酶免疫分析技術(shù)在生物藥物分析中的應(yīng)用-課件

第四節(jié)酶免疫分析技術(shù)在生物藥物分析中的應(yīng)用其應(yīng)用主要包括以下幾個方面：藥物含量（活性）測定宿主蛋白殘留檢測抗生素殘留檢測雜質(zhì)檢測污染物檢測藥物原材料檢測藥物摻假檢測1大家好第四節(jié)酶免疫分析技術(shù)在生物藥物分析中的應(yīng)用其應(yīng)用主要包括以一、GLP-1活性檢測CyclicAdenosineMonophosphate(cAMP)ELISAKit2大家好一、GLP-1活性檢測CyclicAdenosineMoGLP-1GLP-1是已發(fā)現(xiàn)的促胰島素分泌作用最強(qiáng)的腸肽類激素，它通過與GLP-1受體(GLP-1R)結(jié)合發(fā)揮作用1）GLP-1可通過刺激胰島素分泌、抑制胰高血糖素分泌及胃排空來降低血糖2）GLP-1還有減緩β細(xì)胞凋亡，促進(jìn)其再生的獨特作用3）GLP-1還能減慢胃排空速度，通過作用下丘腦，抑制食欲。3大家好GLP-1GLP-1是已發(fā)現(xiàn)的促胰島素分GLP-1結(jié)合GLP-1R后，激活細(xì)胞膜內(nèi)環(huán)腺苷酸(cAMP)和絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路胰島成熟β細(xì)胞的GLP-1受體偶聯(lián)Gs，活化腺苷酰環(huán)化酶，產(chǎn)生cAMP，后者與葡萄糖協(xié)同刺激胰島素合成和分泌，刺激胰島素基因轉(zhuǎn)錄和胰島素原生物合成，可降低胰高血糖素濃度并抑制胰高血糖素分泌，增強(qiáng)細(xì)胞對胰島素的敏感性，刺激胰島素依賴性糖原合成，降低餐后血糖濃度。4大家好GLP-1結(jié)合GLP-1R后，激活細(xì)胞膜內(nèi)環(huán)腺苷酸(cAMP3535LigandLigandsACsGTPATPcAMPPKACa2+NFAT-PNFATCalcineurinCREB-PNFAT-RECREF-LuciferseR-LuciferseGLP-1Receptor3535報告基因檢測原理5大家好3535LigandLigandsACsATPcAM試驗原理采用直接競爭ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被cAMP特異性抗體，樣品中cAMP將和標(biāo)準(zhǔn)HRP-cAMP競爭結(jié)合微孔條上cAMP特異性抗體，用TMB底物顯色，吸光值與樣品中cAMP的含量成負(fù)相關(guān)。以吸光值為縱坐標(biāo)，樣品濃度為橫坐標(biāo)，按四參數(shù)法回歸擬合對照品和供試品的量效曲線，得出半效量濃度，求得供試品相對生物活性。6大家好試驗原理采用直接競爭ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被c操作程序：1、取微孔板條，加入cAMP特異性抗體，50ul/孔，室溫1h;2、洗滌后，向不同孔中分別cAMP、對照或細(xì)胞裂解上清品（樣品），100ul/孔；3、向孔中加入HRP-cAMP，50ul/孔，室溫作用2h；4、洗滌后，向孔中加入TMB溶液，200ul/孔，室溫作用30min；5、向孔中加入終止液，100ul/孔，測定OD450nm/570nm7大家好操作程序：1、取微孔板條，加入cAMP特異性抗體，50ul/數(shù)據(jù)與結(jié)果1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：（1）測定各濃度梯度下各孔對照品和供試品相應(yīng)的吸光值，并分別計算平均值；（2）以吸光值為縱坐標(biāo)，樣品濃度為橫坐標(biāo)，按四參數(shù)法回歸擬合對照品和供試品的量效曲線，得出半效量濃度；對照品EC50；測試樣EC502.數(shù)據(jù)處理：

供試品相對生物活性（%）=對照品EC50/供試品EC50100%

其中：對照品和供試品的EC50分別表示對照品和測試樣的半效量的濃度。四參數(shù)方程中的C值即相當(dāng)于半效量的濃度(EC50)。8大家好數(shù)據(jù)與結(jié)果1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：8大家好典型的測定結(jié)果及回歸曲線9大家好典型的測定結(jié)果及回歸曲線9大家好10大家好10大家好二、宿主蛋白（HCP）殘留檢測Cygnus

F550

CHO

HCP

ELISA

Kit11大家好二、宿主蛋白（HCP）殘留檢測Cygnus

F550

CH宿主細(xì)胞蛋白污染物CHO宿主蛋白殘留

E-coli宿主蛋白殘留

酵母菌宿主蛋白殘留

HEK293宿主蛋白殘留12大家好宿主細(xì)胞蛋白污染物CHO宿主蛋白殘留12大家好2D分離CHO、酵母、大腸桿菌等細(xì)胞系的全蛋白譜將2DGel上的全蛋白轉(zhuǎn)移至膜上，用多克隆抗體孵育后進(jìn)行WesternBlot化學(xué)發(fā)光檢測，以確認(rèn)多克隆抗體能夠與哪些宿主細(xì)胞蛋白結(jié)合通過WesternBlot檢測結(jié)果（多抗能檢測到的HCP數(shù)量）與2D膜上檢測結(jié)果（總HCP數(shù)量）的比較，得出用于評價檢測的多克隆抗體特異性及適用性的MatchRate評估HCP定量用多克隆抗體的特異性13大家好2D分離CHO、酵母、大腸桿菌等細(xì)胞系的全蛋白譜評估HCP定14大家好14大家好試驗原理采用雙位點酶聯(lián)免疫檢測法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被抗CHOCHP多抗，免疫反應(yīng)構(gòu)成為夾層式結(jié)構(gòu)：固相抗體-HCP-酶標(biāo)記抗體。反應(yīng)結(jié)束后清洗酶標(biāo)板去除未結(jié)合反應(yīng)物，添加TMB底物顯色，吸光值與樣品中CHO宿主蛋白的含量成正相關(guān)。15大家好試驗原理采用雙位點酶聯(lián)免疫檢測法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被抗C檢測步驟：（1）于每個反應(yīng)孔中，加入100μL抗CHOHCP多抗-HRP；（2）從標(biāo)準(zhǔn)蛋白液、對照和樣品中吸取50μL上清加入到已標(biāo)記好的反應(yīng)孔中；180rpm下室溫、振蕩培養(yǎng)2h；（3）棄去孔內(nèi)溶液，每孔加350μL洗滌液，重復(fù)洗滌4次；（4）

于每個反應(yīng)孔中，加入100μLTMB底物溶液，于室溫孵育30min；（5

）于每個反應(yīng)孔中，加入100μL終止液；依序讀取OD450/650nm吸收值(空白對照孔調(diào)零)。（6）數(shù)據(jù)處理：根據(jù)測定每孔標(biāo)準(zhǔn)液吸光值繪制四參數(shù)邏輯曲線，然后根據(jù)樣品吸光值計算出樣品中HCP濃度。16大家好檢測步驟：（1）于每個反應(yīng)孔中，加入100μL抗CHOH17大家好17大家好18大家好18大家好19大家好19大家好20大家好20大家好21大家好21大家好ELISA法研究藥物作用靶點（GPⅡb/Ⅲa受體）實驗原理根據(jù)ELISA實驗原理，先在96孔板上包被纖維蛋白原，然后同時加入GPIIb/IIIa受體和待測樣品，再加酶標(biāo)抗體與GPIIb/IIIa受體結(jié)合，最后加入底物，酶作用于底物顯色，在405nm測得OD值，OD值與GPIIb/IIIa受體量成正比。如果樣品與GPIIb/IIIa受體結(jié)合，就會降低纖維蛋白原與受體的結(jié)合，導(dǎo)致所測的OD值降低。22大家好ELISA法研究藥物作用靶點（GPⅡb/Ⅲa受體）實驗原理2實驗步驟：首先將纖維蛋白原（10μg/ml）用bufferA（0.1MNa2CO3,PH9.5）包被于96孔板上（100μl/well）（空白對照:不包被纖維蛋白原），4°C孵育過夜；TACTS（0.02MTris-HCl,PH7.5，0.15MNaCl，1mMCaCl2,0.02%NaN3,0.05%Tween20）沖洗一次，每孔200μl，3min；用含1%BSA的TACTS在37°C封閉1h（200μl/well）,TACTS洗三次；整合素αIIbβ3（20μg/ml、50μL/well）加一定濃度的待測樣品50μl作為樣品組；加孵育液做陰性對照組；37°C下孵育2h；TACTS洗三次；加一抗（鼠抗人CD61抗體，含0.5%BSA,TACTS稀釋，1:2000(體積比)，100μL/孔）37°C下孵育1h；23大家好實驗步驟：23大家好TACTS洗三次；加二抗（堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，含0.5%BSA,TACTS稀釋，1:1000，100μL/孔），37°C下孵育1h；TACTS洗三次，加底物（對硝基苯磷酸二鈉溶液(PNPP)1mg/ml，用bufferB溶解，200μL/well），37℃下孵育30min；加入50μL3MNaOH(稱0.6g加5ml蒸餾水)終止反應(yīng)；5min內(nèi)405nm波長下檢測吸光度。24大家好TACTS洗三次；加二抗（堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，數(shù)據(jù)處理通過以下公式計算抑制率：[(X?Y)/(X-Z)]×100%。X代表生理鹽水組OD值；Y代表樣品組OD值；Z代表空白對照組OD值。實驗結(jié)果都用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（

±s）表示，采用t檢驗進(jìn)行單因素方差分析。p<0.05界定為具有統(tǒng)計學(xué)意義，所有數(shù)據(jù)處理均使用GraphPadPrism6軟件(GraphPadSoftware，美國)。25大家好數(shù)據(jù)處理25大家好溶液配制及注意事項（60well大概用量）1.bufferA：0.1MNa2CO350ml：取固體0.53g溶液50ml蒸餾水中，調(diào)PH9.5.2.TACTS洗脫液（需300ml）：定容100ml，pH7.5，Tris-HCl：0.2423g；NaCl：0.8766g；NaN3：200μL；Tween20:50μL；CaCl2:0.0222g。孵育液（50ml）：TACTS加0.5%BSA封閉液（20ml）：TACTS加1%BSA3.受體αⅡbβ3（4ml）：配制1.63mg/ml母液,受體使用的終濃度為20μg/ml。4.一抗（8ml）：1:2000；二抗（8ml）：1:10005.樣品配制：不溶的樣品加DMSO全溶，終濃度不超0.5%6.受體，抗體，樣品均用孵育液稀釋。26大家好溶液配制及注意事項（60well大概用量）26大家好7.bufferB（底物緩沖液）：定容100ml，PH9.5,二乙醇胺：105μl；MgCl2：10.175mg8.PNPP對光敏感，現(xiàn)配現(xiàn)用，用bufferB溶解9.配制的纖維蛋白原濃度越高儲存越穩(wěn)定，37℃水浴鍋加熱包被液溶解，儲存Fg>1mg/ml時較穩(wěn)定。27大家好7.bufferB（底物緩沖液）：定容100ml，PH三、卡那霉素殘留檢測卡那霉素檢測試劑盒28大家好三、卡那霉素殘留檢測卡那霉素檢測試劑盒28大家好2015年版藥典凡例十六：（3）生產(chǎn)過程中，應(yīng)盡可能避免使用抗生素，必須使用時，應(yīng)選擇安全性風(fēng)險相對較低抗生素，使用抗生素種類不得超過1種，且產(chǎn)品后繼工藝應(yīng)保證可有效去除制品中抗生素，去除工藝應(yīng)該驗證。（4）生產(chǎn)過程中使用抗生素時，成品鑒定中應(yīng)檢測抗生素殘留量，并規(guī)定殘留量限制。上述的生產(chǎn)過程包括種子培養(yǎng)活化，發(fā)酵，純化等所有的步驟，所以種子活化階段是算在生產(chǎn)過程中的。29大家好2015年版藥典凡例十六：（3）生產(chǎn)過程中，應(yīng)盡可能避免使用試驗原理采用間接競爭ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中殘留的卡那霉素將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗卡那霉素抗體，加入酶標(biāo)二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與殘留物卡那霉素的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中卡那霉素的含量。30大家好試驗原理采用間接競爭ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶操作步驟1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫(20-25℃)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。2、取出需要數(shù)量的微孔板，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。3、洗滌工作液在使用前也需回溫。4、編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。31大家好操作步驟1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫(20-255、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本：加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本20ml到對應(yīng)的微孔中，加入酶標(biāo)二抗50ml/孔，再加入抗體工作液80ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)40min。6、洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液250ml/孔，充分洗滌4－5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干。7、顯色：加入底物液A液50ml/孔，再加底物液B液50ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中避光反應(yīng)15min。8、測定：加入終止液50ml/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測定每孔OD值。32大家好5、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本：加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本20ml到對應(yīng)的微孔中定量分析（1）百分吸光率的計算

標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即百分吸光度值（%）＝B/B0×100%B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值B0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ppb）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中卡那霉素實際殘留量。33大家好定量分析（1）百分吸光率的計算33大家好卡那霉素測定方法驗證檢測方法和標(biāo)準(zhǔn)曲線競爭ELISA法測定藥盒卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品34大家好卡那霉素測定方法驗證檢測方法和標(biāo)準(zhǔn)曲線競爭ELISA法測定卡那霉素在樣品溶液中的回收率卡那霉素在樣品稀釋液中的回收率(n=6)35大家好卡那霉素在樣品溶液中的回收率卡那霉素在樣品稀釋液中的回收率(精密度試驗卡那霉素稀釋樣本競爭ELISA法分析精密度試驗結(jié)果(n=6)36大家好精密度試驗卡那霉素稀釋樣本競爭ELISA法分析精密度試驗結(jié)果四、人胰島素原殘留檢測MercodiaProinsulinELISAkit37大家好四、人胰島素原殘留檢測MercodiaProinsulin目前重組人胰島素生產(chǎn)主要以E.coli表達(dá)人胰島素原，初步純化后變復(fù)性，經(jīng)胰蛋白酶(trypsin)和羧肽酶B(carboxypeptidaseB)協(xié)同酶切，去掉前導(dǎo)肽和C-肽，形成有活性的胰島素，并進(jìn)一步純化精制而成。上述工藝制備所得人胰島素產(chǎn)品中可能殘留人胰島素原、C-肽等人胰島素相關(guān)雜質(zhì)，其殘留的存在可能影響人胰島素的藥效。38大家好目前重組人胰島素生產(chǎn)主要以E.coli表達(dá)人胰島素原，初步純Insulinconversionformationprocessandstructurediagram39大家好Insulinconversionformation試驗原理采用雙單抗夾心ELISA法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被抗胰島素原C-肽特異性抗體，樣品中胰島素原結(jié)合微孔條上的特異性抗體，然后加入HRP標(biāo)記的抗胰島素特異性抗體，用TMB底物顯色，吸光值與樣品中胰島素原的含量成正相關(guān)。40大家好試驗原理采用雙單抗夾心ELISA法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被抗操作步驟1、加樣：加待檢樣品，100μl/孔，37℃2h，同上洗滌；2、加酶標(biāo)抗體：酶標(biāo)抗體稀釋液稀釋HRP-13A4至工作濃度，100μl/孔，37℃1h，同上洗滌；3、顯色和中止反應(yīng)：加新鮮配制的底物100μl/孔，37℃避光作用20min；加中止液50μl/孔終止反應(yīng)，測定每孔OD450/630nm值。4、數(shù)據(jù)處理：以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)log(c)對吸光值log(y)回歸，可求得樣品中人胰島素原的殘留量。41大家好操作步驟1、加樣：加待檢樣品，100μl/孔，37℃2StandardcurveforrhPIinPBSwasdeterminedbytheimmunocaptureassay(n=5).42大家好StandardcurveforrhPIinP思考題1.抗原與抗體的屬性，抗原與抗體反應(yīng)的特點以及衡量抗體質(zhì)量的指標(biāo)？2.酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）的基本原理及技術(shù)要點、主要方法類型及其反應(yīng)原理和適用范圍?3.過碘酸鹽氧化法與戊二醛偶聯(lián)法制備酶偶聯(lián)物的原理及各自優(yōu)缺點?4.試述宿主蛋白（HCP）殘留檢測基本指導(dǎo)思想和試驗原理？

43大家好思考題1.抗原與抗體的屬性，抗原與抗體反應(yīng)的特點以及衡量抗體謝謝44大家好謝謝44大家好第四節(jié)酶免疫分析技術(shù)在生物藥物分析中的應(yīng)用其應(yīng)用主要包括以下幾個方面：藥物含量（活性）測定宿主蛋白殘留檢測抗生素殘留檢測雜質(zhì)檢測污染物檢測藥物原材料檢測藥物摻假檢測45大家好第四節(jié)酶免疫分析技術(shù)在生物藥物分析中的應(yīng)用其應(yīng)用主要包括以一、GLP-1活性檢測CyclicAdenosineMonophosphate(cAMP)ELISAKit46大家好一、GLP-1活性檢測CyclicAdenosineMoGLP-1GLP-1是已發(fā)現(xiàn)的促胰島素分泌作用最強(qiáng)的腸肽類激素，它通過與GLP-1受體(GLP-1R)結(jié)合發(fā)揮作用1）GLP-1可通過刺激胰島素分泌、抑制胰高血糖素分泌及胃排空來降低血糖2）GLP-1還有減緩β細(xì)胞凋亡，促進(jìn)其再生的獨特作用3）GLP-1還能減慢胃排空速度，通過作用下丘腦，抑制食欲。47大家好GLP-1GLP-1是已發(fā)現(xiàn)的促胰島素分GLP-1結(jié)合GLP-1R后，激活細(xì)胞膜內(nèi)環(huán)腺苷酸(cAMP)和絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路胰島成熟β細(xì)胞的GLP-1受體偶聯(lián)Gs，活化腺苷酰環(huán)化酶，產(chǎn)生cAMP，后者與葡萄糖協(xié)同刺激胰島素合成和分泌，刺激胰島素基因轉(zhuǎn)錄和胰島素原生物合成，可降低胰高血糖素濃度并抑制胰高血糖素分泌，增強(qiáng)細(xì)胞對胰島素的敏感性，刺激胰島素依賴性糖原合成，降低餐后血糖濃度。48大家好GLP-1結(jié)合GLP-1R后，激活細(xì)胞膜內(nèi)環(huán)腺苷酸(cAMP3535LigandLigandsACsGTPATPcAMPPKACa2+NFAT-PNFATCalcineurinCREB-PNFAT-RECREF-LuciferseR-LuciferseGLP-1Receptor3535報告基因檢測原理49大家好3535LigandLigandsACsATPcAM試驗原理采用直接競爭ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被cAMP特異性抗體，樣品中cAMP將和標(biāo)準(zhǔn)HRP-cAMP競爭結(jié)合微孔條上cAMP特異性抗體，用TMB底物顯色，吸光值與樣品中cAMP的含量成負(fù)相關(guān)。以吸光值為縱坐標(biāo)，樣品濃度為橫坐標(biāo)，按四參數(shù)法回歸擬合對照品和供試品的量效曲線，得出半效量濃度，求得供試品相對生物活性。50大家好試驗原理采用直接競爭ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被c操作程序：1、取微孔板條，加入cAMP特異性抗體，50ul/孔，室溫1h;2、洗滌后，向不同孔中分別cAMP、對照或細(xì)胞裂解上清品（樣品），100ul/孔；3、向孔中加入HRP-cAMP，50ul/孔，室溫作用2h；4、洗滌后，向孔中加入TMB溶液，200ul/孔，室溫作用30min；5、向孔中加入終止液，100ul/孔，測定OD450nm/570nm51大家好操作程序：1、取微孔板條，加入cAMP特異性抗體，50ul/數(shù)據(jù)與結(jié)果1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：（1）測定各濃度梯度下各孔對照品和供試品相應(yīng)的吸光值，并分別計算平均值；（2）以吸光值為縱坐標(biāo)，樣品濃度為橫坐標(biāo)，按四參數(shù)法回歸擬合對照品和供試品的量效曲線，得出半效量濃度；對照品EC50；測試樣EC502.數(shù)據(jù)處理：

供試品相對生物活性（%）=對照品EC50/供試品EC50100%

其中：對照品和供試品的EC50分別表示對照品和測試樣的半效量的濃度。四參數(shù)方程中的C值即相當(dāng)于半效量的濃度(EC50)。52大家好數(shù)據(jù)與結(jié)果1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：8大家好典型的測定結(jié)果及回歸曲線53大家好典型的測定結(jié)果及回歸曲線9大家好54大家好10大家好二、宿主蛋白（HCP）殘留檢測Cygnus

F550

CHO

HCP

ELISA

Kit55大家好二、宿主蛋白（HCP）殘留檢測Cygnus

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CH宿主細(xì)胞蛋白污染物CHO宿主蛋白殘留

E-coli宿主蛋白殘留

酵母菌宿主蛋白殘留

HEK293宿主蛋白殘留56大家好宿主細(xì)胞蛋白污染物CHO宿主蛋白殘留12大家好2D分離CHO、酵母、大腸桿菌等細(xì)胞系的全蛋白譜將2DGel上的全蛋白轉(zhuǎn)移至膜上，用多克隆抗體孵育后進(jìn)行WesternBlot化學(xué)發(fā)光檢測，以確認(rèn)多克隆抗體能夠與哪些宿主細(xì)胞蛋白結(jié)合通過WesternBlot檢測結(jié)果（多抗能檢測到的HCP數(shù)量）與2D膜上檢測結(jié)果（總HCP數(shù)量）的比較，得出用于評價檢測的多克隆抗體特異性及適用性的MatchRate評估HCP定量用多克隆抗體的特異性57大家好2D分離CHO、酵母、大腸桿菌等細(xì)胞系的全蛋白譜評估HCP定58大家好14大家好試驗原理采用雙位點酶聯(lián)免疫檢測法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被抗CHOCHP多抗，免疫反應(yīng)構(gòu)成為夾層式結(jié)構(gòu)：固相抗體-HCP-酶標(biāo)記抗體。反應(yīng)結(jié)束后清洗酶標(biāo)板去除未結(jié)合反應(yīng)物，添加TMB底物顯色，吸光值與樣品中CHO宿主蛋白的含量成正相關(guān)。59大家好試驗原理采用雙位點酶聯(lián)免疫檢測法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被抗C檢測步驟：（1）于每個反應(yīng)孔中，加入100μL抗CHOHCP多抗-HRP；（2）從標(biāo)準(zhǔn)蛋白液、對照和樣品中吸取50μL上清加入到已標(biāo)記好的反應(yīng)孔中；180rpm下室溫、振蕩培養(yǎng)2h；（3）棄去孔內(nèi)溶液，每孔加350μL洗滌液，重復(fù)洗滌4次；（4）

于每個反應(yīng)孔中，加入100μLTMB底物溶液，于室溫孵育30min；（5

）于每個反應(yīng)孔中，加入100μL終止液；依序讀取OD450/650nm吸收值(空白對照孔調(diào)零)。（6）數(shù)據(jù)處理：根據(jù)測定每孔標(biāo)準(zhǔn)液吸光值繪制四參數(shù)邏輯曲線，然后根據(jù)樣品吸光值計算出樣品中HCP濃度。60大家好檢測步驟：（1）于每個反應(yīng)孔中，加入100μL抗CHOH61大家好17大家好62大家好18大家好63大家好19大家好64大家好20大家好65大家好21大家好ELISA法研究藥物作用靶點（GPⅡb/Ⅲa受體）實驗原理根據(jù)ELISA實驗原理，先在96孔板上包被纖維蛋白原，然后同時加入GPIIb/IIIa受體和待測樣品，再加酶標(biāo)抗體與GPIIb/IIIa受體結(jié)合，最后加入底物，酶作用于底物顯色，在405nm測得OD值，OD值與GPIIb/IIIa受體量成正比。如果樣品與GPIIb/IIIa受體結(jié)合，就會降低纖維蛋白原與受體的結(jié)合，導(dǎo)致所測的OD值降低。66大家好ELISA法研究藥物作用靶點（GPⅡb/Ⅲa受體）實驗原理2實驗步驟：首先將纖維蛋白原（10μg/ml）用bufferA（0.1MNa2CO3,PH9.5）包被于96孔板上（100μl/well）（空白對照:不包被纖維蛋白原），4°C孵育過夜；TACTS（0.02MTris-HCl,PH7.5，0.15MNaCl，1mMCaCl2,0.02%NaN3,0.05%Tween20）沖洗一次，每孔200μl，3min；用含1%BSA的TACTS在37°C封閉1h（200μl/well）,TACTS洗三次；整合素αIIbβ3（20μg/ml、50μL/well）加一定濃度的待測樣品50μl作為樣品組；加孵育液做陰性對照組；37°C下孵育2h；TACTS洗三次；加一抗（鼠抗人CD61抗體，含0.5%BSA,TACTS稀釋，1:2000(體積比)，100μL/孔）37°C下孵育1h；67大家好實驗步驟：23大家好TACTS洗三次；加二抗（堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，含0.5%BSA,TACTS稀釋，1:1000，100μL/孔），37°C下孵育1h；TACTS洗三次，加底物（對硝基苯磷酸二鈉溶液(PNPP)1mg/ml，用bufferB溶解，200μL/well），37℃下孵育30min；加入50μL3MNaOH(稱0.6g加5ml蒸餾水)終止反應(yīng)；5min內(nèi)405nm波長下檢測吸光度。68大家好TACTS洗三次；加二抗（堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，數(shù)據(jù)處理通過以下公式計算抑制率：[(X?Y)/(X-Z)]×100%。X代表生理鹽水組OD值；Y代表樣品組OD值；Z代表空白對照組OD值。實驗結(jié)果都用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（

±s）表示，采用t檢驗進(jìn)行單因素方差分析。p<0.05界定為具有統(tǒng)計學(xué)意義，所有數(shù)據(jù)處理均使用GraphPadPrism6軟件(GraphPadSoftware，美國)。69大家好數(shù)據(jù)處理25大家好溶液配制及注意事項（60well大概用量）1.bufferA：0.1MNa2CO350ml：取固體0.53g溶液50ml蒸餾水中，調(diào)PH9.5.2.TACTS洗脫液（需300ml）：定容100ml，pH7.5，Tris-HCl：0.2423g；NaCl：0.8766g；NaN3：200μL；Tween20:50μL；CaCl2:0.0222g。孵育液（50ml）：TACTS加0.5%BSA封閉液（20ml）：TACTS加1%BSA3.受體αⅡbβ3（4ml）：配制1.63mg/ml母液,受體使用的終濃度為20μg/ml。4.一抗（8ml）：1:2000；二抗（8ml）：1:10005.樣品配制：不溶的樣品加DMSO全溶，終濃度不超0.5%6.受體，抗體，樣品均用孵育液稀釋。70大家好溶液配制及注意事項（60well大概用量）26大家好7.bufferB（底物緩沖液）：定容100ml，PH9.5,二乙醇胺：105μl；MgCl2：10.175mg8.PNPP對光敏感，現(xiàn)配現(xiàn)用，用bufferB溶解9.配制的纖維蛋白原濃度越高儲存越穩(wěn)定，37℃水浴鍋加熱包被液溶解，儲存Fg>1mg/ml時較穩(wěn)定。71大家好7.bufferB（底物緩沖液）：定容100ml，PH三、卡那霉素殘留檢測卡那霉素檢測試劑盒72大家好三、卡那霉素殘留檢測卡那霉素檢測試劑盒28大家好2015年版藥典凡例十六：（3）生產(chǎn)過程中，應(yīng)盡可能避免使用抗生素，必須使用時，應(yīng)選擇安全性風(fēng)險相對較低抗生素，使用抗生素種類不得超過1種，且產(chǎn)品后繼工藝應(yīng)保證可有效去除制品中抗生素，去除工藝應(yīng)該驗證。（4）生產(chǎn)過程中使用抗生素時，成品鑒定中應(yīng)檢測抗生素殘留量，并規(guī)定殘留量限制。上述的生產(chǎn)過程包括種子培養(yǎng)活化，發(fā)酵，純化等所有的步驟，所以種子活化階段是算在生產(chǎn)過程中的。73大家好2015年版藥典凡例十六：（3）生產(chǎn)過程中，應(yīng)盡可能避免使用試驗原理采用間接競爭ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中殘留的卡那霉素將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗卡那霉素抗體，加入酶標(biāo)二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與殘留物卡那霉素的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中卡那霉素的含量。74大家好試驗原理采用間接競爭ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶操作步驟1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫(20-25℃)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。2、取出需要數(shù)量的微孔板，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。3、洗滌工作液在使用前也需回溫。4、編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。75大家好操作步驟1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫(20-255、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本：加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本20ml到對應(yīng)的微孔中，加入酶標(biāo)二抗50ml/孔，再加入抗體工作液80ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)40min。6、洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液250ml/孔，充分洗滌4－5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干。7、顯色：加入底物液A液50ml/孔，再加底物液B液50ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中避光反應(yīng)15min。8、測定：加入終止液50ml/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測定每孔OD值。76大家好5、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本：加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本20ml到對應(yīng)的微孔中定量分析（1）百分吸光率的計算

標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即百分吸光度值（%）＝B/B0×100%B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值B0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ppb）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將