克隆動(dòng)物培育技術(shù)

關(guān)于克隆動(dòng)物培育技術(shù)第一頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日第二十五章動(dòng)物克隆技術(shù)第二頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日克隆動(dòng)物(clonalanimal)是指人們采用動(dòng)物克隆技術(shù)得到無(wú)性繁殖的在遺傳上與親本動(dòng)物完全相同的動(dòng)物。1997年世界衛(wèi)生組織解釋克隆為遺傳上同一的機(jī)體或細(xì)胞系(株)的無(wú)性生殖。分子水平上的克隆是指DNA分子的復(fù)制。細(xì)胞水平上的克隆是指細(xì)胞或組織培養(yǎng)。個(gè)體水平上的克隆是指動(dòng)、植物的無(wú)性繁殖，其中，動(dòng)物克隆偏重于指細(xì)胞核移植。第三頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日第一節(jié)動(dòng)物克隆技術(shù)的

理論基礎(chǔ)及發(fā)展簡(jiǎn)況第四頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日動(dòng)物克隆技術(shù)的理論基礎(chǔ)是動(dòng)物細(xì)胞發(fā)育的全能性。①動(dòng)物細(xì)胞核都含有與生殖細(xì)胞相同的遺傳信息，因此具有發(fā)育的全能性。兩方面突破：②卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中含有啟動(dòng)供體核重新編程(reprogramming)的各種因子。已經(jīng)分化的細(xì)胞核重新回到未分化的起點(diǎn)，重新編程形成重構(gòu)胚并被激活。第五頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日一、細(xì)胞發(fā)育的全能性（一）全能性的概念全能性(totipotency)是指分裂球發(fā)育成為完整胚胎的能力。包括細(xì)胞發(fā)育全能性和細(xì)胞核發(fā)育全能性。第六頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日1、細(xì)胞的全能性細(xì)胞分化能力的強(qiáng)弱稱(chēng)為發(fā)育潛能。根據(jù)發(fā)育潛能可以將細(xì)胞分成全能性、多能性、單能性細(xì)胞及終末分化細(xì)胞。受精卵以及胚胎干細(xì)胞的發(fā)育具有全能性；多能造血干細(xì)胞具有的發(fā)育潛能稱(chēng)為多能性；終末分化細(xì)胞，如人的成熟紅細(xì)胞。細(xì)胞全能性的基礎(chǔ)在于所有細(xì)胞的細(xì)胞核包含一個(gè)物種的全套染色體組，具有發(fā)育成一個(gè)完整個(gè)體所需要的全部遺傳物質(zhì)。第七頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日2、細(xì)胞核的全能性細(xì)胞核的全能性是指一個(gè)細(xì)胞核具有該物種完整的遺傳信息，在適當(dāng)條件下能夠發(fā)育成一個(gè)完整個(gè)體的能力。將分化的細(xì)胞的細(xì)胞核導(dǎo)入去核的卵細(xì)胞或受精卵，發(fā)育成一個(gè)完整的個(gè)體（如體細(xì)胞克隆動(dòng)物），就是細(xì)胞核全能性。第八頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日（二）證明細(xì)胞全能性的研究事例1、動(dòng)物早期胚胎細(xì)胞的全能性德國(guó)VirchowR.論斷“細(xì)胞來(lái)自細(xì)胞”。Roux(1888)用燒燙的針破壞蛙2細(xì)胞胚胎。Driesch(1892)以海膽做實(shí)驗(yàn)。Spemann（1901～1903）用細(xì)發(fā)結(jié)扎蠑螈受精卵。Roux(1888)用燒燙的針破壞蛙2細(xì)胞胚胎觀(guān)察胚胎發(fā)育情況第九頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日2、已分化的動(dòng)物細(xì)胞的全能性Spemann蠑螈受精卵結(jié)扎實(shí)驗(yàn)⑴兩棲類(lèi)的核移植實(shí)驗(yàn)第十頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日Spemann的蠑螈受精卵結(jié)扎實(shí)驗(yàn)(1938)

用頭發(fā)將受精卵沿第一次卵裂面結(jié)扎成2個(gè)半球，使細(xì)胞核留在其中的一個(gè)半球中，兩半球之間留有一條小縫隙，當(dāng)有核的一側(cè)發(fā)育到8細(xì)胞期時(shí)，另一側(cè)還未開(kāi)始分裂；當(dāng)有核的一側(cè)發(fā)育到16細(xì)胞期時(shí)，一個(gè)細(xì)胞核進(jìn)入無(wú)核的一側(cè)，此時(shí)將胚胎完全結(jié)扎；140d后，每一側(cè)都發(fā)育成為一個(gè)完整的胚胎。第十一頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日1952年，美國(guó)科學(xué)家Briggs和King以美洲豹蛙做核移植實(shí)驗(yàn)。將未分化的蛙囊胚細(xì)胞的細(xì)胞核移植到蛙去核受精卵中，獲得了正常發(fā)育的蝌蚪。后來(lái)的實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論：蛙胚胎細(xì)胞核的發(fā)育潛能隨著胚胎發(fā)育的進(jìn)程、細(xì)胞分化的提高而逐步下降。第十二頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日1962年，Gurdon通過(guò)連續(xù)核移植，將爪蟾蝌蚪已經(jīng)分化的腸上皮細(xì)胞核移植到去核的卵母細(xì)胞中，獲得了可育的成熟個(gè)體。第十三頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日1977年，Gurdon以一只白化爪蟾蝌蚪細(xì)胞為供體，克隆到了30只白化非洲爪蟾。第十四頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日⑵哺乳類(lèi)的核移植實(shí)驗(yàn)1981年，瑞士科學(xué)家Illmensee和美國(guó)科學(xué)家Hoppe首次報(bào)道哺乳動(dòng)物細(xì)胞核移植獲得成功。ICR(白色)ICR(白色)(棕色)(黑色)第十五頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日⑵哺乳類(lèi)的核移植實(shí)驗(yàn)1983年，McGrath和Solt結(jié)合顯微技術(shù)與細(xì)胞融合技術(shù)，將單細(xì)胞期小鼠胚胎與未受精卵用病毒誘導(dǎo)融合的方法獲得了后代。1996年，Campbell等采集9d齡的綿羊胚胎進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以培養(yǎng)液中血清濃度遞減的饑餓培養(yǎng)，誘導(dǎo)6-13代細(xì)胞進(jìn)入靜止期，移入去核的卵母細(xì)胞，產(chǎn)下了克隆羊。這是用已分化細(xì)胞系經(jīng)誘導(dǎo)進(jìn)入Go期核移植產(chǎn)下的首例克隆羊。第十六頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日⑵哺乳類(lèi)的核移植實(shí)驗(yàn)1997年，英國(guó)Roslin研究所的Wilmut等用乳腺細(xì)胞核移植培育克隆綿羊——“多莉(Dolly)”。Wilmut等采用6歲母羊（白面）懷孕3個(gè)月時(shí)的乳腺細(xì)胞進(jìn)行核移植。供體核在血清濃度從10％降至0.5％的培養(yǎng)液中誘導(dǎo)至靜止期，然后移入去核卵母細(xì)胞，發(fā)育為桑椹胚和囊胚再移植到受體母羊（黑面），結(jié)果產(chǎn)羔l頭（白面），即著名的“多莉”。這是世界上首次用體細(xì)胞克隆獲得的后代，劃時(shí)代意義在于證明動(dòng)物成體細(xì)胞核仍具有發(fā)育全能性。第十七頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日體細(xì)胞核移植法培育克隆綿羊一多莉第十八頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日二、供體核重新編程早期使用原核期的受精卵和2細(xì)胞胚胎。1986年后采用去核的處在MⅡ期(第二次分裂中期)的成熟卵母細(xì)胞作胞質(zhì)受體。1、受體細(xì)胞的來(lái)源第十九頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日2、重構(gòu)胚核質(zhì)適應(yīng)機(jī)理Gurdon（1966）研究發(fā)現(xiàn)，核在移植前轉(zhuǎn)錄rRNA基因，移入卵后，核仁消失，rRNA基因失活；隨著胚胎的發(fā)育，rRNA基因活性恢復(fù)，核仁重現(xiàn)。表明卵細(xì)胞質(zhì)對(duì)核活性有重構(gòu)效應(yīng)。事實(shí)上，核重編程同核質(zhì)間蛋白質(zhì)交換有關(guān)。許多細(xì)胞質(zhì)因子，如組蛋白(去)、乙?；?、DNA甲基化/去甲基化酶等進(jìn)入核內(nèi)；核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，如異染色質(zhì)蛋白、組蛋白H1等輸出核外。（1）核質(zhì)互作第二十頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日（2）核重編程核重編程的過(guò)程就是基因重新被激活的過(guò)程。體細(xì)胞去分化過(guò)程伴隨著與染色質(zhì)相關(guān)的蛋白(如連接組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子)的重構(gòu)、基因組甲基化變化、組蛋白組裝及核小體形成等。染色質(zhì)解聚對(duì)核重編程可能是必須的。核重編程涉及到基因組DNA甲基/去甲基化和組蛋白乙?；?。通過(guò)基因組甲基化來(lái)改變DNA與蛋白質(zhì)間的作用。第二十一頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日（3）端粒在細(xì)胞分化過(guò)程中，核重編程須去除染色質(zhì)上的獲得性修飾。牛成纖維細(xì)胞核克隆胚胎的端粒酶活性比胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞的端粒酶活性顯著降低；用血清饑餓法進(jìn)行細(xì)胞傳代，與不經(jīng)處理的早期傳代細(xì)胞相比，端粒酶活性降低30%-50%。體外培養(yǎng)牛胎兒成纖維細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞晚期傳代中發(fā)現(xiàn)了端?？s短。第二十二頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日3、細(xì)胞周期細(xì)胞周期分四個(gè)時(shí)期，包括G1期，S期，G2期，M期。有絲分裂中，成熟促進(jìn)因子（也叫M期促進(jìn)因子MPF）調(diào)控細(xì)胞由間期向M期轉(zhuǎn)變。核受體一般是MⅡ期卵母細(xì)胞，但是MⅡ期卵母細(xì)胞MPF的含量依然很高，將誘導(dǎo)移植核發(fā)生一系列的形態(tài)變化，包括核膜破裂(NEBD)，早熟染色體凝集(PCC)。只能將G1期(二倍體)的核移入未經(jīng)活化的MⅡ期的卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，才能獲得染色體倍體正常且能正常發(fā)育的重組胚胎。第二十三頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日供體核重新編程的機(jī)理

具有全能性的細(xì)胞核是否具有重編程的能力，主要取決于細(xì)胞質(zhì)啟動(dòng)供體核重新編程的因子。核重編程涉及到基因組DNA甲基/去甲基化和組蛋白乙?；?。在細(xì)胞分化過(guò)程中，核重編程須去除染色質(zhì)上的獲得性修飾。與端粒酶活性降低、端?？s短有關(guān)。第二十四頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日第二節(jié)動(dòng)物克隆技術(shù)方法第二十五頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日動(dòng)物克隆技術(shù)方法可分為胚胎分割、胚胎嵌合、細(xì)胞核移植、雌核或雄核發(fā)育等。細(xì)胞核移植方法又分為胚胎細(xì)胞核移植、胚胎干細(xì)胞核移植、胎兒成纖維細(xì)胞核移植和體細(xì)胞核移植等。第二十六頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日一、細(xì)胞核移植克隆技術(shù)供體細(xì)胞（核供體）的準(zhǔn)備。受體細(xì)胞（細(xì)胞質(zhì)受體）的準(zhǔn)備。核移植。核質(zhì)融合及卵母細(xì)胞質(zhì)的激活。重構(gòu)胚的培養(yǎng)和移植。重復(fù)克隆?？寺?dòng)物的鑒定。其基本技術(shù)環(huán)節(jié)除顯微操作技術(shù)外，主要包括：第二十七頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日體細(xì)胞克隆豬圖解細(xì)胞核移植技術(shù)進(jìn)行動(dòng)物克隆的主要步驟，包括供體細(xì)胞的選擇、受體細(xì)胞的去核、核移植、胚胎融合、重構(gòu)胚胎移植，以及連續(xù)核移植等等。第二十八頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日1、供體細(xì)胞的準(zhǔn)備常用的供體細(xì)胞有3大類(lèi)：早期胚胎細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和體細(xì)胞。核移植時(shí)可以將整個(gè)細(xì)胞作為供體，也可以挑取細(xì)胞核或含有少量細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞移植到受體中供體細(xì)胞的準(zhǔn)備方面，通常采用建立細(xì)胞系的辦法。包括：①胚胎干細(xì)胞系的建立。②TNT4細(xì)胞系的建立。將供體細(xì)胞的細(xì)胞周期做同步法處理，即G0期的誘導(dǎo)。方法是：在5d內(nèi)將培養(yǎng)液的血清濃度由10.0%降至0.5%。第二十九頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日2、受體細(xì)胞的準(zhǔn)備受體細(xì)胞有3類(lèi)：卵母細(xì)胞、原核期受精卵和2細(xì)胞期胚胎細(xì)胞。獲得卵母細(xì)胞多采用活體超排的方法。卵母細(xì)胞的去核目前多采用顯微操作法，即在顯微鏡下用外徑為20μm的微細(xì)玻璃管吸管吸取細(xì)胞核。常用的去核方法有盲吸法、半卵法和功能去核法等。第三十頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日3、核移植在顯微操作儀下將供體細(xì)胞核移入受體細(xì)胞中。根據(jù)供體移入到受體細(xì)胞的不同部位，可以分為帶下（透明帶下）注射和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)注射。第三十一頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日4、核質(zhì)融合及卵母細(xì)胞質(zhì)的激活核質(zhì)融合的方法有：(1)病毒融合法如將仙臺(tái)病毒與供體核一起注入去核的受精卵中，促進(jìn)細(xì)胞融合。(2)電融合法將重構(gòu)胚置于電場(chǎng)下，以電脈沖促進(jìn)融合。(3)Honolulu技術(shù)利用吸液管將遺傳物質(zhì)取出，然后注入卵細(xì)胞中。以機(jī)械和化學(xué)激活方式促使重構(gòu)胚的融合。第三十二頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日5、重構(gòu)胚的培養(yǎng)和移植一種是體外培養(yǎng)，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下培養(yǎng)到一定時(shí)期，然后進(jìn)行胚胎移植。另一種方法是采用中間受體培養(yǎng)，在核質(zhì)融合后，將重構(gòu)胚用瓊脂糖包埋，移入動(dòng)物的輸卵管或子宮，發(fā)育到桑椹胚或囊胚后，再重新移入假孕受體子宮。第三十三頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日6、重復(fù)克隆(連續(xù)核移植)如有必要，將核移植胚胎培養(yǎng)至桑椹胚或囊胚后繼續(xù)做核供體重復(fù)克隆，可以顯著提高克隆成活率。第三十四頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日7、克隆動(dòng)物的鑒定克隆動(dòng)物出生后，從形態(tài)、性別上和分子生物學(xué)水平上鑒定，以確定所克隆的動(dòng)物在遺傳上是否真的來(lái)源于供體細(xì)胞系。分子生物學(xué)鑒定方法有PCR、Southern、Northern等。第三十五頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日克隆綿羊——多莉（Dolly）的培育示意圖第三十六頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日二、人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育技術(shù)技術(shù)關(guān)鍵：一是使精子的遺傳物質(zhì)失活且保持精子激活卵子發(fā)育的能力；二是誘導(dǎo)卵子二倍體形成。使精子遺傳物質(zhì)失活的辦法一般是采用輻射處理(如γ線(xiàn)、X射線(xiàn)、紫外線(xiàn)等)。誘導(dǎo)卵子二倍體形成的辦法，一是在受精后不久抑制第二極體排出；二是在受精卵第一次卵裂時(shí)，抑制有絲分裂?？梢杂脺囟?冷休克或熱休克)、靜水壓和化學(xué)(秋水仙素、細(xì)胞松弛素B等)等方法。第三十七頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日在受精過(guò)程的原核期中用顯微手術(shù)操作把雄性原核吸出，再把變成單倍體的卵子用細(xì)胞松弛素B處理回復(fù)到二倍體之后，再移植到假孕動(dòng)物，使之發(fā)育成胎仔。第三十八頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日二、人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育技術(shù)

紅鯽 鯉魚(yú)↓↓卵子←精子←紫外燈照射(激活)(遺傳物質(zhì)滅活)(30W,45min)↓單倍體胚胎←冷休克(0～4℃，30min)↓二倍體胚胎→純合二倍體紅鯽(近交系)雌核發(fā)育二倍體紅鯽的培育第三十九頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日三、胚胎嵌合技術(shù)選擇兩對(duì)毛色不同的近交系小鼠（例如白色的SJL小鼠與黑色的BL/10小鼠）。在8分裂球時(shí)，用蛋白酶消化透明帶，在37℃的條件下，將來(lái)自?xún)蓚€(gè)品系的兩種分裂球彼此接觸，任其粘成一個(gè)具有雙倍體積的早期胚胎，繼續(xù)培養(yǎng)成胚囊，移植到寄養(yǎng)母鼠的子宮內(nèi)。新生小鼠表現(xiàn)出黑、白條或塊狀的毛色，說(shuō)明是一只嵌合體小鼠。第四十頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日嵌合體小鼠培育過(guò)程第四十一頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日四、胚胎分割技術(shù)用顯微術(shù)將未著床的早期胚胎一分為二、四或更多，然后分別移植給受體，妊娠產(chǎn)仔。胚胎分割不是嚴(yán)格意義上的克隆。胚胎分割已得到多種動(dòng)物的胚胎雙生后代，如兔、小鼠、綿羊、牛、山羊、馬和豬的同胚雙生后代。80年代以來(lái)，牛胚胎二分割已應(yīng)用于生產(chǎn)。胚胎分割是胚胎移植的重要措施，也是性別鑒定和核移植等生物工程的基本技術(shù)。第四十二頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日第三節(jié)動(dòng)物克隆技術(shù)的應(yīng)用第四十三頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日一、克隆技術(shù)為近交系實(shí)驗(yàn)動(dòng)物培育

提供了新途徑克隆技術(shù)為近交系實(shí)驗(yàn)動(dòng)物培育提供了新途徑，通過(guò)這一途徑培育的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，遺傳組成完全一致，并且比用傳統(tǒng)的近親繁殖方法更省時(shí)，品系更純。第四十四頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日二、克隆技術(shù)為解決

異體器官移植供體帶來(lái)了希望豬的器官在大小、形狀及生理特點(diǎn)等方面與人的器官非常相似?？梢詫⒇i作為異體器官移植的供體。在異源移植方面，最主要的問(wèn)題就是急性排斥問(wèn)題。將豬細(xì)胞的細(xì)胞膜上的A-1，3-半乳糖昔酶基因敲除或經(jīng)過(guò)修飾去除其免疫原性，可以解決豬器官在人體的急性排斥問(wèn)題。第四十五頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日三、治療性克隆技術(shù)

已成為人類(lèi)醫(yī)療史上革命性的技術(shù)治療性克隆是指利用克隆技術(shù)結(jié)合人的胚胎干細(xì)胞分離技術(shù)，在體外培養(yǎng)人體細(xì)胞、組織或器官來(lái)修復(fù)人體損傷的細(xì)胞、組織或器官的過(guò)程。將病人自身體細(xì)胞移植到去核的卵母細(xì)胞內(nèi)形成重構(gòu)胚，從重構(gòu)胚中分離出ES細(xì)胞，并誘導(dǎo)其定向分化為需要替代的細(xì)胞，如分化為心肌細(xì)胞修復(fù)受損的心臟、分化為胰島細(xì)胞治療糖尿病、分化為多巴胺神經(jīng)原治療帕金森氏癥等。人類(lèi)治療