植物組織培養(yǎng)教案

25/25植物組織培養(yǎng)教案[重點(diǎn)難點(diǎn)]

組織培養(yǎng)的概念、組織培養(yǎng)的類型、特點(diǎn)和應(yīng)用

第一節(jié)組織培養(yǎng)的概念

一、組織培養(yǎng)的概念是指通過無菌操作分離植物體的一部分(即外植體explant)，接種到培養(yǎng)基上，在人工控制的條件進(jìn)行培養(yǎng)，使其生成完整的植株。

二、組織培養(yǎng)的特點(diǎn)：取材少生長周期短繁殖率高。人工控制條件管理方便

三、培養(yǎng)的研究類型組織培養(yǎng)按培養(yǎng)對象可分為植株培養(yǎng)、器官培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)等：

第三節(jié)組織培養(yǎng)應(yīng)用及展望

一、快速繁殖種苗組織培養(yǎng)的快速繁殖，就是應(yīng)用組織培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，快速繁衍珍稀瀕危植物。

二、無病毒苗的培養(yǎng)

三、在育種上的應(yīng)用，。

四、工廠化育苗

的條件。

[教學(xué)方法]

啟發(fā)式；講授；多媒體課件；演示。

[教學(xué)時(shí)數(shù)]

2課時(shí)。

[教學(xué)內(nèi)容]

第一節(jié)實(shí)驗(yàn)室及基本操作

一、實(shí)驗(yàn)室

（一）準(zhǔn)備室(repairingroom)

在準(zhǔn)備室內(nèi)要完成培養(yǎng)基制備、清洗與整理工作。為完成培養(yǎng)基的制備工作，準(zhǔn)備室還應(yīng)配備以下儀器設(shè)備：

大型工作臺、藥品柜、普通冰箱、電子分析天平和托盤天平、電蒸餾水器、磁力攪拌器、電爐或電飯鍋、酸度計(jì)、高壓滅菌鍋等。

（二）接種室(transferingroom)

1、對接種室要求

2、接種室的主要設(shè)備及用具

（三）培養(yǎng)室(culturingroom)

培養(yǎng)室是將接種的材料進(jìn)行培養(yǎng)生長的場所。培養(yǎng)材料放在培養(yǎng)架上培養(yǎng)。培養(yǎng)條件:培養(yǎng)室一般保持在20-27℃左右，相對濕度以保持在70％-80％為好，一般需要每天光照10-16h。環(huán)境的相對濕度一般要求70％-80％的相對濕度。

（四）煉苗室

二、設(shè)備和器材

（一）玻璃器皿

（二）器械用具

第二節(jié)基本操作

一、洗滌（自學(xué)）

二、滅菌(sterilization)

滅菌是指用物理或化學(xué)的方法，殺死物體表面和孔隙內(nèi)的一切微生物或生物體。

培養(yǎng)基用濕熱滅菌方法

三、無菌操作

1、在接種前20分鐘，打開超凈工作臺的風(fēng)機(jī)以及紫外燈；

2、接種員先洗凈雙手，在緩沖間換好專用實(shí)驗(yàn)服，并換穿托鞋；

3、上工作臺后，用酒精棉球擦拭雙手，特別是指甲處。然后擦拭工作臺面；·

4、先用酒精棉球擦拭接種工具，再將鑷子和剪子從頭至尾過火一遍；

5、接種時(shí)，接種員雙手不能離開工作臺，不能說話、走動和咳嗽等；

6、接種完畢后要清理干凈工作臺，若連續(xù)接種，每5天要大強(qiáng)度滅菌一次。

本章小結(jié)

實(shí)驗(yàn)室組成：準(zhǔn)備室、無菌操作室、培養(yǎng)室、煉苗室；培養(yǎng)基用濕熱滅菌；

無菌操作無菌操作的技術(shù)程序。

[自學(xué)指導(dǎo)與訓(xùn)練方案]

討論：建一個(gè)組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室起碼需要用哪些設(shè)備和儀器。

思考題：

1、對接種室有哪些要求？如何對接種室消毒？

2、培養(yǎng)室的作用是什么？對培養(yǎng)條件有什么要求？

3、簡述無菌操作步驟。

4、簡述培養(yǎng)基用濕熱滅菌方法

5、用95％酒精配成75％酒精1000ml,問用95％酒精和水各多少ml？

制工作培養(yǎng)基；培養(yǎng)基的選擇。

[教學(xué)方法]

啟發(fā)式；講授；多媒體課件。

[教學(xué)時(shí)數(shù)]

4課時(shí)

[教學(xué)內(nèi)容]

第一節(jié)培養(yǎng)基的種類和成分

一、培養(yǎng)基的種類

目前國際上流行的培養(yǎng)基有幾十種，如：MS培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基、White培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基、KM-8P培養(yǎng)基等

二、培養(yǎng)基的成分

培養(yǎng)基的成分主要可以分水、無機(jī)鹽、有機(jī)物、天然復(fù)合物、培養(yǎng)體的支持材料等五大類。

1．水大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)可用自來水。但在少量研究上盡量用蒸餾水；

2、無機(jī)元素大量元素，有N，P，K，Ca，Mg，S等。微量元素Fe，B，Mn，Cu，Mo，Co等。

3．有機(jī)化合物

(1)碳水化合物最常用的碳源是蔗糖。

(2)維生素(vitamin)主要有VB1、VD6、Vpp、VC、有時(shí)還使用生物素、葉酸、VB2等。

(3)肌醇又叫環(huán)己六醇。

(4)氨基酸是有機(jī)氮源，可直接被細(xì)胞吸收利用。培養(yǎng)基中最常用甘氨酸。

4．植物激素(hormone)

在培養(yǎng)基的各成分中植物激素是培養(yǎng)基的關(guān)鍵物質(zhì)，對植物組織培養(yǎng)起著決定性作用。

(1)生長素類(auxin)在組織培養(yǎng)中，生長素主要被用于誘導(dǎo)愈傷組織形成，誘導(dǎo)根的分化和促進(jìn)細(xì)胞分裂、伸長生長。

IAA(吲哚乙酸)、NAA(萘乙酸)、IBA(吲哚丁酸)、2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)。NAA和IBA廣泛用于生根，并與細(xì)胞分裂素互作促進(jìn)芽的增殖和生長。生長素配制時(shí)可先用少量95％酒精助溶。2，4-D可用0．1mol／L的NaOH或KOH助溶。

(2)GA(赤霉素)，赤霉素用于打破休眠，促進(jìn)種子、塊莖、鱗莖等提前萌發(fā)。赤霉素不耐熱，高壓滅菌后將有70％-100％失效。

(3)細(xì)胞分裂素類(cytokinin)包括6-BA(6-芐基氨基嘌呤)、Kt(kinetin激動素)、

n(zeatin玉米素)等。其中Zt活性最強(qiáng)，但非常昂貴，常用的是6-BA。

細(xì)胞分裂素作用：①誘導(dǎo)芽的分化促進(jìn)側(cè)芽萌發(fā)生長，當(dāng)組織內(nèi)細(xì)胞分裂素／生長素的比值高時(shí)，誘導(dǎo)愈傷組織或器官分化出不定芽。②促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大。③抑制根的分化。因此，細(xì)胞分裂素多用于誘導(dǎo)不定芽的分化、莖、苗的增殖，而避免在生根培養(yǎng)時(shí)使用。

5.培養(yǎng)材料的支持物瓊脂(agar)在固體培養(yǎng)時(shí)瓊脂是最好的固化劑。瓊脂能溶解在熱水中，成為溶膠，冷卻至40℃即凝固為固體狀凝膠，溶解于90℃以上的熱水。6．抗生物質(zhì)抗生物質(zhì)有青霉素、鏈霉素、慶大霉素等，用量在5-20mg／L之間。添加抗生物質(zhì)可防止菌類污染，

7．活性炭可以吸附外植體產(chǎn)生的致死性褐化物；一般為0.1％-0．2％。

三、培養(yǎng)基的選擇

（一）單因子試驗(yàn)。各項(xiàng)條件和因素都維持在一般水平上，只變動一個(gè)因子，以找出這一因子對試驗(yàn)影響和影響的程度。

（二）多因子試驗(yàn)。

（三）逐步添加和逐步排除的試驗(yàn)方法

（四）廣譜試驗(yàn)法

第二節(jié)、培養(yǎng)基的制備

母液的配制和保存稱量溶解定容分裝標(biāo)簽保存。

[自學(xué)指導(dǎo)與訓(xùn)練方案]

復(fù)習(xí)思考題：

1、培養(yǎng)基的種類及特點(diǎn)有哪些？

2、培養(yǎng)基一般包括哪些基本成分？如何配制？

3、如何選擇合適的培養(yǎng)基？

4、用于植物組織培養(yǎng)的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)主要有哪兩種？它們在組織培養(yǎng)中各起什么作用？

作業(yè)：1、MS培養(yǎng)基配制過程。

2、75%乙醇的配制

3、BA和NAA的配制。

自學(xué)指導(dǎo)：培養(yǎng)基的選擇試驗(yàn)。

熟練掌握組織培養(yǎng)相關(guān)的滅菌方法，無菌操作技術(shù)和外植體的選擇與滅菌的方法步驟，掌握污染原因及采取的對策。

[重點(diǎn)難點(diǎn)]

消毒概念滅菌方法無菌操作污染

[教學(xué)方法]

啟發(fā)式；講授；多媒體課件，

[教學(xué)時(shí)數(shù)]

2課時(shí)。

[教學(xué)內(nèi)容]

一外植體的選擇

（一）外植體的部位

（二）取材季節(jié)對大多數(shù)植物，應(yīng)在其生長開始的季節(jié)。

（三）器官的生理特點(diǎn)和發(fā)育幼年組織比老年組織具有較高的行態(tài)發(fā)生能力。

（四）外植體的大小莖段長0.5cm，葉片面積5mm2。

二、外植體的消毒方法

（一）常用消毒劑常用的有0.1%升汞溶液。70-75%酒精。

（二）外植體的滅菌方法

1、莖段，莖尖及葉片的消毒

2、果實(shí)和種子的消毒

3、根及地下部器官的消毒

4、花藥的消毒

植物材料必須經(jīng)嚴(yán)格的表面滅菌處理，再經(jīng)無菌操作手續(xù)接到培養(yǎng)基上，這一過程叫做接種。接種的植物材料叫做外植體。

首先，把材料切割成適當(dāng)大小，即滅菌容器能放人為宜。置自來水龍頭下流水沖洗幾分鐘至數(shù)小時(shí)，洗時(shí)可加入洗衣粉清洗。

第二步要在超凈臺用70%-75%酒精浸10-30s。

第三步是用滅菌劑0.1%升汞處理5-10min。升汞是由重金屬汞離子來達(dá)到滅菌的；

第四步用無菌水涮洗4-6次，每次不少于3min，以盡量去除殘毒。

三、污染的原因及對策

污染指：組培過程中培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料滋生雜菌導(dǎo)致培養(yǎng)失敗現(xiàn)象。

1、污染的原因

外植體帶菌，培養(yǎng)基滅菌不徹底，操作員不遵守操作規(guī)程等。

（1）細(xì)菌污染在接種后1-2天可發(fā)現(xiàn)，菌斑呈粘液狀。

（2）真菌污染在接種3天后可發(fā)現(xiàn)，污染部分長有不同顏色的霉菌。

2、污染的預(yù)防措施

（1）將取的枝條用水沖干凈后插入自來水中使其抽枝，用新抽的枝作外植體。

（2）晴天中午到下午采樣

（3）培養(yǎng)基加抗生素

（4）操作人員嚴(yán)格遵守操作規(guī)程接種

（5）培養(yǎng)基及其用具滅菌要徹底

四、培養(yǎng)條件

大多數(shù)植物組織培養(yǎng)都是在23-27℃之間進(jìn)行，一般采用25土2℃。光照強(qiáng)度一般為1000—6000LX。最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。容器內(nèi)濕度一般100%，環(huán)境的相對濕度一般要求70％-80％的相對濕度。培養(yǎng)基pH值大多在5-6.5左右，一般培養(yǎng)基皆要求5.8。

[自學(xué)指導(dǎo)與訓(xùn)練方案]

復(fù)習(xí)思考題：

1、滅菌和消毒有何區(qū)別？

2、常用的滅菌方法有哪幾種？

3、接種材料如何進(jìn)行消毒處理？

5、組織培養(yǎng)中如何盡量避免出現(xiàn)污染？

6、植物組織培養(yǎng)技術(shù)主要包括哪些環(huán)節(jié)？各環(huán)節(jié)的主要工作內(nèi)容是什么？

訓(xùn)練：

1、不同消毒劑消毒劑處理效果試驗(yàn)。

2、污染情況調(diào)查。

3、劉慶昌吳國良植物細(xì)胞組織培養(yǎng)2005.3中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社

[單元章節(jié)]

第四章植物組織培養(yǎng)的基本原理

[教學(xué)目的]

在了解組織培養(yǎng)基本原理的基礎(chǔ)上，掌握植物細(xì)胞的全能性、器官的發(fā)生、愈傷組織培養(yǎng)等

[重點(diǎn)難點(diǎn)]

植物細(xì)胞的全能性、細(xì)胞分化、脫分化、再分化、愈傷組織培養(yǎng)、體細(xì)胞胚[教學(xué)方法]

啟發(fā)式；講授；現(xiàn)場教學(xué)。

[教學(xué)時(shí)數(shù)]

4課時(shí)。

[教學(xué)內(nèi)容]

第一節(jié)植物細(xì)胞的全能性細(xì)胞分化

一、植物細(xì)胞的全能性（totipotent)：

植物每個(gè)細(xì)胞都攜帶一套完整的基因組（該植物體全部遺傳信息），在一定條件下具有發(fā)育成完整植物體的潛在能力。

二、細(xì)胞分化

細(xì)胞分化指：導(dǎo)致細(xì)胞形成不同結(jié)構(gòu)，引起功能改變或潛在的發(fā)育方式改變的過程。（一）細(xì)胞分化分為行態(tài)結(jié)構(gòu)分化和生理生化分化

（二）發(fā)育中的植物不存在部分基因組永久關(guān)閉情況。即保持潛在全能性，只要條件適合便表現(xiàn)出全能性。

（三）在完整植株中，細(xì)胞發(fā)育途徑一旦被決定，通常不易改變，但離體培養(yǎng)通過脫分化可改變。

（四）極性與分化關(guān)系密切，極性是細(xì)胞分化前提，極性是指：細(xì)胞（也可指器官、植株）內(nèi)的一端與另一端在形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化上存在差異現(xiàn)象。

（五）生理隔離。

（六）細(xì)胞分裂對細(xì)胞分化有重要作用。

（七）激素對細(xì)胞分化有重要調(diào)節(jié)作用。

（八）細(xì)胞核染色體和DNA變化對細(xì)胞分化重要作用。

三、組織分化

在細(xì)胞分化的基礎(chǔ)上，可以分化出各種各樣的組織（分生組織、保護(hù)組織、機(jī)械組織輸導(dǎo)組織等）。是形成不定芽和不定根的基礎(chǔ)。器官分化主要指根和芽的分化。

第二節(jié)離體條件下植物器官的發(fā)生

一、外植體脫分化（去分化）

脫分化（dedifferentiation）：由高度分化的植物組織或器官失去原來結(jié)構(gòu)和功能而恢復(fù)分生狀態(tài)，形成無組織結(jié)構(gòu)的細(xì)胞團(tuán)或愈傷組織的過程。

愈傷組織（callus）在人工培養(yǎng)基上由外植體進(jìn)行細(xì)胞分裂，形成一種高度液泡化的呈無定形態(tài)的薄壁細(xì)胞。

再分化（redifferentiation):經(jīng)脫分化的愈傷組織在一定的培養(yǎng)條件下長出植株的能力。

1、細(xì)胞水平再分化：細(xì)胞壁變厚、假導(dǎo)管細(xì)胞形成、酶水平變化等。形成各種細(xì)胞。

2、組織水平的再分化；維管組織分化，形成愈傷組織（由高度液泡化的細(xì)胞組成）愈傷組織含有擬分生組織或瘤狀結(jié)構(gòu)。

3、器官細(xì)胞水平的再分化（器官發(fā)生）：再分化形成各種器官

4、植株再生途徑

器官發(fā)生途經(jīng)就是先誘導(dǎo)獲得不定芽或不定根，然后獲得再生植株；體細(xì)胞胚發(fā)生是指由愈傷組織或外植體形成體細(xì)胞胚，然后通過體細(xì)胞胚而發(fā)育成再生植株；原球莖發(fā)生是蘭花離體培養(yǎng)中特有的植株再生；愈傷組織發(fā)生是由愈傷組織經(jīng)再分化而發(fā)育成再生植株。

三、愈傷組織的培養(yǎng)

（一）愈傷組織的形成、生長、保持

1、愈傷組織的形成：外植體中已分化的活細(xì)胞，在外源激素的誘導(dǎo)下通過脫分化后形成愈傷組織，這一過程被大致劃分為三個(gè)時(shí)期（誘導(dǎo)期、分裂期和形成期）。

2、愈傷組織的生長

3、愈傷組織繼代培養(yǎng)

（二）愈傷組織的形態(tài)發(fā)生方式

從外植體形成器官或無性系的形態(tài)發(fā)生，有下面兩種方式：

1、不定芽方式（unfixedbud）指細(xì)胞或愈傷組織培養(yǎng)物，通過形成不定芽再生成植株，這是細(xì)胞和組織培養(yǎng)中常見的器官發(fā)生方式。

2、胚狀體方式（somaticembryo）指由培養(yǎng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化出的胚胚芽、胚根、胚軸的胚狀結(jié)構(gòu)，進(jìn)而長成完整植株

第三節(jié)植物體細(xì)胞胚發(fā)生

胚狀體亦稱體細(xì)胞胚；指在植物組織培養(yǎng)過成中，由植物體細(xì)胞所形成的類似于合子胚的結(jié)構(gòu)。具有根、莖結(jié)構(gòu)，能一次性形成再生植株。

胚狀體發(fā)生：指由培養(yǎng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化出具胚芽、胚根、胚軸的胚狀結(jié)構(gòu)，進(jìn)而長成完整植株。

一、植物體細(xì)胞胚狀體發(fā)生過程

（一）體細(xì)胞胚狀體發(fā)生過程

由外植體經(jīng)胚狀體形成完整植株可分：五個(gè)時(shí)期：原胚期、球形胚期、心形胚期

魚雷形胚期、子葉期（成熟胚）、發(fā)育成完整植株

（二）胚性和非胚性或愈傷組織生理形態(tài)差異

1、胚性愈傷組織（Embryoneniccallus）：表面松脆、細(xì)胞小，這種小細(xì)胞聚集為叢狀，被稱為EC。DNA、RNA及蛋白質(zhì)合成活躍，再生力強(qiáng)。

2、非胚性愈傷組織：表面粗糙、組織結(jié)構(gòu)疏松、細(xì)胞大，大液泡的細(xì)胞。

（三）體細(xì)胞胚發(fā)生的基因表達(dá)機(jī)理

二、植物體細(xì)胞胚發(fā)生途徑

（一）體細(xì)胞胚發(fā)生方式：體細(xì)胞胚發(fā)生途徑：直接途徑、間接途徑

（二）體細(xì)胞胚（Somaticembyo）的來源：外植體細(xì)胞經(jīng)脫分化后直接產(chǎn)生體胚，多數(shù)起源于單細(xì)胞

三、植物體細(xì)胞胚發(fā)生的雙極性和生理隔離

雙極性是指：細(xì)胞發(fā)育初期，其內(nèi)含物分布具不均勻性，而形成體細(xì)胞后，具有發(fā)育成芽端和根端的潛在能力。

（一）植物體細(xì)胞胚發(fā)生的極性

（二）植物體細(xì)胞胚發(fā)生的生理隔離

生理隔離：早期的胚性細(xì)胞與周圍細(xì)胞還存在胞間連絲，隨著胚性細(xì)胞的發(fā)育，細(xì)胞

壁加厚，胞間連絲消失或被堵塞（維管束系統(tǒng)無直接聯(lián)系），為孤立狀態(tài)。生理隔離是體細(xì)胞胚發(fā)生的先決條件。

四、體細(xì)胞胚胎發(fā)生的生理學(xué)和生物化學(xué)

（一）蛋白質(zhì)和核酸

（二）多胺代謝

（三）糖類、金屬離子和微量元素（自學(xué)）

（四）內(nèi)源激素

1、生長素

2、細(xì)胞分裂素

3、赤霉素

4、脫落酸（自學(xué)）

（五）活性酶（自學(xué)）

第三節(jié)影響植物離體形態(tài)發(fā)生的因素

一、植物種類和基因型：胡蘿卜易誘導(dǎo)體細(xì)胞胚，煙草難。

二、培養(yǎng)材料的生理狀態(tài)

1、植株發(fā)育年齡：幼嫰組織比老態(tài)組織具有較高的體形態(tài)發(fā)生力，特別生根能力。

2、培養(yǎng)器官或組織類型：

3、培養(yǎng)時(shí)間和細(xì)胞倍數(shù)：培養(yǎng)時(shí)間越長或繼代次數(shù)越多，會推遲或降低形態(tài)發(fā)生能力。

三、培養(yǎng)基

1、植物營養(yǎng)：

2、物理性質(zhì)

3、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)：生長素、細(xì)胞分裂素、赤霉素

四、培養(yǎng)條件

（一）光照：一般來說光照強(qiáng)度為10005000LX，最常用每日是10--16h的光照。（二）溫度：大多數(shù)植物組織培養(yǎng)都是在23～27℃之間進(jìn)行，一般采用25±2℃。[自學(xué)指導(dǎo)與訓(xùn)練方案]

思考題：

1、植物細(xì)胞的全能性概念。

2、什么是植物細(xì)胞分化、脫分化、再分化？

3、愈傷組織是如何形成的？

4、植物離體培養(yǎng)中再生植株的主要途有哪些？

5、簡述愈傷組織細(xì)胞分化。

6、簡述體細(xì)胞胚狀體發(fā)生過成。

7、影響植體離體形態(tài)發(fā)生的因素有哪些？

起源。體細(xì)胞胚胎起源于單細(xì)胞，體細(xì)胞胚具有雙極性。

四、培養(yǎng)產(chǎn)物的觀察記載

（一）愈傷組織、外植體愈傷組織誘導(dǎo)率、愈傷組織生長量。

（二）體細(xì)胞胚、胚狀體誘導(dǎo)率。

（三）芽分化誘導(dǎo)率。

第二節(jié)植物營養(yǎng)器官培養(yǎng)

一、離體根的培養(yǎng)

以植物根切段為外植體進(jìn)行的離體培養(yǎng)技術(shù)．離體根培養(yǎng)是進(jìn)行根系生理和代謝研究的最優(yōu)良的實(shí)驗(yàn)體系．

（一）根無性系的建立

將種子進(jìn)行表面消毒，在無菌條件下萌發(fā)，待根伸長后從根尖一端切取長1cm的根尖，接種于培養(yǎng)基中。

1、根直接增殖：養(yǎng)基如MS也可采用，但必須將其濃度稀釋到2／3或1／2，25－27℃黑暗條件培養(yǎng)，使根直接增殖。

2、根間接增殖；根--愈傷組織芽或根。

4、根形成過程：以不定根方式進(jìn)行。

（二）影響離體根發(fā)生和生長的因素

培養(yǎng)基、激素、加適當(dāng)濃度生長素有利根生長，赤霉素能增加側(cè)根發(fā)生與生長。

植物材料：一般用種子在無菌條件下萌發(fā)根尖。光照和溫度：25-27℃黑暗條件培養(yǎng)有利。

二、植物莖培養(yǎng)

植物莖培養(yǎng)又分為莖尖和莖段培養(yǎng)

莖尖培養(yǎng)：切取莖的先端部分或莖尖分生組織（莖尖）0.1mm部分進(jìn)行無菌培養(yǎng)，應(yīng)用于無病毒苗培育。

莖段培養(yǎng)：對帶有腋芽或葉柄的莖段進(jìn)行無菌培養(yǎng)。

莖段培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)：是以芽生芽方式繁殖，易培養(yǎng)成功，變異小，性狀均一，繁殖速度快，故作快速繁殖的主要外植體．莖段培養(yǎng)中可能出現(xiàn)四種情況：單芽、叢生苗、完整植株、愈傷組織。

三、離體葉的培養(yǎng)

離體葉培養(yǎng)指；以植物葉器官為外植體進(jìn)行的離體培養(yǎng)技術(shù)．（葉原基、葉柄、葉鞘、葉片、子葉在內(nèi)的葉組織的無菌培養(yǎng)）。它大多經(jīng)脫分化形成愈傷組織，再由后者分化出莖和根。(1)材料選擇及滅菌(2)接種把滅菌過的葉組織切成約0．5cm見方小塊或薄片(如葉柄和子葉)，接種在MS或其他培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基中附加BA和NAA。（3)培養(yǎng)葉接種后培養(yǎng)條件為每天10-12h光照，光強(qiáng)1500-30001x。培養(yǎng)約2周至4周，葉切塊開始增厚腫大，進(jìn)而形成愈傷組織。這時(shí)應(yīng)轉(zhuǎn)移到再分化培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)。

第三節(jié)植物繁殖器官培養(yǎng)

一、花器官的培養(yǎng)

花器官培養(yǎng)指整朵花或其組成部分如花托、花瓣、花絲、花柄、子房、花藥等的無菌培養(yǎng)。其培養(yǎng)方法如下：

取材從健壯植株上取未開放的花蕾作外植體材料。經(jīng)消毒、接種培養(yǎng)。要加入生長激素和細(xì)胞分裂素，誘導(dǎo)形成愈傷組織或胚狀體，再分化培養(yǎng)成植株。

二、種子培養(yǎng)

種子培養(yǎng)是指受精后發(fā)育完全的成熟種子和發(fā)育不完全的未成熟種子的無菌培養(yǎng)。

培養(yǎng)技術(shù)如下：

（1)種子滅菌種皮厚或不飽滿的種子，宜用0．1％升汞消毒10-20min。應(yīng)先用75％酒精或吐溫40處理，提高消毒效果。對殼厚難萌發(fā)的種子，可去殼培養(yǎng)。

(2)培養(yǎng)基對某些發(fā)育不全的無胚乳的種子培養(yǎng)，應(yīng)提供適當(dāng)?shù)纳L激素。種子培養(yǎng)的糖濃度可稍低，一般1％-3％。

(3)接種培養(yǎng)種子培養(yǎng)的接種較容易，把種子按每瓶3-5粒放人培養(yǎng)瓶中，均勻排列，放在20-28℃的條件下培養(yǎng)，1000-20001x光強(qiáng)，每天光照10h。

第四節(jié)植物組織培養(yǎng)

組織培養(yǎng)：指以分離出植物各部位的組織（如分生組織，形成層，木質(zhì)部，韌皮部，表皮，皮層，胚乳組織，薄壁組織，髓部等），或已誘導(dǎo)的愈傷組織為外植體的離體無菌培養(yǎng)。

一、分生組織培養(yǎng)

分生組織培養(yǎng)指對分生組織進(jìn)行離體培養(yǎng)，包括根尖、莖尖等頂端分生組織和形成層組織的培養(yǎng)。

莖尖的培養(yǎng)；莖尖培養(yǎng)是切取莖的先端部分或莖尖分生組織部分，進(jìn)行無菌培養(yǎng)。

微莖尖和普通莖尖培養(yǎng)。莖尖培養(yǎng)步驟如下:

(1)取材挑選雜菌污染少，生長不久的莖尖。(2)消毒接種(3)接種為了減少污染，可在接種前再剝掉一些葉片，使莖尖為0．5cm左右大小。這樣取莖尖大小只能作為快速繁殖。

為脫病毒：在剖取莖尖時(shí)，把莖芽置于解剖鏡下，用解剖針或解剖刀片將分生組織切下來（0.2－0.5mm），可帶1~2枚葉原基。

莖尖培養(yǎng)后可能出現(xiàn)四種情況：芽萌發(fā)、產(chǎn)生胚狀體、產(chǎn)生不定器官、產(chǎn)生愈傷組織。

二、愈傷組織培養(yǎng)

愈傷組織培養(yǎng)：指誘導(dǎo)植物外植體產(chǎn)生無序生長的薄壁細(xì)胞及其培養(yǎng)技術(shù)。通過植物的器官和組織的培養(yǎng)去分化誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，然后從愈傷組織再分化產(chǎn)生芽，長成小植株．

三、植物薄層組織培養(yǎng)

植物薄層組織培養(yǎng)：指植物薄細(xì)胞層組織進(jìn)行離體培養(yǎng)的技術(shù)。

薄層細(xì)胞培養(yǎng)采用莖表皮層細(xì)胞做外植體，進(jìn)行平板培養(yǎng)。該種培養(yǎng)技術(shù)具有取材方便，表面消毒方便，不通過愈傷階段直接分化成芽、根等優(yōu)點(diǎn)。

[自學(xué)指導(dǎo)與訓(xùn)練方案]

復(fù)習(xí)思考題：

1、植物器官和組織培養(yǎng)的基本程序是什么？

2、什么是莖尖、葉培養(yǎng)？

3、莖尖、莖段、葉培養(yǎng)的方法和步驟？

4、什么是植物薄層組織培養(yǎng)？

6、莖段培養(yǎng)的目的是什么？

參考書：

1、梅家訓(xùn)、丁習(xí)武主編組培快繁技術(shù)及其應(yīng)用2003.4中國農(nóng)業(yè)出版社

2、高新一、王玉英編著植物無性繁殖實(shí)用技術(shù)2003.12金盾出版社

3、李浚明編譯．植物組織培養(yǎng)教程[第2版]．北京：2004部中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，[單元章節(jié)]

第六章植物胚胎培養(yǎng)及離體授粉

[教學(xué)目的]

在了解胚胎培養(yǎng)意義基礎(chǔ)上，明確胚胎培養(yǎng)、胚乳培養(yǎng)、胚珠培養(yǎng)、子房培養(yǎng)的方法、離體授粉的方法。

[重點(diǎn)難點(diǎn)]

胚胎培養(yǎng)及離體授粉的概念、培養(yǎng)方法

[教學(xué)方法]

啟發(fā)式；講授；多媒體課件，演示。

[教學(xué)時(shí)數(shù)]

2課時(shí)。

[教學(xué)內(nèi)容]

?胚胎培養(yǎng)（embryoculture）植物胚胎培養(yǎng)是指對植物的胚（種胚）子房、胚珠和胚乳進(jìn)行離體培養(yǎng)，使其發(fā)育成完整植株的技術(shù)。

第一節(jié)植物胚培養(yǎng)

一、胚培養(yǎng)的類型:

胚培養(yǎng)的類型：幼胚培養(yǎng)、成熟胚培養(yǎng)。

在未成熟胚胎的培養(yǎng)中常見有三種明顯不同的生長方式，一種是繼續(xù)進(jìn)行正常的胚胎發(fā)育，維持“胚性生長”；另一種是在培養(yǎng)后迅速萌發(fā)成幼苗，而不繼續(xù)進(jìn)行胚性生長，通常稱為“早熟萌發(fā)”；第三種是在很多情況下，胚在培養(yǎng)基中能發(fā)生細(xì)胞增殖形成愈傷組織，并由此再分化形成多個(gè)胚狀體或芽原基。

二、幼胚培養(yǎng)方法

蘋果幼胚培養(yǎng)

（1）幼胚培養(yǎng)一般在授粉后30~50d內(nèi)取幼果，因這時(shí)種子內(nèi)的胚已開始發(fā)育，較易培養(yǎng)成功。成熟胚培養(yǎng)取自處于成熟期果實(shí)的種子。胚培養(yǎng)的材料進(jìn)行表面消毒。

（2）切開果實(shí)取出種子，切開子房壁取出胚珠，剝離珠被取出胚，接種在BA0.25+IAA

0.5的1/2MS培養(yǎng)基上。培養(yǎng)條件為25－30℃和1500－2000lx光照14h。

（3）分化增值時(shí)，把苗切段移植到加有BA0.5－1.0和CH300的1/2MS培養(yǎng)基上，在光下培養(yǎng)，可使綠苗得到增殖和生長。

（4）苗的生根和移栽，

三、成熟胚培養(yǎng)

成熟胚一般指子葉期后至發(fā)育完全的胚。它培養(yǎng)較易成功，在含有無機(jī)大量元素和糖的培養(yǎng)基上，就能正常生長成幼苗。

培養(yǎng)基用MS，適合于幼胚培養(yǎng)的糖為8%-12%，適合于成熟胚培養(yǎng)的糖為2%。加一些天然胚乳（椰乳）對胚培養(yǎng)有促進(jìn)作用。多數(shù)植物幼胚培養(yǎng)溫度25-30℃。光照：黑暗或弱光。

第二節(jié)植物胚乳培養(yǎng)

植物胚乳培養(yǎng)：將胚乳組織從母體上分離出來，通過離體培養(yǎng)，使其發(fā)育成完整植株的技術(shù)。

胚乳是由兩個(gè)單倍的極核和一個(gè)單倍的精子結(jié)合而成的3倍體組織。由它可獲得無子結(jié)實(shí)的3倍體植株。

一、植物胚乳培養(yǎng)方法

取授粉4-8d后的幼果，常規(guī)消毒后，在無菌條件下切開果實(shí)，取出種子，小心分離出胚乳。接種在培養(yǎng)基上，可用MS、White等，加入2，4-D或NAA0.5-2.0mg/L，BAO.1-1.Omg／L。

在25-27℃和黑暗條件或散射光下培養(yǎng)，約6-lOd胚乳開始膨大，再培養(yǎng)形成愈傷組織．這時(shí)應(yīng)轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，分化培養(yǎng)基可加入0.5—3.0mg／L的BA及少量的NAA。

二、影響因素：培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、光照

第三節(jié)植物胚珠和子房培養(yǎng)

一、胚珠的培養(yǎng)

胚珠培養(yǎng)是將授粉的子房在無菌條件下解剖后，取出胚珠置于培養(yǎng)基培養(yǎng)的過程。對胚珠進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，首先從花中取出子房進(jìn)行表面消毒，然后在無菌的條件下進(jìn)行解剖，取出胚珠，放在培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，基本培養(yǎng)基一般均用Nistch培養(yǎng)基，如MS、N6、B5等培養(yǎng)基也可采用。將胚珠培養(yǎng)成植株的關(guān)鍵是選擇胚的發(fā)育時(shí)期，實(shí)驗(yàn)證明發(fā)育到球形胚期的胚珠較易培養(yǎng)成功。

二、子房培養(yǎng)

子房培養(yǎng)指將子房從母體分離下來置于培養(yǎng)基上,使其進(jìn)一步發(fā)育成幼苗的技術(shù)。

子房培養(yǎng)意義:胚珠培養(yǎng)時(shí)分離胚珠困難,用子房培養(yǎng)，使未受精胚囊中單倍性細(xì)胞誘導(dǎo)發(fā)育成單倍植株；獲得雜種植株,在二個(gè)有性不親和物種雜交中,利用子房培養(yǎng)的方法可獲得雜種植株；為試管受精提供一項(xiàng)技術(shù)。

(一）培養(yǎng)方法

子房培養(yǎng)方法與胚珠的培養(yǎng)相似，如培養(yǎng)未受精的，用開花前1-5天的子房。消毒方法見78頁。用MS、B5等培養(yǎng)基。

由于子房存在性細(xì)胞和體細(xì)胞，都能產(chǎn)生愈傷組織，進(jìn)一步發(fā)育成植株，所以，植株有來源于性細(xì)胞的、有來源于體細(xì)胞。來源于性細(xì)胞的是單倍體，有來源于體細(xì)胞的是二倍體。

（二）影響因素

用MS、N6、B5等培養(yǎng)基，加激素，大麥子房培養(yǎng)加2，4—D0.5+NAA1.0+KT1.0。

第三節(jié)植物離體授粉

植物離體授粉指將未授粉的胚珠或子房從母體上分離下來,進(jìn)行無菌培養(yǎng),并用一

定的方式授無菌花粉,在試管內(nèi)實(shí)現(xiàn)受精技術(shù)。

（一）離體柱頭授粉

離體柱頭授粉指通過雄蕊的離體培養(yǎng)，使無菌花粉授于柱頭上，得到含有可育的種子的技術(shù)。

離體柱頭授粉方法是在花藥未開裂時(shí)取母體花蕾，消毒后，在無菌條件下，將整個(gè)雄蕊接種到培養(yǎng)基上，當(dāng)天或第二天，在其柱頭上授以無菌花粉。

（二）離體子房授粉

離體子房授粉指通過人工方法將花粉直接引入子房，使花粉粒在子房腔內(nèi)萌發(fā)，并進(jìn)行授精，最后獲得種子的技術(shù)。

1、活體子房內(nèi)授粉：活體植株上的子房用花粉懸浮液授粉，使子房發(fā)育并形成種子。操作步驟：將母本花蕾去雌并套袋，采父本花粉，母本花蕾去雌后1-2天將父本花粉引入子房。直接引入法：將子房頂端開一小口將花粉引入子房；注射法：用100mg/L硼酸將花粉制成懸浮液用注射器注入子房．

2、離體子房內(nèi)授粉：指將無菌花粉對離體培養(yǎng)的子房進(jìn)行授粉，最后獲得種子的技術(shù)。在花藥未開裂時(shí)取母體花蕾，消毒后，在無菌條件下，將整個(gè)雄蕊接種到培養(yǎng)基上，當(dāng)天或第二天，將子房頂端開一小口將花粉，將花粉引入子房

（三）離體胚珠授粉

離體胚珠授粉指離體培養(yǎng)未受精的胚珠上授粉,最后在試管內(nèi)獲得種子的技術(shù)。

離體子房和胚珠授粉是將花粉直接授于子房或胚珠，克服了柱頭和花柱組織造成不親和性的障礙，又克服了活體子房的脫落。

二、離體授粉的方法

授粉程序：確定開花時(shí)間、制備無菌子房或胚珠授、制備無菌花粉、子房或胚珠試管內(nèi)授粉。將母本花蕾開花前去雌并套袋，開花后1-2天將花蕾取下，經(jīng)消毒后，剝?nèi)プ臃勘谑古咧橥饴?，進(jìn)行無菌培養(yǎng)。在花藥未開裂時(shí)取母體花蕾，消毒后，在無菌條件

下，將整個(gè)花藥接種到培養(yǎng)基上，當(dāng)花粉散出時(shí)，將花粉授于胚珠。

三、影響離體授粉受精的因素

（一）外植體

1、柱頭和花柱：有的必須去掉柱頭和花柱，有的不必去掉。

2、胎座：胚珠或子房帶有胎座，有利于離體授粉受精成功。

3、外植體的生理狀態(tài)：多數(shù)開花后1-2天剝離的胚珠結(jié)實(shí)率高?？梢园褎冸x的胚珠的時(shí)間選擇在雄蕊授粉后和花粉管進(jìn)入子房之前。

（二）培養(yǎng)基等

MS、White、Nitsch等，糖4－7%，溫度20-250C,黑暗或弱光

[自學(xué)指導(dǎo)與訓(xùn)練方案]

復(fù)習(xí)思考題：

1、什么是植物胚胎培養(yǎng)、植物胚乳培養(yǎng)、胚珠和子房培養(yǎng)？

2、什么是植物離體授粉、離體柱頭授粉、離體胚珠授粉？

3、簡述離體授粉的程序。

參考書：

1、劉慶昌吳國良植物細(xì)胞組織培養(yǎng)2005.3中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社

2、李浚明編譯．植物組織培養(yǎng)教程[第2版]．北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2004[單元章節(jié)]

第七章花藥和花粉培養(yǎng)

[教學(xué)目的]

掌握花藥和花粉的區(qū)別，掌握花藥最佳接種時(shí)期、花藥培養(yǎng)的大致過程；基本掌握

花藥培養(yǎng)的發(fā)育途徑；初步掌握花藥和花粉培養(yǎng)的意義及花粉培養(yǎng)的過程

[重點(diǎn)難點(diǎn)]

花藥材料消毒和接種，花粉的分離，花粉培養(yǎng)方法，花粉發(fā)育過程

[教學(xué)方法]

啟發(fā)式；講授；多媒體課件

[教學(xué)時(shí)數(shù)]

2課時(shí)。

[教學(xué)內(nèi)容]

第一節(jié)花藥和花粉培養(yǎng)的意義

一、花藥和花粉培養(yǎng)的概念

花藥和花粉培養(yǎng)是指：花粉在培養(yǎng)基上改變其正常發(fā)育和機(jī)能，不經(jīng)受精發(fā)生細(xì)胞分裂，由單個(gè)花粉粒發(fā)育成完整植株?；ㄋ幣囵B(yǎng)屬器官培養(yǎng)，花粉培養(yǎng)屬細(xì)胞培養(yǎng)，但花藥培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)的目的一樣，都是要誘導(dǎo)花粉細(xì)胞發(fā)育成單倍體細(xì)胞，最后發(fā)育成單倍體植株。

二、花藥和花粉培養(yǎng)的應(yīng)用

（一）育種方面

由于花粉是單倍體細(xì)胞，誘發(fā)它經(jīng)愈傷組織或胚狀體發(fā)育成的植株都是單倍體植株，經(jīng)染色體加倍而成為正常結(jié)實(shí)純合二倍體植株?？s短育種年限。

（二）物種進(jìn)化研究：利用單倍體材料可查明其原始親本染色體組的構(gòu)成。

（三）遺傳分析：單倍體是研究基因性質(zhì)及其作用的良好材料。

（四）分子生物學(xué)

（五）植物基因克隆篩選

第二節(jié)花粉小孢子發(fā)育途徑

把花粉形成植株的途徑叫“花粉孢子體發(fā)育途徑”。把小孢子或花粉沿孢子體途徑發(fā)育成花粉植株的過程稱“雄性發(fā)育”。

一、花粉發(fā)育時(shí)期：適宜的花粉發(fā)育時(shí)期被子植物花粉發(fā)育為四個(gè)時(shí)期：四孢子期、單核期（小孢子期）、二核期、三核期（雄配子期）。

二、花藥材料的選擇：花藥培養(yǎng)大多數(shù)是單核期

三、培養(yǎng)基的選擇

花藥培養(yǎng)所采用的培養(yǎng)基是MS、N6、B5等。添加的激素有6-BA、KT和玉米素，2，4-D，NAA和IAA等。誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基可添加2，4-D，其濃度為1~3mg／L，分化培養(yǎng)基可添加2~3mg／L的BA，再加少許的IAA(0.2~0.5mg／L)?；ㄋ幣囵B(yǎng)在某些情況下，可不經(jīng)愈傷組織階段，直接產(chǎn)生胚狀體。但多數(shù)情況下是產(chǎn)生愈傷組織，這時(shí)尚需要進(jìn)一步轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)分化產(chǎn)生芽。

四、消毒接種培養(yǎng)

從健壯無病植株中采集花蕾，先用70％的酒精浸一下后，在飽和漂白粉溶液中浸10-20min，或用0．1％升汞液消毒7-lOmin，然后用無菌水洗3-5次。

花藥在消毒前，也可進(jìn)行預(yù)處理，將花蕾剪下放入水中，在冰箱4-5、下保持3-4d。低溫貯藏后，花藥容易發(fā)生胚狀組織。接種時(shí)把花蕾用解剖刀、鑷子小心剝開花蕾，取出花藥，注意去掉花絲，然后散落接種到培養(yǎng)基上。

第三節(jié)花粉的培養(yǎng)

花粉培養(yǎng)是指把花粉從花藥中分離出來，以單個(gè)花粉粒作為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)的技術(shù)。由于花粉已是單倍體細(xì)胞，誘發(fā)它經(jīng)愈傷組織或胚狀體發(fā)育成的植株都是單倍體植株。

一、花粉的分離

取新鮮未開的花蕾經(jīng)低溫處理，然后消毒，將花藥放到加有基本培養(yǎng)基的小燒杯中，用注射器的內(nèi)管在燒杯的壁上擠壓花藥，使花粉從花藥中釋放出來。用尼龍篩過濾掉藥壁組濾液再經(jīng)低速離心(100-160r／min)，上面的碎片可用吸管吸掉，再加入新鮮培養(yǎng)基。連續(xù)進(jìn)行兩次過濾，到每毫升含103~104個(gè)花粉的濃度就可以了。

簡單的方法是花粉從花藥中擠出后，用鑷子取出花粉空殼，放在培養(yǎng)基上培養(yǎng)。此法適于微室栽培，但往往有藥壁等體細(xì)胞混入。

二、培養(yǎng)基成分

培養(yǎng)基選用Nitsch作基本培養(yǎng)基，含有諸如硝酸鈣、硫酸、檸檬酸鐵、酵母浸出液和椰子胚乳等。

三、花粉培養(yǎng)方法

１、平板培養(yǎng)2、液體培養(yǎng)3、雙層培養(yǎng)4、看護(hù)培養(yǎng)法5、微室培養(yǎng)法

四、移栽訓(xùn)化，保持濕度80％－90％，弱光

五、白化苗現(xiàn)象

（一）白化苗特征

（二）白化苗的發(fā)生

（三）白化苗的控制

第四節(jié)單倍體植株鑒定和染色體數(shù)目加倍

一、花粉和花藥植株的倍性

花粉和花藥植株的倍性鑒定

二、花粉和花藥植株的染色體加倍

化學(xué)試劑誘變：人工誘導(dǎo)多倍體在育種上的應(yīng)用：花藥離體培養(yǎng)法秋水仙素處理單倍體植株染色體數(shù)目加倍的純合體

[自學(xué)指導(dǎo)與訓(xùn)練方案]

復(fù)習(xí)思考題：

(1)花藥培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)有何區(qū)別?

(2)花藥培養(yǎng)時(shí)選擇什么發(fā)育時(shí)期的花藥?為什么?

(3)花藥培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基配制有什么特點(diǎn)?

(4)花粉培養(yǎng)時(shí)怎樣使用微室培養(yǎng)和看護(hù)培養(yǎng)。

（5）單倍體植株的加倍。

討論：花藥培養(yǎng)與單倍體育種的前景如何？

參考書：

1、劉慶昌吳國良植物細(xì)胞組織培養(yǎng)2005.3中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社

2、李浚明編譯．植物組織培養(yǎng)教程[第2版]．北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2004

[單元章節(jié)]

第八章植物細(xì)胞培養(yǎng)

[教學(xué)目的]

了解植物細(xì)胞培養(yǎng)的方法及培養(yǎng)條件基礎(chǔ)上。明確單細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法

[重點(diǎn)難點(diǎn)]

單細(xì)胞分離，懸浮培養(yǎng)，單細(xì)胞培養(yǎng)方法

[教學(xué)方法]

啟發(fā)式；講授；多媒體課件

[教學(xué)時(shí)數(shù)]

2課時(shí)。

[教學(xué)內(nèi)容]

第一節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)：指對植物器官或愈傷組織上分離出的單細(xì)胞(或花粉細(xì)胞，卵細(xì)胞）進(jìn)行培養(yǎng)，形成單細(xì)胞無性系或再生植株的技術(shù)

一、植物細(xì)胞培養(yǎng)

（一）單細(xì)胞分離的方法

1、機(jī)械法：將葉片撕去表皮，在研缽中加10g葉片和40ml研磨介質(zhì)（20μmoI/L蔗糖＋10μmoI/LMgCI2+20μmoI/LTris－HCl緩沖液，pH7.8),輕研磨后用沙布過濾,,濾液經(jīng)過低速離心,游離細(xì)胞會沉降到試管低部，得到純化細(xì)胞。

2、酶解法：利用果膠酶處理，植物葉片使細(xì)胞間的中膠層發(fā)生降解，分離出具有代謝活性的細(xì)胞。

3、由愈傷組織分離單細(xì)胞：A、將未分化、易散碎的愈傷組織轉(zhuǎn)移到裝有適當(dāng)液體培養(yǎng)基的三角瓶中，然后將三角瓶置于水平搖床上以80-100r/min進(jìn)行震蕩培養(yǎng)，獲得懸浮細(xì)胞液。B、用孔徑約200μm的無菌網(wǎng)篩過濾，以去除大塊細(xì)胞團(tuán)；再以400r/min速度離心，除去比單細(xì)胞小的殘?jiān)槠?，獲得純凈的細(xì)胞懸浮液。

（二）單細(xì)胞培養(yǎng)

單細(xì)胞培養(yǎng)就是對分離得到的單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)其分裂增殖，形成細(xì)胞團(tuán)，在通過細(xì)胞分化形成芽、根等器官或胚狀體，甚至長成完整植株的技術(shù)。

1、平板培養(yǎng)

2、看護(hù)培養(yǎng)

3、微室培養(yǎng)法

4、條件培養(yǎng)基培養(yǎng)

二、植物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)

懸浮培養(yǎng)是指：將游離的植物細(xì)胞按一定細(xì)胞密度，懸浮在液體培養(yǎng)中進(jìn)行培養(yǎng)方法。（一）懸浮培養(yǎng)方法：分批培養(yǎng)、半連續(xù)培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)。

（二）懸浮細(xì)胞的繼代：懸浮細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)定期做繼代培養(yǎng)，最適合的周期為1-2周（三）培養(yǎng)細(xì)胞的同步化：同步培養(yǎng)是指在培養(yǎng)基中大多數(shù)細(xì)胞都能同時(shí)通過細(xì)胞周期（G1、S、G2和M）的各個(gè)階段。同步性的程度以同步百分?jǐn)?shù)表示。

（四）培養(yǎng)基的振蕩：培養(yǎng)基的振蕩目的是為改善液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)物的通氣狀況。三、培養(yǎng)細(xì)胞蛋白質(zhì)和DAN含量的變化

胚性愈傷組織中蛋白質(zhì)含量和合成速率高于非胚性愈傷組織。胚性愈傷組織中RNA合成速率高于非胚性愈傷組織。隨著體細(xì)胞胚發(fā)育，DNA合成量也明顯增多。

四、影響細(xì)胞培養(yǎng)的因素

（一）培養(yǎng)基：N6、MS、B5培養(yǎng)基適合于單子葉植物細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，NS、B5、LS、SL等培養(yǎng)基適合于雙子葉植物細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。

（二）細(xì)胞密度：指單位體積內(nèi)細(xì)胞數(shù)目，以每毫升培養(yǎng)液中含多少個(gè)細(xì)胞表示。

懸浮培養(yǎng)最低有效密度一般為0.5×1051.0×105個(gè)/ml。

（三）生長調(diào)節(jié)劑：2，4－D特別利于薄壁細(xì)胞生長，所以懸浮培養(yǎng)時(shí)常加入2，4-D。細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)細(xì)胞分裂，使細(xì)胞數(shù)量增多，量適當(dāng)。

（四）pH和CO2濃度：懸浮培養(yǎng)液緩沖能力弱，pH變化大，常用甘露醇（03－0.6moI/L)調(diào)節(jié)滲透壓、用添加椰子乳（10%）或聚乙稀吡咯烷酮（PVP，1%）來緩沖酸堿度變化。

第二節(jié)植物生長和活力的測定

一、細(xì)胞生長的測定

二、活力的測定

第三節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用

1、細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物（藥品、香料、染料、糖類等）。

2、是細(xì)胞生物學(xué)研究方面的一項(xiàng)重要技術(shù)。

3、為細(xì)胞融合于細(xì)胞于細(xì)胞雜交創(chuàng)造條件，可產(chǎn)出新品種。

4、為基因轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件。

5、篩選突變體（體細(xì)胞無性系變異）。

第四節(jié)人工種子

概念：“通過植物組織培養(yǎng)的方法獲得發(fā)育完全的胚狀體，并且將其用適當(dāng)?shù)姆椒ū４嫫饋硇纬深愃铺烊环N子的結(jié)構(gòu)”。

用人工種皮包被體細(xì)胞胚，可以制造人工種子，人工種皮：藻酸鈉，解決有些植物結(jié)子困難、發(fā)芽率低、繁殖困難等問題，人工胚乳用營養(yǎng)物質(zhì)、糖、激素、殺蟲劑、等。[自學(xué)指導(dǎo)與訓(xùn)練方案]

討論：單細(xì)胞培養(yǎng)目的和意義

參考書：

1、劉慶昌吳國良植物細(xì)胞組織培養(yǎng)2005.3中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社

2、李浚明編譯．植物組織培養(yǎng)教程[第2版]．北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2004

[單元章節(jié)]

第九章植物原生質(zhì)體的培養(yǎng)及細(xì)胞融合

[教學(xué)目的]

初步掌握原生質(zhì)體培養(yǎng)的意義；掌握原生質(zhì)體的分離方法，掌握原生質(zhì)體培養(yǎng)方法，基本掌握原生質(zhì)體融合的方法。

[重點(diǎn)難點(diǎn)]

原生質(zhì)體分離，原生質(zhì)體培養(yǎng)，原生質(zhì)體融合

[教學(xué)方法]

啟發(fā)式；講授；多媒體課件

[教學(xué)時(shí)數(shù)]

2課時(shí)。

[教學(xué)內(nèi)容]

第一節(jié)原生質(zhì)體分離

原理：植物原生質(zhì)體就是除去了細(xì)胞壁的一個(gè)為質(zhì)膜所包圍的的裸露細(xì)胞。構(gòu)成細(xì)胞壁的重要成分是纖維素和果膠等物質(zhì)，因此采用相應(yīng)的酶降解法可脫去細(xì)胞壁產(chǎn)生具有活力的原生質(zhì)體，其在合適的離體培養(yǎng)條件下具有繁殖，分化，再生成為完整植株的能力。

一、原生質(zhì)體分離

（一）植物材料1、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物2、葉肉細(xì)胞3、植物材料的預(yù)處理

（二）酶1、酶的種類2、滲透穩(wěn)定3、酶溶液的PH值

（三）原生質(zhì)體分離

（四）影響原生質(zhì)體分離的因素

二、原生質(zhì)體的純化

分離在的原生質(zhì)體中，常?；祀s有細(xì)胞碎片，維管束成分，未解離細(xì)胞，破碎的原生質(zhì)體以及微生物等。這些混雜物的存在會對原生質(zhì)體產(chǎn)生不良影響。此外，還需去掉酶溶液。以純化原生質(zhì)體。1)沉降法、2)漂浮法、3)不連續(xù)梯度離心法

三、原生質(zhì)體活力測定

1、FDA法

2、伊凡藍(lán)法

3、酚藏花紅染色法

4、目測法

三、影響原生質(zhì)體數(shù)量和活力的因素

（一）分離材料的生理狀態(tài)

（二）酶解條件：酶質(zhì)量、濃度、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶溶液的滲透壓

（三）分離條件：離心次數(shù)、離心速度、純化方法、分離持續(xù)時(shí)間

（四）環(huán)境條件：操作環(huán)境的溫度、分離用具的影響

第二節(jié)、原生質(zhì)體培養(yǎng)方法

一、原生質(zhì)體培養(yǎng)方法

（一）平板培養(yǎng)

（二）液體淺層培養(yǎng)

（三）液體－固體雙層培養(yǎng)

二、影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的主要因素

（一）原生質(zhì)體活力

（二）基因型

（三）起始培養(yǎng)密度

（四）滲透壓穩(wěn)定劑

（五）培養(yǎng)基成分

（六）培養(yǎng)條件

三、原生質(zhì)體再生

(一)細(xì)胞壁再生

1、細(xì)胞壁再生：原生質(zhì)體培養(yǎng)后1-2天可合成完整的細(xì)胞壁。

2、影響細(xì)胞壁再生的主要因素：基因型、供體細(xì)胞分化狀況、培養(yǎng)基的成分

3、再生細(xì)胞壁的鍳定：熒光染色法。

第三節(jié)原生質(zhì)體培養(yǎng)

一、原生質(zhì)體培養(yǎng)方法

二、影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素1、培養(yǎng)基成分2、滲透穩(wěn)定3、無機(jī)鹽4有機(jī)成分5、激素6、PH值7、原生質(zhì)體密度的影響

第四節(jié)植物體細(xì)胞融合

用兩個(gè)來自不同植物的體細(xì)胞融合成一個(gè)雜種細(xì)胞，且把雜種細(xì)胞培育成新的植物體的方法

一、原生質(zhì)體融合

由于體外培養(yǎng)的細(xì)胞很少會發(fā)生自發(fā)融合，因此要采用生物、化學(xué)或物理的方法人為地促使細(xì)胞融合。

（一）原生質(zhì)體融合原理

帶有大量負(fù)電荷的PEG與水之間的氫鍵結(jié)合，使溶液中自由水消失，由于高度脫水引起原生質(zhì)體凝集，形成大小程度不同的凝集物。鄰近原生質(zhì)體之間緊密接觸。

在原生質(zhì)體細(xì)胞膜與膜緊密接觸的部位，膜內(nèi)蛋白質(zhì)顆粒易位并凝聚。繼之，類脂質(zhì)分子的擾動和重排導(dǎo)致接觸的細(xì)胞膜局部發(fā)生融合，形成很小的細(xì)胞質(zhì)橋，之后它逐漸擴(kuò)大，兩個(gè)原生質(zhì)體最終融合。

使用化學(xué)促融劑時(shí)，Ca2+是必需的。關(guān)于Ca2+的作用機(jī)理，有的認(rèn)為是Ca2+和PO43-形成不溶于水的化合物，成為細(xì)胞間的鈣橋，由此引起融合。也有解釋為在Ca2+-高PH液的處理下,Ca2+和質(zhì)膜結(jié)合的PEG分子被洗脫,導(dǎo)致電荷重新分配,使原生質(zhì)體的一些陽電荷與另一些原生質(zhì)體的陰電荷連接,由此引起融合。

電融合（electrofusiontechnique)法電處理融合法是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的細(xì)胞融合技術(shù)，是融合率大為提高。融合過程的分子機(jī)制：是以電降解及雙向電泳的聯(lián)合作用為基礎(chǔ)。通過電泳，兩細(xì)胞膜緊密接觸，且膜表面的蛋白質(zhì)分子分離，產(chǎn)生了無蛋白的類脂區(qū)。

(二)細(xì)胞融合類型和方法

1、細(xì)胞融合類型

（1）對稱融合：使種內(nèi)或種間原生質(zhì)體融合時(shí)，產(chǎn)生核與核、胞質(zhì)與胞質(zhì)間重組的對稱雜種的技術(shù)（雙方原生質(zhì)體均帶有核基因組和細(xì)胞質(zhì)基因組的全部遺傳信息）。親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的種、屬間植物對稱融合后，而產(chǎn)生不對稱雜種。

（2）不對稱融合：通父母本在后代中貢獻(xiàn)不同，射線處理，化學(xué)處理

（3）微原生質(zhì)體融合(微核技術(shù)):細(xì)胞經(jīng)微核化處理后,形成外包有被膜,內(nèi)有染色體的微核為供體,與受體原生質(zhì)體融合,使部分基因轉(zhuǎn)移的技術(shù).

2、原生質(zhì)體融合方法

（1）化學(xué)融合劑促進(jìn)細(xì)胞融合（2）電處理融合法

（三）融合體的培養(yǎng)和發(fā)育

１、融合產(chǎn)物類型

2、融合體的發(fā)育過程：細(xì)胞壁再生、核融合、細(xì)胞增殖：

二、體細(xì)胞雜種選擇

原生質(zhì)體融合后產(chǎn)生同核體、異核體、沒有融合的原生質(zhì)體。

（一）雜種細(xì)胞的篩選

1、互補(bǔ)篩選法

2、機(jī)械篩選法

（二）雜種植株的選擇

雜種植株的再生與鑒定雜種植株的再生是指從愈傷組織培養(yǎng)出雜種植株的過程。[自學(xué)指導(dǎo)與訓(xùn)練方案]

復(fù)習(xí)思考題：

1、原生質(zhì)體培養(yǎng)有何意義？

2、如何分離原生質(zhì)體？

3、影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素有哪些？

4、原生質(zhì)體融合方式及過程如何？

5、原生質(zhì)體培養(yǎng)過程中的發(fā)育途徑如何？

參考書：

1、劉慶昌吳國良植物細(xì)胞組織培養(yǎng)2005.3中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社

[單元章節(jié)]

第十章植物離體繁殖

[教學(xué)目的]

掌握快速繁殖過程、試管苗的移栽、污染的預(yù)防措施，了解經(jīng)營思路、成本核算，學(xué)會制定生產(chǎn)計(jì)劃。

[重點(diǎn)難點(diǎn)]

試管苗增殖率的估算、生產(chǎn)計(jì)劃制定、工廠化生產(chǎn)的工藝流程、成本核算。[教學(xué)方法]

啟發(fā)式；講授；

[教學(xué)時(shí)數(shù)]

2課時(shí)。

[教學(xué)內(nèi)容]

概念：所謂離體繁殖，就是利用組織培養(yǎng)的方法，使植物的部分器官、組織在人工控制的適宜條件下，迅速擴(kuò)大培養(yǎng)，并移植到溫室或農(nóng)田繁殖出大量幼苗的繁殖方法。

第一節(jié)植物快繁的器官形成方式

一、短枝發(fā)生型

外植體是帶葉莖段，培養(yǎng)萌發(fā)，形成完整植株，再剪成帶葉莖段，繼代再成苗的繁殖方法。又稱微體扦插。

二、叢生芽發(fā)生型（頂芽和腋芽的發(fā)育）

指頂芽和腋芽的發(fā)育在適宜條件下，不斷發(fā)生腋芽而呈叢生狀芽。

三、不定芽發(fā)生型

不定芽方式（unfixedbud）指細(xì)胞或愈傷組織培養(yǎng)物，通過形成不定芽再生成植株，這是細(xì)胞和組織培養(yǎng)中常見的器官發(fā)生方式。

四、胚狀體發(fā)生型

胚狀體方式(somaticembryo)指由培養(yǎng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化出具胚芽、胚根、胚軸的胚狀結(jié)構(gòu)，進(jìn)而長成完整植株。

五、原球莖發(fā)生型

蘭花莖尖或腋芽接種后1~2個(gè)月培養(yǎng)的莖尖即可形成原球莖球狀體，以后即發(fā)芽生根長葉。

第二節(jié)快速繁殖過程

快速繁殖過程一般包括四個(gè)階段，即無菌培養(yǎng)物的建立、芽的增殖、誘導(dǎo)生根和試管苗的移植。

一、無菌培養(yǎng)物的建立

1．外植體的選擇2、外植體的滅菌3、初代培養(yǎng)

二、芽的誘導(dǎo)及擴(kuò)大化繁殖（增殖）

繼代培養(yǎng)是繼初代培養(yǎng)之后的連續(xù)數(shù)代的擴(kuò)繁培養(yǎng)過程。旨在繁殖出相當(dāng)數(shù)量的無根苗，最后能達(dá)到邊繁殖邊生根的目的。

繼代培養(yǎng)中擴(kuò)繁的方法包括：切割莖段、分離芽叢、分離胚狀體、分離原球莖等。切割莖段常用于有伸長的莖梢、莖節(jié)

三、根的誘導(dǎo)

當(dāng)材料增殖到一定數(shù)量后，就要使部分培養(yǎng)物分流到生根培養(yǎng)階段。生根培養(yǎng)可采用1／2或者1/4MS培養(yǎng)基，全部去掉細(xì)胞分裂素，并加入適量的生長素(NAA、IBA)。糖用20g/L

四、試管苗移栽馴化

試管苗移栽是組織培養(yǎng)過程的重要環(huán)節(jié)，這個(gè)工作環(huán)節(jié)做不好，就會造成前功盡棄。

第三節(jié)影響快繁的因素

一、外植體：來源、生理年齡、大小。莖尖臨界大小為攜帶1-2個(gè)葉原基，為0.2-0.3mm。

二、培養(yǎng)基：ＭＳ用的最多。蔗糖為好，濃渡2－4％，生產(chǎn)上用白糖。一般是高濃度的細(xì)胞分裂素和低濃度的生長素配合。

三、培養(yǎng)條件：光照1000－3000LX，生根3000－10000LX，每天光照14－16h,黑暗8－10h。溫度：250Ｃ左右，有些需要低溫處理。濕度：瓶內(nèi)濕度100％，環(huán)境濕度要求70％－80％。氣體；液體培養(yǎng)需要振蕩增加空氣，有的培養(yǎng)需要通氣好，可用通氣好封口膜。

四、繼代培養(yǎng)：芽的誘導(dǎo)及擴(kuò)大繁殖（繼代培養(yǎng)）易出現(xiàn)“馴化”現(xiàn)象，所以，要注意調(diào)整培養(yǎng)基激素濃度。

五、移栽：試管苗馴化鍛煉過程：

1、移栽前一周將生根苗連瓶移到煉苗棚，

2、移栽前2－3天打開瓶口煉苗

3、然后移栽，高濕、弱光、溫度適宜（20－250Ｃ）

第四節(jié)植物快繁的商業(yè)化應(yīng)用

植物快繁的重要用途是商業(yè)化生產(chǎn)，但是，目前商業(yè)化生產(chǎn)的種類不多。原因168頁，

一、商業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模及工藝流程

（一）試管苗生產(chǎn)規(guī)模的確定（快速繁殖工作的計(jì)劃安排）

1、商業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模確定應(yīng)以市場需求量為標(biāo)準(zhǔn)，要進(jìn)行市場需求量預(yù)測。

2、根據(jù)設(shè)備、人工、技術(shù)確定生產(chǎn)規(guī)模：

（二）商業(yè)化實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì)：盡量布局合理、方便。

（三）設(shè)施配套

（四）工藝流程

二、商業(yè)化生產(chǎn)及效益分析

（一）試管苗增殖率的估算

（二）快速繁殖工作的計(jì)劃制定和實(shí)施

1、計(jì)劃制定

2、生產(chǎn)計(jì)劃實(shí)施

（三）監(jiān)控

（四）效益分析

通過成本核算可以了解：生產(chǎn)過程各種消耗、管理工作好壞、各項(xiàng)技術(shù)措施的效果、產(chǎn)品成本等。

三、降低成本的措施

（一）提高勞動生產(chǎn)率

（二）減少設(shè)備投資，延長使用壽命。

（三）降低消耗

（四）降低污染，提高繁殖率和移栽成活率

（五）簡化培養(yǎng)基

四、注意的問題

（一）污染：污染指：組培過程中培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料滋生雜菌導(dǎo)致培養(yǎng)失敗現(xiàn)象。

1、污染的原因

2、污染的預(yù)防措施

（二）遺傳穩(wěn)定性

（三）繼代培養(yǎng)時(shí)材料的玻璃化

（四）初代培養(yǎng)外植體的褐變：外植體褐變是指在接種后，其表面開始褐變，有時(shí)甚至?xí)拐麄€(gè)培養(yǎng)基褐變的現(xiàn)象。

（五）黃化：試管苗失綠，葉片黃色斑駁現(xiàn)象。

[自學(xué)指導(dǎo)與訓(xùn)練方案]

復(fù)習(xí)思考題：

1、試述植物組織培養(yǎng)過程。

2、什么叫污染，污染的原因及預(yù)防措施有哪些？

3、什么叫褐變、玻璃化各如何控制？

4、簡述植物組織培養(yǎng)過程降低成本的措施

討論：植物組織培養(yǎng)商業(yè)性生產(chǎn)的基本要求（設(shè)施、工藝、苗木）

訓(xùn)練：植物組織培養(yǎng)商業(yè)性生產(chǎn)的成本與效益分析

參考書：

1、梅家訓(xùn)、丁習(xí)武主編組培快繁技術(shù)及其應(yīng)用2003.4中國農(nóng)業(yè)出版社

2、高新一、王玉英編著植物無性繁殖實(shí)用技術(shù)2003.12金盾出版社

3、熊麗等主編觀賞花卉的組培培養(yǎng)與大規(guī)模生產(chǎn)2002.12化工出版社

4、崔德才徐培文植物組織培養(yǎng)與工廠化育苗2003化學(xué)工業(yè)出版社

[單元章節(jié)]

第十一章植物無病毒苗的培育

[教學(xué)目的]

初步掌握無毒苗培養(yǎng)的意義，掌握熱處理和微莖尖脫毒的原理及方法，基本掌握無病毒植物的鑒定和利用，掌握脫毒苗木的保存和利用方法。

[重點(diǎn)難點(diǎn)]

無病毒苗培育的意義熱處理脫毒微莖尖培養(yǎng)脫毒病毒苗的鑒定無病繁殖與保存無毒苗的利用

[教學(xué)方法]

啟發(fā)式；講授；多媒體課件

[教學(xué)時(shí)數(shù)]

2課時(shí)。

[教學(xué)內(nèi)容]

第一節(jié)無病毒苗培育

一、病毒在植物上的危害

病毒的危害給植物生產(chǎn)帶來的損失是很大的，如草莓病毒的危害，使草莓產(chǎn)量嚴(yán)重降低，品質(zhì)大大退化。葡萄扇葉病毒使葡萄減產(chǎn)l0%-18%。

二、無病毒苗培育的意義

用組織培養(yǎng)方法生產(chǎn)無毒苗，是一個(gè)積極有效的途徑，由于排除了使用藥劑，所以對減少污染，防止公害，保護(hù)環(huán)境都有積極的意義。

三、植物病毒傳播方式

植物病毒從一植株轉(zhuǎn)移或擴(kuò)散到其它植物的過程稱為傳播。

傳播是病毒在植物群體中的轉(zhuǎn)移．可以分為介體傳播和非介體傳播兩類．

四、病癥類型

花卉病毒病的癥狀表現(xiàn)

1.變色

2.褪綠、黃化

3.斑點(diǎn)、條紋

4.環(huán)斑

5.明脈、黃脈、脈帶

6.皺葉、卷葉

7.叢生、矮化8.畸形9.壞死

五、莖尖培養(yǎng)脫毒

1．莖尖培養(yǎng)脫毒原理

感染病毒植株的體內(nèi)病毒的分布并不均勻，病毒的數(shù)量隨植株部位及年齡而異，越靠近莖頂端區(qū)域的病毒的感染深度越低，生長點(diǎn)(約0.1～1.0mm區(qū)域)則幾乎不含或含病毒很少、這是因?yàn)榉稚鷧^(qū)域內(nèi)無維管束，病毒只能通過胞間連絲傳遞，趕不上細(xì)胞不斷分裂和活躍的生長速度。在旺盛分裂的細(xì)胞中,代謝活性很高,使病毒無法復(fù)制。在莖尖中存在高水平內(nèi)源生長素，抑制病毒增殖。

第二節(jié)植物脫毒方法

一、生物學(xué)方法

（一）莖尖培養(yǎng)方法在進(jìn)行脫毒培養(yǎng)時(shí)，由于微小的莖尖組織很難靠肉眼操作，因而需用帶有適當(dāng)光源的簡單解剖鏡(8—40倍)。除了在進(jìn)行植物組織無菌培養(yǎng)一般工具外，還需要一套解剖刀。剝離莖尖（0.2-0.5mm，帶1－2個(gè)葉原基)時(shí)，應(yīng)盡快接種，莖尖暴露的時(shí)間應(yīng)當(dāng)