XXXX-9-16BT第2講基因工程第1講-概論課件

第二章

基因工程（Geneengineering）

1第二章1概論2概論2要求

1、掌握基因工程的概念

2、掌握基因工程的基本過(guò)程

3、熟悉工具酶和載體類型及應(yīng)用

4、熟悉原核、真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染、表

達(dá)的基本方法和類型。

5、熟悉基因工程產(chǎn)生的基礎(chǔ)和過(guò)程

(科研思維與方法）。6.設(shè)計(jì)一個(gè)基因克隆的程序。3要求

1、掌握基因工程的概念

2、掌參考書(shū)楚雍烈，現(xiàn)代生物技術(shù)（西安交通大學(xué)講義）Genecloning,T.A.Brown.基因工程原理，吳乃虎編著，科學(xué)出版社基因工程概論，張惠展編著，華東理工大學(xué)出版社分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，J.Sambtook,EFFrish,TManiatis,金冬雁，黎孟楓等譯，科學(xué)出版社。4參考書(shū)楚雍烈，現(xiàn)代生物技術(shù)（西安交通大學(xué)講義）4

生物技術(shù)的核心內(nèi)容

基因工程（Geneengineering）DNA重組（recombinantDNAtechnology）基因操作（genemanipulation）基因克?。╣enecloning）分子克?。╩olecularcloning）DNA克隆（DNAcloning）基因修飾（genemodification）

5生物技術(shù)的核心內(nèi)容5基因工程的概念基因工程的意義基因工程的發(fā)展史理論上的六大發(fā)現(xiàn)技術(shù)上的六大進(jìn)展發(fā)展過(guò)程中的重大事件基本步驟:兩個(gè)水平，六個(gè)階段內(nèi)容提要6基因工程的概念內(nèi)容提要6一、基因工程的概念

定義：

人們按照預(yù)定設(shè)計(jì)，在體外對(duì)不同來(lái)源DNA分子進(jìn)行人工切割、連接、插入載體DNA分子，使遺傳物質(zhì)重新組合、改造，經(jīng)轉(zhuǎn)移、導(dǎo)入到原先不含有重組體的受體細(xì)胞，使之持續(xù)穩(wěn)定繁殖、目的基因擴(kuò)增、表達(dá)，獲得人類所需的產(chǎn)品的工程。7一、基因工程的概念

定義：

人們按照預(yù)WithRestrictionenzymesWithRestrictionenzymeswithDNAligaseenzyme(Genetictransformation)8WithRestrictionenzymesWithR基因工程的基本內(nèi)涵

基因工程是指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進(jìn)行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體（受體）內(nèi)，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達(dá)出新產(chǎn)物或新性狀的DNA體外操作程序，也稱為分子克隆技術(shù)。因此，供體、受體、載體是重組DNA技術(shù)的三大基本元件。體外重建、基因轉(zhuǎn)移和外源表達(dá)是重組DNA技術(shù)的三大環(huán)節(jié)。9基因工程的基本內(nèi)涵基因工基因工程的基本特征基因工程有兩個(gè)重要的特征：

一是可把來(lái)自任何生物的基因重組和轉(zhuǎn)移到與其毫無(wú)關(guān)系的任何其他受體細(xì)胞中，因此可以實(shí)現(xiàn)按照人們的愿望，改造生物的遺傳特性，創(chuàng)造出生物的新性狀；

二是某一段DNA可在受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行基因復(fù)制和表達(dá)，為準(zhǔn)備大量純化的DNA片段提供了可能，拓寬了分子生物學(xué)的研究領(lǐng)域。10基因工程的基本特征基因工程有兩個(gè)重要的特征

基因工程的目的

（1）獲得目的基因，DNA的提取、純化和

DNA分子的克隆，建立文庫(kù)。

（2）制備活性多肽產(chǎn)品：激素、細(xì)胞因

子、多肽藥物疫苗等，診斷和防治

疾病。

（3）研究基因結(jié)構(gòu)、功能等11基因工程的目的

（1）獲得目的基因，DNA的提二、基因工程的重大意義

（1）重組DNA技術(shù)填平了生物種屬間

不可逾越的鴻溝。

跨越天然物種屏障，將原核和真核生物、植物和動(dòng)物，造福人類，在過(guò)去人們難以置信的事情，現(xiàn)在已成為現(xiàn)實(shí)。12二、基因工程的重大意義

（1）重組DNA技術(shù)填平了生物種屬間

（2）重組DNA技術(shù)縮短了進(jìn)化時(shí)間。

遺傳和變異是一對(duì)矛盾，遺傳賦予生物種的穩(wěn)定，變異賦予生物種的進(jìn)化。在漫漫歷史長(zhǎng)河中，自然變異的進(jìn)化時(shí)間是千萬(wàn)年，常規(guī)育種亦要幾年；而重組DNA技術(shù)將進(jìn)化時(shí)間大大縮短至幾年?；虿僮饔糜谟N，將縮短進(jìn)化時(shí)間，在解決全世界人民溫飽問(wèn)題上將發(fā)揮重要作用。13（2）重組DNA技術(shù)縮短了進(jìn)化時(shí)間。

遺傳和變異（3）重組DNA技術(shù)使人類能對(duì)生物

進(jìn)行定向改造

重組DNA技術(shù)標(biāo)志著人類控制和改造生物的歷史已進(jìn)入一個(gè)新紀(jì)元。以重組DNA技術(shù)培育出抗真菌蔬菜為例，幾丁質(zhì)是真菌細(xì)胞的組分之一，幾丁質(zhì)酶能水解幾丁質(zhì)，美國(guó)科學(xué)家將幾丁質(zhì)酶基因?qū)胛骷t柿、土豆、萵苣和甜菜中，正準(zhǔn)備大田試驗(yàn)，這一技術(shù)將對(duì)蔬菜抗真菌感染具有重要意義。14（3）重組DNA技術(shù)使人類能對(duì)生物

進(jìn)行定（4）利用重組DNA技術(shù)可以在體外大量擴(kuò)增、純化人們感興趣的基因，研究其結(jié)構(gòu)、功能及調(diào)控機(jī)制，從而拓

寬了分子生物學(xué)的研究領(lǐng)域。

15（4）利用重組DNA技術(shù)可以在體外大量擴(kuò)增、純化人們感興趣的（5）醫(yī)學(xué)上應(yīng)用更為廣泛，涉及各領(lǐng)域

正常人類生命活動(dòng)的分子機(jī)制；

人類各種疾病發(fā)生的分子機(jī)理；

人類各種疾病如遺傳性疾病、腫瘤、

肥胖、心血管疾病、傳染病等病因

的查明、診斷、治療和預(yù)防。

藥物的研發(fā)和生產(chǎn)；

疾病模型的建立；

人類的營(yíng)養(yǎng)、健康、長(zhǎng)壽和保?。▉喗】担?6（5）醫(yī)學(xué)上應(yīng)用更為廣泛，涉及各領(lǐng)域

正常人類生命活動(dòng)1717

本課程的地位：現(xiàn)代科技革命高新技術(shù)生物技術(shù)基因工程基因克隆18本課程的地位：現(xiàn)代科技革命高新技術(shù)生物技術(shù)基因工程基因克基因工程不是發(fā)現(xiàn)，而是創(chuàng)造。19基因工程不是發(fā)現(xiàn)，而是創(chuàng)造。19改變傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)概念

讓植物生產(chǎn)人體蛋白質(zhì)生產(chǎn)促性腺絨毛激素的矮牽牛20改變傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)概念生產(chǎn)促性腺絨毛激素的矮牽牛20發(fā)光的水稻21發(fā)光的水稻21只有想不到的沒(méi)有辦不到的基因重組22只有想不到的沒(méi)有辦不到的基因重組22

第一節(jié)

基因工程的發(fā)生與發(fā)展23第一節(jié)23

一、基因工程誕生的理論基礎(chǔ)

20世紀(jì)中期分子遺傳學(xué)理論的重大進(jìn)展

六大發(fā)現(xiàn)：

1．確定了生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA肺炎鏈球菌光滑型和粗糙型的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)噬菌體DNA轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

24一、基因工程誕生的理論基礎(chǔ)24●

1944年，美國(guó)微生物學(xué)家Avery證明基因就是DNA分子，提出DNA是遺傳信息的載體。25●1944年，美國(guó)微生物學(xué)家Avery證明基因就是DNA分2．DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制

DNA堿基配對(duì)規(guī)律和X衍射研究DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。

262．DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制262727

3．生物遺傳的“中心法則”解決了遺傳信息的流向和遺傳性狀的相互關(guān)系，揭示了生命遺傳信息傳遞基本規(guī)律。自我復(fù)制，遺傳信息由親代傳給子代；通過(guò)轉(zhuǎn)錄，遺傳信息傳給RNA；通過(guò)翻譯，信息傳給蛋白質(zhì)和酶；基因型決定生物的表型。DNA

RNA

protein283．生物遺傳的“中心法則”解決了遺傳信息的流向和遺傳性狀ReplicationReplication

TranscriptionReverseTranscription

Translation中心法則（thecentraldogma）29ReplicationReplicationTranscr30304．“操縱子”學(xué)說(shuō)揭示了基因表達(dá)

和調(diào)控的概念。

基因組結(jié)構(gòu)

基因分布

基因表達(dá)

基因調(diào)控的原理

酶誘導(dǎo)的本質(zhì)

314．“操縱子”學(xué)說(shuō)揭示了基因表達(dá)

和調(diào)控的

5．破譯了全部生物遺傳密碼，

確定了它在生物界的通用

性，人類更加具體地了解

遺傳信息表達(dá)規(guī)律。

325．破譯了全部生物遺傳密碼，

確定了它在生遺傳密碼表目錄33遺傳密碼表目錄33mRNA分子上從5至3的方向,每3個(gè)核苷酸構(gòu)建一個(gè)密碼子，編碼某一特定氨基酸或作為蛋白質(zhì)合成的起始、終止信號(hào)，稱為三聯(lián)體密碼(tripletcodon)，也稱遺傳密碼子(geneticcodon)。解決了信息語(yǔ)言的對(duì)應(yīng)關(guān)系。34mRNA分子上從5至3的方向,每3個(gè)核苷酸構(gòu)建一個(gè)密碼子終止密碼：翻譯終止的密碼，不代表任何氨基酸。有3個(gè)：UAA、UAG、UGA?代表氨基酸的密碼：64?3=61起始密碼：

AUG在mRNA起始部位時(shí)為起始密碼。否，為Met密碼。密碼:43=6435終止密碼：翻譯終止的密碼，不代表任何氨基酸。有3個(gè)：UA

1)通用性

遺傳密碼具有的特點(diǎn)從原核生物到人類都使用同一套遺傳密碼。已發(fā)現(xiàn)少數(shù)例外，如動(dòng)物細(xì)胞的線粒體、植物細(xì)胞的葉綠體。2)方向性

mRNA分子上由起始密碼AUG開(kāi)始，從5→3方向閱讀密碼子，直至終止密碼。決定蛋白質(zhì)分子從N端→C端的排列順序。361)通用性

遺傳密碼具有的特點(diǎn)從原核生物到人類都使用同3)連續(xù)性三聯(lián)體密碼連續(xù)性表現(xiàn)為中間無(wú)標(biāo)點(diǎn)，連續(xù)閱讀。mRNA開(kāi)放閱讀框架內(nèi)發(fā)生一個(gè)或兩個(gè)堿基插入或缺失，可引起移碼突變(frameshiftmutation)。373)連續(xù)性三聯(lián)體密碼連續(xù)性表現(xiàn)為中間無(wú)標(biāo)點(diǎn)，連續(xù)閱讀。34)簡(jiǎn)并性目錄即有多個(gè)密碼子特異地破譯同一個(gè)氨基酸．遺傳密碼中，除色氨酸和甲硫氨酸僅對(duì)應(yīng)一個(gè)密碼子外，其余氨基酸均有一個(gè)以上密碼子為其編碼。384)簡(jiǎn)并性目錄即有多個(gè)密碼子特異地破譯同一個(gè)氨基酸．385)擺動(dòng)性tRNA上反密碼子的第1位堿基與mRNA密碼子的第3位堿基配對(duì)時(shí)，可以在一定范圍內(nèi)變動(dòng)，即并不嚴(yán)格遵循堿基配對(duì)規(guī)律，這一現(xiàn)象稱為擺動(dòng)性。395)擺動(dòng)性tRNA上反密碼子的第1位堿基與mRN

6、生物進(jìn)化，基因突變、獲得的性狀可以遺傳到后代。406、生物進(jìn)化，基因突變、40

分子遺傳學(xué)理論上的六大進(jìn)展解決了

生命現(xiàn)象的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)（均是核酸）結(jié)構(gòu)模型（同類構(gòu)件、雙螺旋）復(fù)制方式（相似的機(jī)制）遺傳信息流動(dòng)方向（共同的中心法則）遺傳密碼（共用一套相同的密碼）表達(dá)和調(diào)控的機(jī)理（類同的方法）基因突變機(jī)理、意義（變異與進(jìn)化）為基因工程技術(shù)的誕生典定了理論基礎(chǔ)。

理論上的可行性。

41分子遺傳學(xué)理論上的六大進(jìn)展解決了41二、分子遺傳學(xué)新方法是基因工程的

技術(shù)基礎(chǔ)（六大技術(shù)）首當(dāng)其沖的是要解決：①如何自如地得到目的基因；②如何在體外改造基因，得到重組體；③如何在體外轉(zhuǎn)移重組基因；直到20世紀(jì)70年代中期，相繼出現(xiàn)了

幾項(xiàng)關(guān)鍵性技術(shù)，夢(mèng)想成真。42二、分子遺傳學(xué)新方法是基因工程的421．工具酶的發(fā)現(xiàn)：

DNA分子的切割和連接技術(shù)1970年Smith發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶

(restrictionendonuclease，RE)HinfⅠ對(duì)DNA分子有特異地切割作用。

（手術(shù)刀剪）同年Khorana又發(fā)現(xiàn)了T4DNA連接酶（Ligase），能將DNA片段連接在一起。（縫紉機(jī)、漿糊）DNA、RNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶等合成酶。（復(fù)印機(jī)）構(gòu)成了一個(gè)研究DNA、RNA分子的工具酶箱。431．工具酶的發(fā)現(xiàn)：43

2、DNA片段載體系統(tǒng)的構(gòu)建

目的基因、DNA片段不能復(fù)制，也易破壞。必須連到具有復(fù)制能力的DNA分子上。

載體（vector)

是能攜帶外源DNA、能自我復(fù)制的小DNA分子。最早發(fā)現(xiàn)的是：質(zhì)粒、噬菌體和病毒。442、DNA片段載體系統(tǒng)的構(gòu)建443、大腸桿菌受體細(xì)胞系統(tǒng)建立

體外獲得的含目的基因或DNA片段的重組體，雖具有自我復(fù)制的本能，但沒(méi)有原料、酶系統(tǒng)和生命活力。必須將其安全轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞才能進(jìn)行增殖，賦予其“生命”。453、大腸桿菌受體細(xì)胞系統(tǒng)建立4、大腸桿菌DNA轉(zhuǎn)化體系建立

1970年發(fā)現(xiàn)氯化鈣處理過(guò)的細(xì)胞易于吸收接納外源DNA；1972年CohenC報(bào)道，質(zhì)粒DNA也能被大腸桿菌吸收。而后發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)改造的質(zhì)粒、噬菌體和病毒都可以攜帶目的DNA片段和基因，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化大腸桿菌，建立該基因的無(wú)性繁殖系。464、大腸桿菌DNA轉(zhuǎn)化體系建立465、DNA分析、鑒定技術(shù)

酶切分析技術(shù)（核酸分辨儀）核酸分子雜交技術(shù)（核酸探測(cè)儀）

序列分析（密碼復(fù)讀機(jī)）生物信息學(xué)（密碼破譯機(jī)）

475、DNA分析、鑒定技術(shù)47

6、DNA分離、純化及鑒定技術(shù)

凝膠電泳：Agarose,PAGEgel離心技術(shù)層析技術(shù)印跡技術(shù):Southernblot………..

486、DNA分離、純化及鑒定技術(shù)48

技術(shù)上的可行性

六大技術(shù)方法的建立

實(shí)際上的可操作性

材料、實(shí)驗(yàn)條件、時(shí)空條件、

經(jīng)濟(jì)條件和政策。

基礎(chǔ)方面的基本條件（可能性+可行性+

可操作性）具備，尚需人的科學(xué)創(chuàng)新思維+

艱苦的實(shí)踐。才能得到創(chuàng)新的發(fā)明、發(fā)現(xiàn)

和成果。49技術(shù)上的可行性

六大技術(shù)方法的建立

1970年，MIT的科學(xué)家率先提出在體外把不同來(lái)源的遺傳物質(zhì)進(jìn)行重組的設(shè)想，但遭到反對(duì)，不予支持。沒(méi)能進(jìn)行試驗(yàn)。1972年，Boyer等在發(fā)現(xiàn)限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI的基礎(chǔ)上，開(kāi)始了實(shí)驗(yàn)。

501970年，MIT的科學(xué)家率先提出在體外把不同來(lái)1972年Berg等人使用EcoRI在體外對(duì)猴病毒SV40的DNA和λ噬菌體的DNA分別酶消化，再用T4DNA連接酶將兩種片段連接起來(lái)，得到SV40和λDNA的重組雜種DNA分子，率先完成了世界上第一次成功的DNA體外不同物種之間的DNA重組實(shí)驗(yàn)（片段重組）?；蚬こ痰拇竽憞L試511972年Berg等人使用EcoRI在體外對(duì)猴病毒S基因工程的誕生1980年Nobel化學(xué)獎(jiǎng)1972年斯坦福大學(xué)的PaulBerg小組完成了首次體外重組實(shí)驗(yàn)。Berg的開(kāi)創(chuàng)性實(shí)驗(yàn)52基因工程的誕生1980年Nobel化學(xué)獎(jiǎng)1972年斯坦福大學(xué)

1973年Cohen成功地進(jìn)行了另一個(gè)體外DNA重組實(shí)驗(yàn)。

分別把編碼卡那霉素和四環(huán)素抗性基因的兩種質(zhì)粒酶切、連接，再將這種重組的DNA分子轉(zhuǎn)化大腸桿菌，某些轉(zhuǎn)化菌落具有既抗卡那霉素又抗四環(huán)素的雙重抗體特性。他的工作是世界上第一次成功的基因克隆實(shí)驗(yàn)，并有基因表達(dá)及新的表型。標(biāo)志著基因工程的誕生。531973年Cohen成功地進(jìn)行了另一個(gè)體外DpSC101pR6-5抗四環(huán)素抗卡那霉素EcoRI抗卡那霉素基因DNA連接酶重組DNA分子54pSC101pR6-5抗四環(huán)素抗卡那霉素EcoRI抗卡那霉素培養(yǎng)平皿四環(huán)素平板卡那霉素基因四環(huán)素\卡那霉素基因大腸桿菌55培養(yǎng)平皿四環(huán)素平板卡那霉素基因四環(huán)素\卡那霉素基因大腸桿菌5

后來(lái)又把非洲爪蟾核糖體基因片段同pSC101質(zhì)粒重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并在菌體內(nèi)成功轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA。這是第一次成功的基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)。56后來(lái)又把非洲爪蟾核糖體基因片段同pSC101質(zhì)粒重組

1974年，首次實(shí)現(xiàn)異源間基因重組。

把小鼠的生長(zhǎng)激素抑素基因在大腸桿菌中表達(dá)。571974年，首次實(shí)現(xiàn)異源間基因重組。

把小鼠的1976年，世界上第一個(gè)基因公司在美國(guó)成立，“Genetech”注冊(cè)登記，意味著基因工程的實(shí)際應(yīng)用已跨入商業(yè)運(yùn)作的門檻。生物工程從此進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化。581976年，世界上第一個(gè)基因公司在美國(guó)成立，“Gene1978年，人類的第一個(gè)基因被克隆。人生長(zhǎng)激素抑素基因被重組到大腸桿菌的質(zhì)粒DNA中。

1978-1979胰島素基因在大腸桿菌中表達(dá)。591978年，人類的第一個(gè)基因被克隆。人生長(zhǎng)激素抑素基因被1982年

1、把大白鼠的生長(zhǎng)激素基因克隆、轉(zhuǎn)移到小鼠的受精卵內(nèi)，第一個(gè)轉(zhuǎn)基因超級(jí)鼠誕生。

2、人胰島素基因的cDNA被克隆、成功表達(dá)和開(kāi)始成為商品上市。

基因產(chǎn)品有效益、開(kāi)始新興產(chǎn)業(yè)。

601982年

1、把大白鼠的生長(zhǎng)激素基因克隆、轉(zhuǎn)三、基因工程的基本步驟

——兩個(gè)水平，六個(gè)階段

61三、基因工程的基本步驟

——兩個(gè)水平，六個(gè)基因工程包括分子和細(xì)胞兩個(gè)水平操作分子水平操作指的是基因重組、克隆和表達(dá)的設(shè)計(jì)與重組體構(gòu)建（即重組DNA技術(shù)）；細(xì)胞水平操作則指轉(zhuǎn)化、篩選和培養(yǎng)工程菌或細(xì)胞以及表達(dá)產(chǎn)物的分離純化過(guò)程。62基因工程包括分子和細(xì)胞兩個(gè)水平操作62

1．分子水平操作階段：

獲得含目的基因的重組體分子（亦稱重組子）。

本階段的操作有三個(gè)主要環(huán)節(jié)：

（1）分離：提取、分離含目的基因的DNA分子和載體DNA分子，在分離提取過(guò)程中，注意質(zhì)、量，減少損傷。

（2）切割：選擇合適的RE工具酶，分別對(duì)外源目的DNA分子和載體DNA分子進(jìn)行酶解切割。

（3）連接：用DNA連接酶，將目的基因與載體在體外連接為一個(gè)重組DNA分子，并進(jìn)行鑒定。631．分子水平操作階段：

獲得含目的基因的重組體分子（

分離：目的基因的獲取需要克隆的DNA片段：化學(xué)合成法

cDNA文庫(kù)基因組DNA文庫(kù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)64分離：目的基因的獲取需要克隆的DNA片段：化載體DNA的選擇

功能：為目的基因提供進(jìn)入受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。為目的基因提供在受體細(xì)胞中復(fù)制或整合能力。為目的基因提供在受體細(xì)胞中的表達(dá)能力。65載體DNA的選擇功能：65限制性內(nèi)切酶酶切切割：內(nèi)切酶連接酶連接：DNA連接酶66限制性內(nèi)切酶酶切切割：內(nèi)切酶連接酶連接：DNA連接酶66

2.細(xì)胞水平操作階段：

把含目的基因的重組體導(dǎo)入受體細(xì)菌或受體細(xì)

胞，賦予其“生命”讓其表達(dá)，獲得產(chǎn)品。

本階段的操作也有三個(gè)主要環(huán)節(jié)。

（1）轉(zhuǎn)移：利用DNA轉(zhuǎn)移技術(shù)，把構(gòu)建的重組體導(dǎo)入到受體菌或受體細(xì)胞中，獲得工程菌或工程細(xì)胞。

（2）篩選：利用核酸雜交，酶切分析、PCR和表型特征等技術(shù)，篩選出已克隆化的工程菌/細(xì)胞。

（3）表達(dá)：大量培養(yǎng)含重組體的工程菌/細(xì)胞，誘導(dǎo)其表達(dá)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，提取和純化。672.細(xì)胞水平操作階段：

把含目的基因的重重組體的轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞轉(zhuǎn)移：含氨芐平板重組質(zhì)粒感受態(tài)重組體68重組體的轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞轉(zhuǎn)移：含氨芐平板重組質(zhì)粒感受態(tài)重組體68含氨芐平板連接目的基因基因載體連接酶轉(zhuǎn)化重組體克隆的篩選與鑒定篩選：宿主細(xì)胞69含氨芐平板連接目的基因轉(zhuǎn)化重組體克隆的篩選與鑒定篩選：宿主細(xì)外源基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)重組子目的基因的mRNA表達(dá)蛋白質(zhì)大腸桿菌（E.coli）工程細(xì)胞表達(dá)：目的基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)70外源基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)重組子目的基因的mRNA表達(dá)蛋白質(zhì)

重組DNA操作一般步驟：（1）分離：提取和獲得目的基因和載體DNA；（2）切割：分別對(duì)目的基因和載體DNA酶切；（3）連接：目的基因與載體連接，形成新的重組DNA分子；（4）轉(zhuǎn)化：用重組DNA分子轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞；（5）篩選：能在受體細(xì)胞中復(fù)制和遺傳；對(duì)轉(zhuǎn)化子篩選和鑒定；（6）表達(dá)：對(duì)獲得外源基因的細(xì)胞或生物體通過(guò)培養(yǎng)，獲得所需的遺傳性狀或表達(dá)出所需要的產(chǎn)物。71重組DNA操作一般步驟：（1）分離：提取和獲得目的基因71基因載體目的基因

質(zhì)粒噬菌體病毒

PCRcDNA人工合成基因文庫(kù)限制性內(nèi)切酶有切口的載體有切口的目的基因DNA連接酶

重組體

轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染體外包裝帶重組體的宿主細(xì)胞

表型篩選電泳法核酸雜交免疫學(xué)方法目的基因的表達(dá)72基因載體目的基因質(zhì)粒噬菌體病毒PCR

圖2-1基因工程技術(shù)流程圖

73圖2-1基因工程技術(shù)流程圖73基因工程表達(dá)依據(jù)的基本原理提高外源基因的劑量

——分子遺傳學(xué)原理篩選修飾重組基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，如：

啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、操作子、終止子、上游調(diào)控序列等——分子生物學(xué)原理修飾構(gòu)建蛋白質(zhì)生物合成的翻譯調(diào)控元件，如：

SD序列、mRNA非編碼區(qū)、密碼子等——分子生物學(xué)原理基因工程菌（微型生物反應(yīng)器）增殖及穩(wěn)定生產(chǎn)

——生化工程學(xué)原理74基因工程表達(dá)依據(jù)的基本原理提高外源基因的劑量篩選修飾重組基因基因工程的支撐技術(shù)核酸凝膠電泳技術(shù)核酸分子雜交技術(shù)細(xì)菌轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染技術(shù)DNA序列分析技術(shù)寡核苷酸合成技術(shù)基因定點(diǎn)突變技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)75基因工程的支撐技術(shù)核酸凝膠電泳技術(shù)核酸分子雜交技術(shù)細(xì)菌轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)運(yùn)輸工具：細(xì)菌質(zhì)粒病毒DNA操作技術(shù)純化DNA 剪切DNA分子分析DNA片段大小連接DNA分子受體細(xì)胞的制備將DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞并擴(kuò)增重組子的篩選和鑒定目的基因的表達(dá)76運(yùn)輸工具：76ThankYouforYourAttention!謝謝77ThankYoufor謝謝77演講完畢，謝謝觀看！演講完畢，謝謝觀看！

第二章

基因工程（Geneengineering）

79第二章1概論80概論2要求

1、掌握基因工程的概念

2、掌握基因工程的基本過(guò)程

3、熟悉工具酶和載體類型及應(yīng)用

4、熟悉原核、真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染、表

達(dá)的基本方法和類型。

5、熟悉基因工程產(chǎn)生的基礎(chǔ)和過(guò)程

(科研思維與方法）。6.設(shè)計(jì)一個(gè)基因克隆的程序。81要求

1、掌握基因工程的概念

2、掌參考書(shū)楚雍烈，現(xiàn)代生物技術(shù)（西安交通大學(xué)講義）Genecloning,T.A.Brown.基因工程原理，吳乃虎編著，科學(xué)出版社基因工程概論，張惠展編著，華東理工大學(xué)出版社分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，J.Sambtook,EFFrish,TManiatis,金冬雁，黎孟楓等譯，科學(xué)出版社。82參考書(shū)楚雍烈，現(xiàn)代生物技術(shù)（西安交通大學(xué)講義）4

生物技術(shù)的核心內(nèi)容

基因工程（Geneengineering）DNA重組（recombinantDNAtechnology）基因操作（genemanipulation）基因克?。╣enecloning）分子克?。╩olecularcloning）DNA克?。―NAcloning）基因修飾（genemodification）

83生物技術(shù)的核心內(nèi)容5基因工程的概念基因工程的意義基因工程的發(fā)展史理論上的六大發(fā)現(xiàn)技術(shù)上的六大進(jìn)展發(fā)展過(guò)程中的重大事件基本步驟:兩個(gè)水平，六個(gè)階段內(nèi)容提要84基因工程的概念內(nèi)容提要6一、基因工程的概念

定義：

人們按照預(yù)定設(shè)計(jì)，在體外對(duì)不同來(lái)源DNA分子進(jìn)行人工切割、連接、插入載體DNA分子，使遺傳物質(zhì)重新組合、改造，經(jīng)轉(zhuǎn)移、導(dǎo)入到原先不含有重組體的受體細(xì)胞，使之持續(xù)穩(wěn)定繁殖、目的基因擴(kuò)增、表達(dá)，獲得人類所需的產(chǎn)品的工程。85一、基因工程的概念

定義：

人們按照預(yù)WithRestrictionenzymesWithRestrictionenzymeswithDNAligaseenzyme(Genetictransformation)86WithRestrictionenzymesWithR基因工程的基本內(nèi)涵

基因工程是指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進(jìn)行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體（受體）內(nèi)，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達(dá)出新產(chǎn)物或新性狀的DNA體外操作程序，也稱為分子克隆技術(shù)。因此，供體、受體、載體是重組DNA技術(shù)的三大基本元件。體外重建、基因轉(zhuǎn)移和外源表達(dá)是重組DNA技術(shù)的三大環(huán)節(jié)。87基因工程的基本內(nèi)涵基因工基因工程的基本特征基因工程有兩個(gè)重要的特征：

一是可把來(lái)自任何生物的基因重組和轉(zhuǎn)移到與其毫無(wú)關(guān)系的任何其他受體細(xì)胞中，因此可以實(shí)現(xiàn)按照人們的愿望，改造生物的遺傳特性，創(chuàng)造出生物的新性狀；

二是某一段DNA可在受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行基因復(fù)制和表達(dá)，為準(zhǔn)備大量純化的DNA片段提供了可能，拓寬了分子生物學(xué)的研究領(lǐng)域。88基因工程的基本特征基因工程有兩個(gè)重要的特征

基因工程的目的

（1）獲得目的基因，DNA的提取、純化和

DNA分子的克隆，建立文庫(kù)。

（2）制備活性多肽產(chǎn)品：激素、細(xì)胞因

子、多肽藥物疫苗等，診斷和防治

疾病。

（3）研究基因結(jié)構(gòu)、功能等89基因工程的目的

（1）獲得目的基因，DNA的提二、基因工程的重大意義

（1）重組DNA技術(shù)填平了生物種屬間

不可逾越的鴻溝。

跨越天然物種屏障，將原核和真核生物、植物和動(dòng)物，造福人類，在過(guò)去人們難以置信的事情，現(xiàn)在已成為現(xiàn)實(shí)。90二、基因工程的重大意義

（1）重組DNA技術(shù)填平了生物種屬間

（2）重組DNA技術(shù)縮短了進(jìn)化時(shí)間。

遺傳和變異是一對(duì)矛盾，遺傳賦予生物種的穩(wěn)定，變異賦予生物種的進(jìn)化。在漫漫歷史長(zhǎng)河中，自然變異的進(jìn)化時(shí)間是千萬(wàn)年，常規(guī)育種亦要幾年；而重組DNA技術(shù)將進(jìn)化時(shí)間大大縮短至幾年?；虿僮饔糜谟N，將縮短進(jìn)化時(shí)間，在解決全世界人民溫飽問(wèn)題上將發(fā)揮重要作用。91（2）重組DNA技術(shù)縮短了進(jìn)化時(shí)間。

遺傳和變異（3）重組DNA技術(shù)使人類能對(duì)生物

進(jìn)行定向改造

重組DNA技術(shù)標(biāo)志著人類控制和改造生物的歷史已進(jìn)入一個(gè)新紀(jì)元。以重組DNA技術(shù)培育出抗真菌蔬菜為例，幾丁質(zhì)是真菌細(xì)胞的組分之一，幾丁質(zhì)酶能水解幾丁質(zhì)，美國(guó)科學(xué)家將幾丁質(zhì)酶基因?qū)胛骷t柿、土豆、萵苣和甜菜中，正準(zhǔn)備大田試驗(yàn)，這一技術(shù)將對(duì)蔬菜抗真菌感染具有重要意義。92（3）重組DNA技術(shù)使人類能對(duì)生物

進(jìn)行定（4）利用重組DNA技術(shù)可以在體外大量擴(kuò)增、純化人們感興趣的基因，研究其結(jié)構(gòu)、功能及調(diào)控機(jī)制，從而拓

寬了分子生物學(xué)的研究領(lǐng)域。

93（4）利用重組DNA技術(shù)可以在體外大量擴(kuò)增、純化人們感興趣的（5）醫(yī)學(xué)上應(yīng)用更為廣泛，涉及各領(lǐng)域

正常人類生命活動(dòng)的分子機(jī)制；

人類各種疾病發(fā)生的分子機(jī)理；

人類各種疾病如遺傳性疾病、腫瘤、

肥胖、心血管疾病、傳染病等病因

的查明、診斷、治療和預(yù)防。

藥物的研發(fā)和生產(chǎn)；

疾病模型的建立；

人類的營(yíng)養(yǎng)、健康、長(zhǎng)壽和保?。▉喗】担?4（5）醫(yī)學(xué)上應(yīng)用更為廣泛，涉及各領(lǐng)域

正常人類生命活動(dòng)9517

本課程的地位：現(xiàn)代科技革命高新技術(shù)生物技術(shù)基因工程基因克隆96本課程的地位：現(xiàn)代科技革命高新技術(shù)生物技術(shù)基因工程基因克基因工程不是發(fā)現(xiàn)，而是創(chuàng)造。97基因工程不是發(fā)現(xiàn)，而是創(chuàng)造。19改變傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)概念

讓植物生產(chǎn)人體蛋白質(zhì)生產(chǎn)促性腺絨毛激素的矮牽牛98改變傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)概念生產(chǎn)促性腺絨毛激素的矮牽牛20發(fā)光的水稻99發(fā)光的水稻21只有想不到的沒(méi)有辦不到的基因重組100只有想不到的沒(méi)有辦不到的基因重組22

第一節(jié)

基因工程的發(fā)生與發(fā)展101第一節(jié)23

一、基因工程誕生的理論基礎(chǔ)

20世紀(jì)中期分子遺傳學(xué)理論的重大進(jìn)展

六大發(fā)現(xiàn)：

1．確定了生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA肺炎鏈球菌光滑型和粗糙型的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)噬菌體DNA轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

102一、基因工程誕生的理論基礎(chǔ)24●

1944年，美國(guó)微生物學(xué)家Avery證明基因就是DNA分子，提出DNA是遺傳信息的載體。103●1944年，美國(guó)微生物學(xué)家Avery證明基因就是DNA分2．DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制

DNA堿基配對(duì)規(guī)律和X衍射研究DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。

1042．DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制2610527

3．生物遺傳的“中心法則”解決了遺傳信息的流向和遺傳性狀的相互關(guān)系，揭示了生命遺傳信息傳遞基本規(guī)律。自我復(fù)制，遺傳信息由親代傳給子代；通過(guò)轉(zhuǎn)錄，遺傳信息傳給RNA；通過(guò)翻譯，信息傳給蛋白質(zhì)和酶；基因型決定生物的表型。DNA

RNA

protein1063．生物遺傳的“中心法則”解決了遺傳信息的流向和遺傳性狀ReplicationReplication

TranscriptionReverseTranscription

Translation中心法則（thecentraldogma）107ReplicationReplicationTranscr108304．“操縱子”學(xué)說(shuō)揭示了基因表達(dá)

和調(diào)控的概念。

基因組結(jié)構(gòu)

基因分布

基因表達(dá)

基因調(diào)控的原理

酶誘導(dǎo)的本質(zhì)

1094．“操縱子”學(xué)說(shuō)揭示了基因表達(dá)

和調(diào)控的

5．破譯了全部生物遺傳密碼，

確定了它在生物界的通用

性，人類更加具體地了解

遺傳信息表達(dá)規(guī)律。

1105．破譯了全部生物遺傳密碼，

確定了它在生遺傳密碼表目錄111遺傳密碼表目錄33mRNA分子上從5至3的方向,每3個(gè)核苷酸構(gòu)建一個(gè)密碼子，編碼某一特定氨基酸或作為蛋白質(zhì)合成的起始、終止信號(hào)，稱為三聯(lián)體密碼(tripletcodon)，也稱遺傳密碼子(geneticcodon)。解決了信息語(yǔ)言的對(duì)應(yīng)關(guān)系。112mRNA分子上從5至3的方向,每3個(gè)核苷酸構(gòu)建一個(gè)密碼子終止密碼：翻譯終止的密碼，不代表任何氨基酸。有3個(gè)：UAA、UAG、UGA?代表氨基酸的密碼：64?3=61起始密碼：

AUG在mRNA起始部位時(shí)為起始密碼。否，為Met密碼。密碼:43=64113終止密碼：翻譯終止的密碼，不代表任何氨基酸。有3個(gè)：UA

1)通用性

遺傳密碼具有的特點(diǎn)從原核生物到人類都使用同一套遺傳密碼。已發(fā)現(xiàn)少數(shù)例外，如動(dòng)物細(xì)胞的線粒體、植物細(xì)胞的葉綠體。2)方向性

mRNA分子上由起始密碼AUG開(kāi)始，從5→3方向閱讀密碼子，直至終止密碼。決定蛋白質(zhì)分子從N端→C端的排列順序。1141)通用性

遺傳密碼具有的特點(diǎn)從原核生物到人類都使用同3)連續(xù)性三聯(lián)體密碼連續(xù)性表現(xiàn)為中間無(wú)標(biāo)點(diǎn)，連續(xù)閱讀。mRNA開(kāi)放閱讀框架內(nèi)發(fā)生一個(gè)或兩個(gè)堿基插入或缺失，可引起移碼突變(frameshiftmutation)。1153)連續(xù)性三聯(lián)體密碼連續(xù)性表現(xiàn)為中間無(wú)標(biāo)點(diǎn)，連續(xù)閱讀。34)簡(jiǎn)并性目錄即有多個(gè)密碼子特異地破譯同一個(gè)氨基酸．遺傳密碼中，除色氨酸和甲硫氨酸僅對(duì)應(yīng)一個(gè)密碼子外，其余氨基酸均有一個(gè)以上密碼子為其編碼。1164)簡(jiǎn)并性目錄即有多個(gè)密碼子特異地破譯同一個(gè)氨基酸．385)擺動(dòng)性tRNA上反密碼子的第1位堿基與mRNA密碼子的第3位堿基配對(duì)時(shí)，可以在一定范圍內(nèi)變動(dòng)，即并不嚴(yán)格遵循堿基配對(duì)規(guī)律，這一現(xiàn)象稱為擺動(dòng)性。1175)擺動(dòng)性tRNA上反密碼子的第1位堿基與mRN

6、生物進(jìn)化，基因突變、獲得的性狀可以遺傳到后代。1186、生物進(jìn)化，基因突變、40

分子遺傳學(xué)理論上的六大進(jìn)展解決了

生命現(xiàn)象的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)（均是核酸）結(jié)構(gòu)模型（同類構(gòu)件、雙螺旋）復(fù)制方式（相似的機(jī)制）遺傳信息流動(dòng)方向（共同的中心法則）遺傳密碼（共用一套相同的密碼）表達(dá)和調(diào)控的機(jī)理（類同的方法）基因突變機(jī)理、意義（變異與進(jìn)化）為基因工程技術(shù)的誕生典定了理論基礎(chǔ)。

理論上的可行性。

119分子遺傳學(xué)理論上的六大進(jìn)展解決了41二、分子遺傳學(xué)新方法是基因工程的

技術(shù)基礎(chǔ)（六大技術(shù)）首當(dāng)其沖的是要解決：①如何自如地得到目的基因；②如何在體外改造基因，得到重組體；③如何在體外轉(zhuǎn)移重組基因；直到20世紀(jì)70年代中期，相繼出現(xiàn)了

幾項(xiàng)關(guān)鍵性技術(shù)，夢(mèng)想成真。120二、分子遺傳學(xué)新方法是基因工程的421．工具酶的發(fā)現(xiàn)：

DNA分子的切割和連接技術(shù)1970年Smith發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶

(restrictionendonuclease，RE)HinfⅠ對(duì)DNA分子有特異地切割作用。

（手術(shù)刀剪）同年Khorana又發(fā)現(xiàn)了T4DNA連接酶（Ligase），能將DNA片段連接在一起。（縫紉機(jī)、漿糊）DNA、RNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶等合成酶。（復(fù)印機(jī)）構(gòu)成了一個(gè)研究DNA、RNA分子的工具酶箱。1211．工具酶的發(fā)現(xiàn)：43

2、DNA片段載體系統(tǒng)的構(gòu)建

目的基因、DNA片段不能復(fù)制，也易破壞。必須連到具有復(fù)制能力的DNA分子上。

載體（vector)

是能攜帶外源DNA、能自我復(fù)制的小DNA分子。最早發(fā)現(xiàn)的是：質(zhì)粒、噬菌體和病毒。1222、DNA片段載體系統(tǒng)的構(gòu)建443、大腸桿菌受體細(xì)胞系統(tǒng)建立

體外獲得的含目的基因或DNA片段的重組體，雖具有自我復(fù)制的本能，但沒(méi)有原料、酶系統(tǒng)和生命活力。必須將其安全轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞才能進(jìn)行增殖，賦予其“生命”。1233、大腸桿菌受體細(xì)胞系統(tǒng)建立4、大腸桿菌DNA轉(zhuǎn)化體系建立

1970年發(fā)現(xiàn)氯化鈣處理過(guò)的細(xì)胞易于吸收接納外源DNA；1972年CohenC報(bào)道，質(zhì)粒DNA也能被大腸桿菌吸收。而后發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)改造的質(zhì)粒、噬菌體和病毒都可以攜帶目的DNA片段和基因，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化大腸桿菌，建立該基因的無(wú)性繁殖系。1244、大腸桿菌DNA轉(zhuǎn)化體系建立465、DNA分析、鑒定技術(shù)

酶切分析技術(shù)（核酸分辨儀）核酸分子雜交技術(shù)（核酸探測(cè)儀）

序列分析（密碼復(fù)讀機(jī)）生物信息學(xué)（密碼破譯機(jī)）

1255、DNA分析、鑒定技術(shù)47

6、DNA分離、純化及鑒定技術(shù)

凝膠電泳：Agarose,PAGEgel離心技術(shù)層析技術(shù)印跡技術(shù):Southernblot………..

1266、DNA分離、純化及鑒定技術(shù)48

技術(shù)上的可行性

六大技術(shù)方法的建立

實(shí)際上的可操作性

材料、實(shí)驗(yàn)條件、時(shí)空條件、

經(jīng)濟(jì)條件和政策。

基礎(chǔ)方面的基本條件（可能性+可行性+

可操作性）具備，尚需人的科學(xué)創(chuàng)新思維+

艱苦的實(shí)踐。才能得到創(chuàng)新的發(fā)明、發(fā)現(xiàn)

和成果。127技術(shù)上的可行性

六大技術(shù)方法的建立

1970年，MIT的科學(xué)家率先提出在體外把不同來(lái)源的遺傳物質(zhì)進(jìn)行重組的設(shè)想，但遭到反對(duì)，不予支持。沒(méi)能進(jìn)行試驗(yàn)。1972年，Boyer等在發(fā)現(xiàn)限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI的基礎(chǔ)上，開(kāi)始了實(shí)驗(yàn)。

1281970年，MIT的科學(xué)家率先提出在體外把不同來(lái)1972年Berg等人使用EcoRI在體外對(duì)猴病毒SV40的DNA和λ噬菌體的DNA分別酶消化，再用T4DNA連接酶將兩種片段連接起來(lái)，得到SV40和λDNA的重組雜種DNA分子，率先完成了世界上第一次成功的DNA體外不同物種之間的DNA重組實(shí)驗(yàn)（片段重組）?；蚬こ痰拇竽憞L試1291972年Berg等人使用EcoRI在體外對(duì)猴病毒S基因工程的誕生1980年Nobel化學(xué)獎(jiǎng)1972年斯坦福大學(xué)的PaulBerg小組完成了首次體外重組實(shí)驗(yàn)。Berg的開(kāi)創(chuàng)性實(shí)驗(yàn)130基因工程的誕生1980年Nobel化學(xué)獎(jiǎng)1972年斯坦福大學(xué)

1973年Cohen成功地進(jìn)行了另一個(gè)體外DNA重組實(shí)驗(yàn)。

分別把編碼卡那霉素和四環(huán)素抗性基因的兩種質(zhì)粒酶切、連接，再將這種重組的DNA分子轉(zhuǎn)化大腸桿菌，某些轉(zhuǎn)化菌落具有既抗卡那霉素又抗四環(huán)素的雙重抗體特性。他的工作是世界上第一次成功的基因克隆實(shí)驗(yàn)，并有基因表達(dá)及新的表型。標(biāo)志著基因工程的誕生。1311973年Cohen成功地進(jìn)行了另一個(gè)體外DpSC101pR6-5抗四環(huán)素抗卡那霉素EcoRI抗卡那霉素基因DNA連接酶重組DNA分子132pSC101pR6-5抗四環(huán)素抗卡那霉素EcoRI抗卡那霉素培養(yǎng)平皿四環(huán)素平板卡那霉素基因四環(huán)素\卡那霉素基因大腸桿菌133培養(yǎng)平皿四環(huán)素平板卡那霉素基因四環(huán)素\卡那霉素基因大腸桿菌5

后來(lái)又把非洲爪蟾核糖體基因片段同pSC101質(zhì)粒重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并在菌體內(nèi)成功轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA。這是第一次成功的基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)。134后來(lái)又把非洲爪蟾核糖體基因片段同pSC101質(zhì)粒重組

1974年，首次實(shí)現(xiàn)異源間基因重組。

把小鼠的生長(zhǎng)激素抑素基因在大腸桿菌中表達(dá)。1351974年，首次實(shí)現(xiàn)異源間基因重組。

把小鼠的1976年，世界上第一個(gè)基因公司在美國(guó)成立，“Genetech”注冊(cè)登記，意味著基因工程的實(shí)際應(yīng)用已跨入商業(yè)運(yùn)作的門檻。生物工程從此進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化。1361976年，世界上第一個(gè)基因公司在美國(guó)成立，“Gene1978年，人類的第一個(gè)基因被克隆。人生長(zhǎng)激素抑素基因被重組到大腸桿菌的質(zhì)粒DNA中。

1978-1979胰島素基因在大腸桿菌中表達(dá)。1371978年，人類的第一個(gè)基因被克隆。人生長(zhǎng)激素抑素基因被1982年

1、把大白鼠的生長(zhǎng)激素基因克隆、轉(zhuǎn)移到小鼠的受精卵內(nèi)，第一個(gè)轉(zhuǎn)基因超級(jí)鼠誕生。

2、人胰島素基因的cDNA被克隆、成功表達(dá)和開(kāi)始成為商品上市。

基因產(chǎn)品有效益、開(kāi)始新興產(chǎn)業(yè)。

1381982年

1、把大白鼠的生長(zhǎng)激素基因克隆、轉(zhuǎn)三、基因工程的基本步驟

——兩個(gè)水平，六個(gè)階段

139三、基因工程的基本步驟

——兩個(gè)水平，六個(gè)基因工程包括分子和細(xì)胞兩個(gè)水平操作分子水平操作指的是基因重組、克隆和表達(dá)的設(shè)計(jì)與重組體構(gòu)建（即重組DNA技術(shù)）；細(xì)胞水平操作則指轉(zhuǎn)化、篩選和培養(yǎng)工程菌或細(xì)胞以及表達(dá)產(chǎn)物的分離純化過(guò)程。140基因工程包括分子和細(xì)胞兩個(gè)水平操作62

1．分子水平操作階段：

獲得含目的基因的重組體分子（亦稱重組子）。

本階段的操作有三個(gè)主要環(huán)節(jié)：

（1）分離：提取、分離含目的基因的DNA分子和載體DNA分子，在分離提取過(guò)程中，注意質(zhì)、量，減少損傷。

（2）切割：選擇合適的RE工具酶，分別對(duì)外源目的DNA分子和載體DNA分子進(jìn)行酶解切割。

（3）連接：用DNA連接酶，將目的基因與載體在體外連接為一個(gè)重組DNA分子，并進(jìn)行鑒定。1411．分子水平操作階段：