霉黃曲霉黃曲霉黑曲霉

煙曲霉青霉屬

本屬產毒霉菌,主要包括黃綠青霉、桔青霉、圓弧青霉、展開青霉、純綠青霉、紅青霉、產紫青霉、冰島青霉和皺褶青霉等。這些霉菌的代謝產物為黃綠青霉素、桔青霉素、圓弧偶氮酸、展青霉素、紅青霉素、黃天精、環(huán)氯素和皺褶青霉素。

1、營養(yǎng)菌絲體呈無色、淡色或鮮明的顏色,具橫隔,或為埋伏型或部分埋伏型部分氣生型。氣生菌絲密氈狀、松絮狀或部分結成菌絲索。2、產孢結構

分生孢子梗由埋伏型或氣生型菌絲生出,稍垂直于該菌絲(除個別種外,不象曲霉那樣生有足細胞),單獨直立或作某種程度的集合及至密集為一定的菌絲束,具橫隔,光滑或粗糙。其先端生有掃帚狀的分枝輪,稱為帚狀枝。帚狀枝是由單輪或兩次到多次分枝系統(tǒng)構成,對稱或不對稱,最后一級分枝即產生孢子的細胞,稱為小梗。青霉菌鐮刀菌屬

本屬的產毒霉菌主要包括禾谷鐮刀菌、串珠鐮刀菌、雪腐鐮刀菌、三線鐮刀菌、梨孢鐮刀菌、擬枝孢鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌和木賊鐮刀菌等。這些霉菌的代謝產物為單端孢霉烯族化合物、玉米赤霉烯酮和丁烯酸內酯等。

1、營養(yǎng)菌絲體

氣生菌絲發(fā)達高0.5～1.0cm或較低為0.3～0.5cm，或更低為0.1～0.2cm；稀疏的氣生菌絲，甚至完全無氣生菌絲而由基質菌絲直接生出黏孢層，內含大量的分生孢子。

2、產孢結構可產生大、小兩種分生孢子。小型分生孢子通常假頭狀著生,較少為鏈狀著生,或者假頭狀和鏈狀著生兼有。小型分生孢子生于分枝或不分枝的分生子梗上,形狀多樣,卵形、梨形、橢圓形、長橢圓形、紡錘形、披針形、臘腸形、柱形、錐形、逗點形、圓形等。1～2(3)隔,通常小型分生孢子的量較大型分生孢子為多。大型分生孢子產生在菌絲的短小爪狀突起上或產生在分生孢子座上,或產生在粘孢團中;大型分生孢子形態(tài)多樣,鐮刀形、線形、紡錘形