第十九章藥物研究的生物化學(xué)基礎(chǔ)課件

第十九章

藥物研究的生物化學(xué)基礎(chǔ)第十九章

藥物研究的生物化學(xué)基礎(chǔ)1第一節(jié)生物藥物制造的生物化學(xué)基礎(chǔ)第一節(jié)生物藥物制造的生物化學(xué)基礎(chǔ)2

生物藥物主要包括生化藥物、微生物藥物、生物技術(shù)藥物和生物制品。制造技術(shù)的特點：1.目的物存在于組成非常復(fù)雜的生物材料中一種生物材料含有成千上萬種成分，各種化合物的形狀、大小、分子形式和理化性質(zhì)各不相同，其中不少還是未知物，而且有效物質(zhì)在制備過程尚處于代謝動態(tài)中，故常常無固定工藝可循。一、生物藥物制備方法的特點生物藥物主要包括生化藥物、微生物藥物、生物技術(shù)藥物32.有些目的物在生物材料中含量極微只達萬分之一、十萬分之一、甚至百萬分之一，因此分離純化步驟多，難于獲得高收率。3.生物活性成分易變性、破壞4.生物藥物制造受理化因素和生物學(xué)因素影響生物活性成分離開生物體后，易變性破壞，分離過程必須十分小心，以保護有效物質(zhì)的生物活性。以致許多工藝設(shè)計理論性不強制造工藝幾乎都在溶液中進行溫度、pH、離子強度對溶液中各種組分的綜合影響常常難于固定2.有些目的物在生物材料中含量極微只達萬分之一、45.生物藥物常采用“多階式”法純化一種有效物質(zhì)常常要聯(lián)用幾個，甚至十幾個步驟并變換不同類型的分離方法交互進行才能達到目的。為了保護目的物的活性及結(jié)構(gòu)完整性即“逐級分離”法。生物藥物的均一性檢測與化學(xué)上的純度概念不完全相同5.生物藥物常采用“多階式”法純化一種有效物質(zhì)常常要聯(lián)用5生物大分子類藥物的分離純化主要原理是：1）根據(jù)分子形狀和分子大小不同的分離方法如，差速離心，超速離心，膜分離透析。電透析、超濾和凝膠過濾等。2）根據(jù)分子電離性質(zhì)（帶電性）不同的分離方法如，離子交換法、電泳法和電聚焦法等。3）根據(jù)分子極性大小與溶解度不同的分離方法如，溶劑提取法、逆流分配法、分配層析法、鹽析法、等電點沉淀法和有機溶劑分級沉淀法。4）根據(jù)配基特異性不同的分離方法——親和層析生物大分子類藥物的分離純化主要原理是：1）根據(jù)分子形狀和分子6是指利用生物細胞的代謝反應(yīng)（更多的是利用微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)）來合成化學(xué)方法難于合成的藥物或藥物中間體。生物合成：微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)：是指利用微生物的代謝作用來進行某些化學(xué)反應(yīng)，確切地說就是利用微生物代謝過程中某種酶對底物進行催化反應(yīng)，以生成所需要的活性物質(zhì)。二、生物合成技術(shù)原理

是指利用生物細胞的代謝反應(yīng)（更多的是利用微生物轉(zhuǎn)化7微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物特點：轉(zhuǎn)化條件溫和具有立體構(gòu)型單一公害少后處理簡便能進行某些化學(xué)反應(yīng)難于進行或不能合成的反應(yīng)為此，在制藥工業(yè)中得到愈來愈廣泛的應(yīng)用，現(xiàn)已形成一個以遺傳工程為指導(dǎo)，以發(fā)酵工程為基礎(chǔ)，包括細胞工程和酶工程有機結(jié)合的生物合成技術(shù)體系，微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物特點：轉(zhuǎn)化條件溫和具有立體8半合成技術(shù)：1）藥物其部分結(jié)構(gòu)由天然資源得到化學(xué)合成法制得最終產(chǎn)品＋2）化學(xué)合成的中間產(chǎn)物微生物轉(zhuǎn)化法獲得最終有效化合物＋半合成技術(shù)：1）藥物其部分結(jié)構(gòu)由天然資源得到化學(xué)合成法制得最9

生物技術(shù)（biotechnology）

又稱為生物工程（bioengineering），是利用生物有機體（動物、植物和微生物）或其組成部分（包括器官、組織、細胞或細胞器等）發(fā)展新產(chǎn)品或新工藝的一種技術(shù)體系。三、生物技術(shù)原理（前述）生物技術(shù)（biotechnology）10包括：發(fā)酵工程基因工程細胞工程酶工程包括：發(fā)酵工程基因工程細胞工程酶工程11

基因工程技術(shù)的定義

用人工方法，提取或制備某種細胞的某種基因，在體外把它和一種載體連接構(gòu)造雜種DNA分子，然后導(dǎo)入受體細胞，讓其復(fù)制與表達，以改變受體細胞的某些性狀或產(chǎn)生人們所需的產(chǎn)物的工程技術(shù)。基因工程技術(shù)的定義12

細胞工程的定義

應(yīng)用細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的方法,通過類似于工程學(xué)的步驟,在細胞整體水平或細胞器水平上按照人們的意愿來改變細胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)以獲得新型生物或一定細胞產(chǎn)品的一門綜合性科學(xué)技術(shù)。其技術(shù)涉及細胞融合技術(shù)、細胞拆和技術(shù)、染色體導(dǎo)入技術(shù)、基因轉(zhuǎn)移技術(shù)、胚胎移植技術(shù)、細胞與組織培養(yǎng)技術(shù)等。

細胞工程的定義應(yīng)用細胞13

酶工程的定義

在酶反應(yīng)器中,利用酶的生物催化作用,生產(chǎn)出人類所需要產(chǎn)品的一門科學(xué)技術(shù)。例如過去蔗糖幾乎全部通過加工甘蔗或甜菜獲得,但現(xiàn)在科學(xué)家利用α-淀粉酶等多種酶的催化作用,在酶反應(yīng)器中將淀粉轉(zhuǎn)化成和蔗糖具有同樣甜度的高果糖漿。酶工程的定義在酶反應(yīng)14

發(fā)酵工程發(fā)酵工程也稱為微生物工程，是在最適合條件下，對單一菌種進行培養(yǎng)，是生物特定產(chǎn)品的一種生物工藝。發(fā)酵工程發(fā)酵工程也稱為微生物工程，是在15單克隆抗體技術(shù)現(xiàn)代生物技術(shù)核心重組DNA技術(shù)生物工程藥物是指運用重組DNA技術(shù)和單克隆抗體技術(shù)生產(chǎn)的多肽、蛋白質(zhì)、激素和酶類藥物以及疫苗、單抗和細胞生長因子類藥物。單克隆抗體技術(shù)現(xiàn)代生物技術(shù)核心重組DNA技術(shù)生物工程藥物16工程菌（或細胞）的大量培養(yǎng)與目的蛋白的生產(chǎn)基因工程是生物技術(shù)中最重要的一種。目的基因制備載體的選擇和制備DNA片段重組連接重組DNA導(dǎo)入受體細胞轉(zhuǎn)化子的篩選DNA重組體的篩選DNA重組體的鑒定工程菌（或細胞）的大量培養(yǎng)與目的蛋白的生產(chǎn)基因工程是生物技術(shù)17

(一)基因載體（Vector）1、定義：攜帶目的基因片段進入受體細胞的DNA一個理想的載體應(yīng)具備以下幾個條件：（a）本身是一個復(fù)制子，能自我復(fù)制。載體在進入受體細胞后，可自身復(fù)制或插入到基因組中，隨受體細胞的基因組一起復(fù)制。（b）分子量小，小分子的DNA制備時不易損傷，小分子DNA限制酶的切點少。（c）目的基因與載體連結(jié)后，可在受體細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄，翻譯成蛋白質(zhì)產(chǎn)物（表達載體）。（d）能給寄主（受體）細胞提供可選擇的標(biāo)記：如抗藥性，營養(yǎng)缺陷型或顯色表型等，以利于篩選。

（E）具有多克隆位點，便于目的基因片段與載體連接。(F)拷貝數(shù)多，便于分離提純。(一)基因載體（Vector）1、定義：攜帶目的18

2、載體的分類

功能分類：克隆載體表達載體轉(zhuǎn)移載體探針載體組成元件的來源分類:

質(zhì)粒（plasmid）載體噬菌體載體：如λ噬菌體載體、M13噬菌體載體雜合載體(如粘粒cosmid)病毒性載體：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體等人工染色體載體

2、載體的分類

功能分類：克193、克隆載體（cloningvector）（1）克隆載體的功能：用來克隆和擴增DNA片段（目的基因）的載體具備條件：（a）必須是一個復(fù)制子，能在受體細胞中復(fù)制。復(fù)制起點Ori復(fù)制區(qū)復(fù)制終點term（b）帶有抗藥性基因Tetr：編碼膜蛋白，阻止Tet進入細胞Ampr：β-內(nèi)酰胺環(huán)水解酶。Kanr：

Kan～P,neo～pCamr：氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶

3、克隆載體（cloningvector）（1）克隆載體的20

（C）具有多克隆位點（multiplecloningsits，MCS）載體上含有的一個人工合成的DNA片段，其上含有數(shù)個單一酶切位點，是外源DNA的插入部位具備條件：是載體中的一段堿基序列，由數(shù)個酶切位點組成。這些位點在載體上都是單一位點（d）可導(dǎo)入受體細胞（C）具有多克隆位點（multiplecloni21pBR322質(zhì)粒有兩個抗藥性基因，每個抗性基因中均含有單克隆位點，外源DNA插入后使相應(yīng)的抗性基因失活，宿主細胞失去相應(yīng)的抗藥性，不能在含相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基中生長，這一現(xiàn)象稱為插入失活。pBR322質(zhì)粒有兩個抗藥性基因，22質(zhì)粒pBR322的抗性基因篩選示意圖質(zhì)粒pBR322的抗性基因篩選示意圖234、表達載體（expressingvector）（1）表達載體的功能：在受體細胞中表達外源基因的載體

結(jié)構(gòu)：克隆載體+表達構(gòu)件—原核生物表達真核生物表達

oriampr基礎(chǔ)上加轉(zhuǎn)錄和翻譯相關(guān)elementMCS

（2）原核（大腸桿菌）表達載體表達載體=克隆載體+表達元件“啟動子—核糖體結(jié)合位點—克隆位點—轉(zhuǎn)錄終止信號”

“P—RBS—MCS—term”4、表達載體（expressingvector）（1）表達24原核表達載體結(jié)構(gòu)示意圖用T7表達系統(tǒng)質(zhì)粒的基本結(jié)構(gòu)元件原核表達載體結(jié)構(gòu)示意圖用T7表達系統(tǒng)質(zhì)粒的基本結(jié)構(gòu)元件25

(3)哺乳動物表達載體（1）病毒載體整合性載體：外源基因通過這種載體與宿主細胞的染色體整合。如pSV系列載體游離型載體：外源基因與這種載體重組后，以病毒顆粒形式在宿主細胞內(nèi)自行復(fù)制或在輔助病毒存在下進行復(fù)制。如痘苗病毒、腺病毒、桿狀病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒等。（2）質(zhì)粒載體常常是穿梭質(zhì)粒載體。既含原核的復(fù)制位點和篩選標(biāo)記，又含真核的復(fù)制位點篩選標(biāo)記和表達構(gòu)件。(3)哺乳動物表達載體（1）病毒載體261.直接從染色體DNA分離

如果物理圖譜已確定，可用限制酶直接從原核生物，噬菌體及動物病毒基因組切取目的基因。（二）目的基因的來源（Isolation）1.直接從染色體DNA分離如果物理圖譜已確定，272.化學(xué)合成要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列

基因小2.化學(xué)合成要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸283.從cDNA文庫（cDNA文庫）篩選目的基因

將不同細胞類型或不同階段細胞的mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后,將所有cDNA混合體與載體進行連接后，將所有的重組體分子都引入宿主細胞并進行擴增，所得到的分子克隆的混合體稱為cDNA文庫。

3.從cDNA文庫（cDNA文庫）篩選目的基因29mRNAcDNA雙鏈cDNA重組DNA分子cDNA文庫反轉(zhuǎn)錄酶載體受體菌復(fù)制*從cDNA文庫獲取目的基因逆轉(zhuǎn)錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTTmRNAcDNA雙鏈cDNA重組DNA分子30

4.從基因組文庫（genomiclibrary）篩選目的基因

采用限制酶將基因組DNA切成片段，每一個DNA片段都與一個載體分子拼接成重組DNA，然后將所有的重組體都引入宿主細胞并進行擴增，得到的分子克隆的混合體稱為“基因組文庫”。從基因組文庫中通過雜交篩選得到目的基因片段。從細胞中分離基因組DNA、用Sau3A或MboI部分消化、回收大小在一定范圍內(nèi)的片段、構(gòu)建重組體。4.從基因組文庫（genomiclibrary）篩選目31組織或細胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫：存在于轉(zhuǎn)化細胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合*從基因組DNA文庫獲取目的基因組織或細胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分325.PCR或RT-PCR

根據(jù)目的基因的核苷酸序列設(shè)計一對引物以基因組DNA為模板經(jīng)PCR擴增目的基因。以mRNA或RNA為模板經(jīng)RT-PCR擴增目的基因。5.PCR或RT-PCR33（三）限制酶的應(yīng)用

限制酶(restrictionenzyme):一類專門切割DNA的酶。是一類能識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并與其特異結(jié)合，并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類核酸內(nèi)切酶。

“Restrictionendonucleasesarebacteriaenzymewhichcut(hydrolyze)DNAintodefinedandreproduciblefragments.Inbacteriatheyformpartoftherestriction—modificationdefensemechanismagainstforeignDNA.Theyarebasicgenecloningtools.”

1.定義：（三）限制酶的應(yīng)用1.定義：342.限制酶的識別和切割位點識別：

4～6堿基對，多具有回文結(jié)構(gòu)（palindrom），少數(shù)識別長序列為8個或8個以上堿基對，有的存在簡并序列（有的核苷酸位點可以不同）。Sau3AI

EcoRI

PstⅠSmaⅠ5′GATCGAATTCCTGCAGCCCGGG3′3′CTAGCTTAAGGACGTCGGGCCC5′

簡并序列：GTYRAC——Y=C/TR=G/AYR=CG/CA/TG/TA∴HindⅡ可識別4個特定序列

2.限制酶的識別和切割位點識別：4～6堿基對，多具有回文353.限制酶的切割方式(1)識別序列內(nèi)兩條鏈上交錯切割，產(chǎn)生單鏈突出的粘性末端(2)對稱處同時切斷DNA的兩條鏈，產(chǎn)生平端DNA片段3.限制酶的切割方式(1)識別序列內(nèi)兩條鏈上交錯切割，產(chǎn)生單364.限制酶的切割結(jié)果切割的結(jié)果：產(chǎn)生三種不同的末端平末端—bluntend5’突出—5’-protruding（cohesiveend）3’突出—3’-protruding（overhangtail）切割的化學(xué)本質(zhì)：磷酸二酯鍵的斷裂,形成含5’—P和3’—OH末端的兩個DNA片段。對一特定的DNA而言，識別序列堿基對少的，則切點數(shù)多，產(chǎn)生的片段小。4.限制酶的切割結(jié)果切割的結(jié)果：產(chǎn)生三種不同的末端37第十九章藥物研究的生物化學(xué)基礎(chǔ)課件38(四)重組體的構(gòu)建1.粘性末端連接：用同一種酶裂解后，產(chǎn)生相同的粘性末端，很容易按照堿基配對的原則以氫鍵結(jié)合，在T4DNA連接酶的作用下，共價閉合。

連接方式：

定向取代

雙向插入（正向/反向）（雙酶切）（單酶切）措施：載體酶切后，用AP（堿性磷酸酶）水解5’端的磷酸基團防止載體的自身環(huán)化。(四)重組體的構(gòu)建1.粘性末端連接：用39

同一種限制酶切割DNA產(chǎn)生的粘性末端的連接

G

G

A

T

C

CC

C

T

A

G

GBamHⅠ的識別序列及切割部位G

G

A

T

C

CC

C

T

A

G

GBamHⅠ含目的基因的DNA片段BamHⅠGC

C

T

A

G5'3'5'3'3'5'5'3'5'3'5'3'G

G

A

T

C

CC

C

T

A

G

G

G

A

T

C

C

G目的基因片段混合、退火G

C

C

T

A

G

G

A

T

C

C

G

G

A

T

C

C

GG

C

C

T

A

G質(zhì)粒載體含目的基因的重組質(zhì)粒G

C

C

T

A

G

G

A

T

C

C

GDNA連接酶同一種限制酶切割DNA產(chǎn)生的粘性末端的連接GGAT40雙酶切DNA片段粘性末端的連接

G

G

A

T

C

CC

C

T

A

G

GBamHⅠBamHⅠBamHⅠG

C

C

T

A

G5'3'5'3'5'5'5'3'5'3'3'G

A

A

T

T

CC

T

T

A

A

G

A

A

T

T

C

G目的基因片段混合、退火G

C

T

T

A

A

G

A

T

C

C

G

A

A

T

T

C

GG

C

C

T

A

G重組質(zhì)粒DNA連接酶EcoRIEco

RI5'

G

A

T

C

C

G

G

C

T

T

A

A

A

A

T

T

C

G

G

C

C

T

A

G

G

A

T

C

C

G

G

C

T

T

A

AEcoRI

GATCC

G

G

CCTAG3'5'載體雙酶切DNA片段粘性末端的連接GGATCCCC41加入同聚體尾（homopolymerictail）連接

TdT：末端轉(zhuǎn)移酶，可將某種單一脫氧核苷酸逐一加到3’-OH上去。底物：3’粘性突出末端

加入同聚體尾（homopolymerictail）連接422.平端連接

不同方式產(chǎn)生的平端DNA片段可以在T4DNA連接酶的作用下，與某些限制酶產(chǎn)生的平端載體相連接。在連接時，所用的ATP及T4DNA連接酶的濃度要比連接粘末端的高些。2.平端連接43(五)重組體的轉(zhuǎn)化受體細胞應(yīng)具備下列條件:1.安全宿主菌（或宿主細胞）在人腸道幾無存活或存活率極低2.限制酶缺陷型，外源DNA進入受體菌不被降解3.重組缺陷型，保證外源DNA不與細菌基因組DNA重組，獨立存在4.能發(fā)展成感受態(tài)細胞的菌株感受態(tài)：是受體菌能接受外源DNA能力的一種生理狀態(tài)感受態(tài)細胞：指經(jīng)過一定方法處理后具備接受外源DNA能力的細胞(五)重組體的轉(zhuǎn)化受體細胞應(yīng)具備下列條件:44(五)重組體的轉(zhuǎn)化

（transformation）

定義：

將質(zhì)?；蚱渌庠碊NA導(dǎo)入處于感受態(tài)的宿主細胞，并使其獲得新的表型的過程。過程：細胞—低溫CaCl2處理—感受態(tài)細胞—加重組DNA—42℃熱休克—重組體吸入細胞—復(fù)蘇—涂板（含抗生素）—篩選轉(zhuǎn)化菌落。其它方法：電轉(zhuǎn)化、PEG法等。

(五)重組體的轉(zhuǎn)化

（transformation）45

重組DNA轉(zhuǎn)化過程示意圖重組DNA轉(zhuǎn)化過程示意圖46

感染（fection）

以噬菌體、粘粒和真核病毒為載體的重組DNA分子，體外經(jīng)包裝成為具有感染能力的病毒或噬菌體顆粒，才能感染相應(yīng)的細胞，并在其中擴增。此過程又叫轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）。

感染效率》轉(zhuǎn)化效率

感染（fection）47（六）重組體的篩選和鑒定

涉及遺傳學(xué)方法、免疫學(xué)方法、核酸雜交和PCR方法1.根據(jù)重組體的表型進行篩選（1）抗生素抗性篩選：所有的克隆載體均帶有可供選擇的遺傳學(xué)標(biāo)志或特征，如某種抗生素的抗性基因，為選擇提供方便。

（六）重組體的篩選和鑒定涉及遺傳學(xué)方法、免疫學(xué)方法48

2.酶切鑒定

挑選單個菌落—擴大培養(yǎng)—小量快速提取質(zhì)?！盖校ǜ鶕?jù)插入片段上的酶切位點選定）—分析有無插入片段、插入片段大小及數(shù)量、插入方向等。

2.酶切鑒定挑選單個菌落—擴大培養(yǎng)—小量49（三）核酸雜交法—菌落原位雜交

從基因文庫、cDNA文庫或重組質(zhì)粒中篩選目的基因的最有效的方法之一，它與目的基因的表達與否無關(guān)。（三）核酸雜交法—菌落原位雜交50原位雜交

原位雜交51基因工程的基本過程

基因工程的基本過程52重組DNA技術(shù)在藥學(xué)中的應(yīng)用①生產(chǎn)基因工程藥物②定向改造生物的基因結(jié)構(gòu)，構(gòu)建高產(chǎn)菌株，用于改造傳統(tǒng)制藥工業(yè)③用于基礎(chǔ)研究重組DNA技術(shù)在藥學(xué)中的應(yīng)用①生產(chǎn)基因工程藥物53單克隆抗體（biotechnology）

是由一個雜交瘤細胞及其后代產(chǎn)生的抗體，具有單一、特異與純化的特性。單克隆抗體主要用于免疫診斷、定向給藥及家庭診斷檢測試劑盒的配制，在治療上也具有良好應(yīng)用前景。單克隆抗體（biotechnology）是由54抗原注入小鼠體內(nèi)用PEG促使細胞融合得到雜交瘤細胞收集骨髓瘤細胞分離受免淋巴細胞培養(yǎng)骨髓瘤細胞單抗產(chǎn)品單抗產(chǎn)品在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)克隆雜交瘤細胞擴大組織培養(yǎng)或生成腹水瘤分離純化篩選產(chǎn)生專一抗體的雜交瘤細胞分離純化雜交瘤細胞與單克隆抗體制造示意圖抗原注入小鼠體內(nèi)用PEG促使細胞融合得到雜交瘤細胞收集骨髓瘤55第二節(jié)藥物質(zhì)量控制的生物化學(xué)基礎(chǔ)

第二節(jié)藥物質(zhì)量控制的生物化學(xué)基礎(chǔ)

56一、藥物質(zhì)量控制的常用生化分析法一、藥物質(zhì)量控制的常用生化分析法57生化分析法的優(yōu)點：操作簡便，取樣少，靈敏度高，專一性強。微量凱氏定氮法——測定含氮有機藥物酶法——分析具有旋光異構(gòu)體或幾何異構(gòu)體的藥物免疫法——分析具有抗原或半抗原性質(zhì)的藥物放射酶法——檢測微生物藥品等生化分析法的優(yōu)點：操作簡便，取樣少，靈敏度高，專一性強。微量58（一）免疫分析法

基于抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)發(fā)展起來的分析方法。1.免疫擴散法2.免疫電泳法3.放射免疫測定法（RIA）4.酶聯(lián)免疫測定法（ELISA）（一）免疫分析法

基于抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)發(fā)展起來591.免疫擴散法本法可用于未知樣品的抗原組成及不同樣品的抗原特性比較鑒定。1.免疫擴散法本法可用于未知樣品的抗原602.免疫電泳法本法可用以檢查抗原制劑的純度和分析抗原混合物的組分。2.免疫電泳法本法可用以檢查抗原制劑的純度613.放射免疫測定法（RIA）Ag-AbAgAg*-Ab＋Ab＋Ag*3.放射免疫測定法（RIA）Ag-AbAgAg*-624.酶聯(lián)免疫測定法（RIA）4.酶聯(lián)免疫測定法（RIA）63（二）電泳分析法

電泳是帶點顆粒在電場作用下，向著與其所帶電荷相反的電極方向移動。各種物質(zhì)由于所帶凈電荷的種類和數(shù)量不同，因而在電場中的遷移方向和速度不同。利用物質(zhì)的這種性質(zhì)可以對物質(zhì)進行分離和鑒定。（二）電泳分析法

電泳是帶點顆粒在電場作用下，向著與64電泳分析法

電泳分析法

65影響顆粒電泳遷移率的因素主要有：1.緩沖液的種類和性質(zhì)2.電場3.支持介質(zhì)影響顆粒電泳遷移率的因素主要有：1.66（三）酶法分析酶法分析的原理是借助酶促反應(yīng)（包括單酶或多酶耦聯(lián)反應(yīng)）對酶或酶所作用的底物或參與酶促反應(yīng)的輔酶、激動劑和抑制劑等進行定性、定量分析。（三）酶法分析酶法分析的原理是借助酶促反應(yīng)（包67酶法分析的特點酶法分析的特點68酶法分析主要有三類測定法：1.中止反應(yīng)法2.連續(xù)測定法3.循環(huán)放大法酶法分析主要有三類測定法：1.中止反應(yīng)法2.連續(xù)測定法369第十九章藥物研究的生物化學(xué)基礎(chǔ)課件70二、生物藥物質(zhì)量控制的生化分析法

二、生物藥物質(zhì)量控制的生化分析法

71（一）多肽與蛋白質(zhì)類藥物的主要分析方法1.蛋白質(zhì)藥物的純度分析蛋白質(zhì)純度一般是指樣品有無含其他雜蛋白，而不包括鹽類、緩沖液離子、SDS等小分子在內(nèi)。蛋白質(zhì)純度檢測方法：聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）SDS毛細管電泳（CE）等點聚焦（IEF）HPLC（包括凝膠排阻層析，各種反相HPLC，離子交換色譜，疏水色譜等）化學(xué)法（一）多肽與蛋白質(zhì)類藥物的主要分析方法1.蛋白質(zhì)藥物的純722.多肽與蛋白質(zhì)的分子量的測定2.多肽與蛋白質(zhì)的分子量的測定733.蛋白質(zhì)的定量測定3.蛋白質(zhì)的定量測定74第十九章藥物研究的生物化學(xué)基礎(chǔ)課件754.生物質(zhì)譜法4.生物質(zhì)譜法76（二）核酸類藥物的主要分析方法

核酸、核苷酸及其衍生物的分子中含有堿基，具有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)，對紫外光有特征吸收，RNA和DNA對紫外光的特征吸收位于260nm處。核酸分子中含有堿基、戊糖和磷酸。定量核酸的方法可測定三者中任何一種，從而計算樣品中的核酸含量。

每1ml含1μgRNA溶液的光吸收值為0.022，

每1ml含1μgDNA溶液的光吸收值為0.020。1.紫外分光光度法測定RNA與DNA含量（二）核酸類藥物的主要分析方法核酸、核苷酸及其衍生77當(dāng)RNA與濃鹽酸在100℃下煮沸后，即發(fā)生降解產(chǎn)生核糖，并進而轉(zhuǎn)變?yōu)榭啡?，在FeCl3或CuCl2催化下，糠醛與3，5-二羥基甲苯（地衣酚）反應(yīng)生成綠色復(fù)合物，在670nm處有最大吸收。2.地衣酚顯色法測定RNA當(dāng)RNA與濃鹽酸在100℃下煮沸后，即發(fā)生降783.二苯胺法測定DNA含量3.二苯胺法測定DNA含量79（三）酶類藥物的分析酶類藥物的主要質(zhì)量指標(biāo)是它的催化活力。適宜的測定酶活力的方法至少應(yīng)滿足如下條件：1.有可被檢測且能反映酶反應(yīng)進行程度的信號物2.底物對酶遠遠過量3.適宜的反應(yīng)溫度4.最適的pH反應(yīng)體系5.被測的酶量適當(dāng)6.測定時間在酶促反應(yīng)初速度范圍內(nèi)。（三）酶類藥物的分析酶類藥物的主要質(zhì)量指標(biāo)是它的催80（四）重組DNA藥物中的可能雜質(zhì)檢查（四）重組DNA藥物中的可能雜質(zhì)檢查811.外源性DNA重組DNA藥物中殘留的外源性DNA來源于宿主細胞，每種制品都有其獨特的殘留DNA，因此產(chǎn)品中必須控制外源性DNA殘留量。測定殘留DNA的有效方法：DNA分子雜交技術(shù)。1.外源性DNA重組DNA藥物中殘留的外源性DNA822.宿主細胞蛋白質(zhì)宿主細胞蛋白質(zhì)簡稱宿主蛋白，是指生成過程中來自宿主或培養(yǎng)基中的殘留蛋白或多肽等雜質(zhì)。測定制品中宿主蛋白含量的方法：酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）；Westernblot法。2.宿主細胞蛋白質(zhì)宿主細胞蛋白質(zhì)簡稱宿主蛋白，是指83３.二聚體或多聚體的測定一般采用分子排阻色譜法測定二聚體或多聚體的含量限度。4.降解產(chǎn)物的測定鑒于降解產(chǎn)物的基本結(jié)構(gòu)通常與未降解的重組藥物相似，因此，對降解產(chǎn)物的測定多采用離子對反相色譜。３.二聚體或多聚體的測定一般采用分子排阻色譜法測定84第三節(jié)藥理學(xué)研究的生物化學(xué)基礎(chǔ)第三節(jié)藥理學(xué)研究的生物化學(xué)基礎(chǔ)85現(xiàn)代藥理學(xué)研究已從整體、系統(tǒng)、器官、組織、細胞進入到亞細胞、分子甚至量子水平，因此生物化學(xué)和分子生物學(xué)已成為現(xiàn)代藥理學(xué)的重要理論基礎(chǔ)。現(xiàn)代藥理學(xué)研究已從整體、系統(tǒng)、器官、組織、細胞進入86一、藥物作用的生物化學(xué)基礎(chǔ)

（一）神經(jīng)傳導(dǎo)與神經(jīng)遞質(zhì)當(dāng)兩個神經(jīng)元的突觸＜20nm時，動作電位仍可使突觸后膜去極化，神經(jīng)沖動繼續(xù)向下傳遞。如裂隙＞20nm時，就必須由神經(jīng)遞質(zhì)來傳遞信息。神經(jīng)遞質(zhì)(突觸分泌信號)：神經(jīng)元突觸前膜釋放起著信息傳遞作用的物質(zhì)稱為神經(jīng)遞質(zhì)。一、藥物作用的生物化學(xué)基礎(chǔ)

（一）神經(jīng)傳導(dǎo)與神經(jīng)遞質(zhì)87

（二）受體的結(jié)構(gòu)與功能細胞中能識別配體并與其特異性結(jié)合，引起各種生物效應(yīng)的分子稱為受體。為蛋白質(zhì)，部分為糖蛋白或脂蛋白。

受體的化學(xué)本質(zhì)：

（二）受體的結(jié)構(gòu)與功能細胞中能識別配體并與881.受體——離子通道型受體本身構(gòu)成離子通道。當(dāng)受體的調(diào)節(jié)部位與配體結(jié)合后，受體變構(gòu)，使通道開放或關(guān)閉、引起或切斷陽離子、陰離子的流動，從而傳遞信息。1.受體——離子通道型受體本身構(gòu)成離子通道。892.受體——G蛋白-效應(yīng)蛋白型在真核細胞，鳥苷三磷酸-結(jié)合蛋白（G蛋白）在聯(lián)系細胞膜受體與效應(yīng)蛋白質(zhì)中起著重要的介導(dǎo)作用。2.受體——G蛋白-效應(yīng)蛋白型在真核細胞90第十九章藥物研究的生物化學(xué)基礎(chǔ)課件913.受體——酪氨酸蛋白激酶型3.受體——酪氨酸蛋白激酶型924.受體——轉(zhuǎn)錄因子型4.受體——轉(zhuǎn)錄因子型93

（三）藥物作用的靶酶藥物對靶酶的作用：一是調(diào)節(jié)酶量（酶的合成增加或減少），二是調(diào)節(jié)酶活力（激動劑、抑制劑、輔酶或活力調(diào)節(jié)）。有些重要治療劑的作用在于它們能選擇性地抑制一種靶酶。

（三）藥物作用的靶酶藥物對靶酶的作用：一94一種酶抑制劑要成為應(yīng)用于臨床的有效藥物應(yīng)具備以下條件：被抑制的靶酶所催化的生化反應(yīng)與某種疾病的發(fā)生有關(guān)，在患者體內(nèi)這一生化途徑的抑制具有治療意義。2.這種酶抑制劑必須具有特異性，在治療劑量內(nèi)不對其它代謝途徑或受體發(fā)生抑制作用。3.這種抑制劑應(yīng)具有某種藥動學(xué)特征，如可被吸收并滲透到作用部位和具有合理，可預(yù)見的量效關(guān)系及作用持續(xù)時間。4.抑制劑對人體毒性較小，療效指數(shù)高。5.抑制劑應(yīng)符合藥品標(biāo)準(zhǔn)。工藝、質(zhì)量與價格在臨床上與市場上具有競爭性。一種酶抑制劑要成為應(yīng)用于臨床的有效藥物應(yīng)具備以下條件95

（四）細胞生長調(diào)節(jié)因子細胞生長調(diào)節(jié)因子系在體內(nèi)和體外對效應(yīng)細胞的生長、增殖和分化起調(diào)控作用的一類生理活性物質(zhì)，其中大多數(shù)是蛋白質(zhì)或多肽，亦有非蛋白質(zhì)物質(zhì)。許多生長因子在靶細胞上有特異性受體，它們是一類分泌性、可溶性介質(zhì)，僅微量就具有生物活性。

（四）細胞生長調(diào)節(jié)因子細胞生長調(diào)節(jié)因子系在體96細胞生長調(diào)節(jié)因子分為：1.細胞生長刺激因子類：如：促紅細胞生長因子與集落細胞刺激因子等造血細胞生長因子和表皮生長因子、纖維細胞生長因子、神經(jīng)生長因子、白細胞介素1~18、骨生長因子等。2.細胞生長抑制因子類：如：如干擾素（α、β、γ），腫瘤壞死因子α、β，轉(zhuǎn)化生長因子（TGFS），肝增殖抑制因子等。細胞生長調(diào)節(jié)因子分為：1.細胞生長刺激因子類：如：促紅細97二、新藥物篩選的生物化學(xué)方法

研究治療某種疾病的藥物，首先要有能反映預(yù)期藥理作用的篩選模型。新藥篩選模型可以是整體動物或是細胞、亞細胞或分子水平。生物化學(xué)理論與實驗方法常常成為新藥篩選與藥效學(xué)研究的技術(shù)手段。二、新藥物篩選的生物化學(xué)方法

研究治療某種疾98（一）放射配基受體結(jié)合法（RRA）（一）放射配基受體結(jié)合法（RRA）99（二）酶學(xué)實驗法在藥物代謝中起關(guān)鍵作用的酶是肝臟細胞色素P450系統(tǒng)。其主要技術(shù)：制備肝微粒體和線粒體用于體外藥物代謝研究；用誘導(dǎo)肝臟藥物酶的方法研究藥物對肝臟藥物酶的影響；觀察藥物對細胞色素P450活性及含量的影響以及藥物與P450結(jié)合后的光譜分析；測定藥物受肝臟藥物代謝酶的水解作用和藥物經(jīng)葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的作用所產(chǎn)生的結(jié)合反應(yīng)等。（二）酶學(xué)實驗法在藥物代謝中起關(guān)鍵作用的酶是肝臟細胞色素P4100（三）膜功能研究方法在藥理學(xué)研究中有代表性的膜制備技術(shù)與功能研究方法常見的有：1.鈣調(diào)蛋白-紅細胞膜的制備及鈣調(diào)蛋白功能測定應(yīng)用高速離心法制備的紅細胞膜含有Ca2+、Mg2+-ATP酶是一種與鈣離子轉(zhuǎn)運密切相關(guān)的CaM靶酶。通過測定CaM激活Ca2+、Mg2+-ATP酶活性的變化可觀察鈣拮抗劑類藥物的藥理活性。（三）膜功能研究方法在藥理學(xué)研究中有代表性的膜制1012.心肌細胞膜的制備與功能測定應(yīng)用差速離心法制備的心肌細胞膜可作為膜上酶的活性的測定材料。強心甙，某些抗心律失常藥和β-腎上腺能阻斷藥的作用機制都與心肌細胞膜上的Na+、K+-

ATP酶或腺苷酸環(huán)化酶以及膜上專一性受體的功能有關(guān)。因此，心肌細胞膜的功能分析可供這類藥物的篩選研究。2.心肌細胞膜的制備與功能測定應(yīng)用102（四）生化代謝功能分析法體內(nèi)存在著一整套復(fù)雜又十分完整的代謝調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，各種代謝相互聯(lián)系，有序進行。整體的神經(jīng)-體液調(diào)節(jié)細胞及其關(guān)鍵酶的調(diào)節(jié)生化代謝功能分析的目的：是研究糾正代謝紊亂與失調(diào)藥物的有效實驗方法。（四）生化代謝功能分析法體內(nèi)存在著一整套復(fù)雜又十1031.降血糖藥物實驗法：2.調(diào)血脂藥及抗動脈粥樣硬化藥實驗法：1）喂養(yǎng)法抗動脈粥樣硬化藥的篩選模型主要有：2）免疫學(xué)方法3.凝血藥和抗凝血藥實驗法1.降血糖藥物實驗法：2.調(diào)血脂藥及抗動脈粥樣硬化藥實驗104（五）逆向藥理學(xué)以往的藥理學(xué)研究模式：先發(fā)現(xiàn)作用于某一類受體或受體亞型的藥物（確定受體的存在）分離受體（研究受體的相關(guān)基因家族）即：配基（藥物）受體基因模式逆向藥理學(xué)研究模式：即：受體基因配基（藥物）（五）逆向藥理學(xué)以往的藥理學(xué)研究模式：105第四節(jié)與藥物設(shè)計有關(guān)的生物化學(xué)原理第四節(jié)與藥物設(shè)計有關(guān)的生物化學(xué)原理106藥物設(shè)計是新藥研究的重要內(nèi)容，是研究和開發(fā)新藥的重要手段和途徑。所謂藥物設(shè)計是通過科學(xué)的構(gòu)思與科學(xué)的方法，提出具有特定藥理活性的新化學(xué)實體或新化合物結(jié)構(gòu)。藥物設(shè)計是新藥研究的重要內(nèi)容，是研究和開發(fā)新藥的重107一、酶與藥物設(shè)計一些重要治療藥物的作用機制就在于它們抑制了一種靶酶，靶酶有的存在于正常人體組織中，有的存在于感染人體的病原體內(nèi)。一、酶與藥物設(shè)計一些重要治療藥物的作用機制就108（可逆性膽堿酯酶抑制劑）毒扁豆堿抑制乙酰膽堿酯酶抑制乙酰膽堿阻止其水解，延長其效應(yīng)。毒扁豆堿起著擬膽堿劑的作用，主要用于青光眼縮瞳作用。（可逆性膽堿酯酶抑制劑）毒扁豆堿抑制乙酰膽堿酯酶抑制乙酰109磺胺類藥物二氫葉酸二氫葉酸合成酶二氫蝶呤啶對氨基苯甲酸谷氨酸二氫葉酸還原酶四氫葉酸磺胺類藥物抗菌增效劑TMP磺胺類藥物二氫葉酸二氫葉酸合成酶二氫蝶呤啶二氫葉酸110二、受體與藥物設(shè)計藥物受體是在分子水平上，與藥物互相識別、相互作用而發(fā)生初始藥理效應(yīng)的生物大分子。受體的基本特征是：1.受體具有識別特異性配體（藥物）的能力，其識別的基礎(chǔ)是二者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)的互補；配體與受體結(jié)合后可引發(fā)生物效應(yīng)，其結(jié)合具有特異性，飽和性和可逆性；3.與受體結(jié)合的配體，其生物效應(yīng)可分為激動劑和拮抗劑。二、受體與藥物設(shè)計藥物受體是在分子水平上，與111（一）受體介導(dǎo)的靶向藥物設(shè)計利用受體學(xué)說指導(dǎo)藥物設(shè)計，目前切實可行的是受體介導(dǎo)的藥物導(dǎo)向，即以受體的配體為藥物載體，把有效藥物選擇性地通過受體導(dǎo)向特定的細胞分子，以達到治療疾病和減少毒副作用的目的。利用無藥理性活性的受體配體作為藥物載體，制成的靶向藥物大大地增加了藥物作用的選擇性。（一）受體介導(dǎo)的靶向藥物設(shè)計利用受體學(xué)說指導(dǎo)藥物112靶向藥物按其導(dǎo)向機制可分為：是指藥物通過正常的生理轉(zhuǎn)運和潴留達到靶部位。被動靶向：主動靶向：是指通過生物識別設(shè)計，如抗體識別、受體識別、免疫識別等將藥物導(dǎo)向特異靶部位。物理靶向：形象的稱為“藥物導(dǎo)彈”。是指通過磁場、點場、溫度等因素把藥物導(dǎo)向靶部位，如磁性微球、熱敏脂質(zhì)體等。靶向藥物按其導(dǎo)向機制可分為：是指藥物通過正常的生理113（二）藥物與受體結(jié)合的構(gòu)象分析研究受體蛋白三維結(jié)構(gòu)的方法有：1.同源分子法2.歸納法3.演繹法4.比較分子力場分析法（二）藥物與受體結(jié)合的構(gòu)象分析研究受體蛋白三維結(jié)114三、藥物代謝轉(zhuǎn)化與前體藥物設(shè)計三、藥物代謝轉(zhuǎn)化與前體藥物設(shè)計115四、生物大分子的結(jié)構(gòu)模擬與藥物設(shè)計四、生物大分子的結(jié)構(gòu)模擬與藥物設(shè)計116五、藥物基因組學(xué)與藥物研究五、藥物基因組學(xué)與藥物研究117藥物基因組學(xué)在以下藥學(xué)領(lǐng)域中將獲得廣泛應(yīng)用：檢測、評估個體對某種藥物的適用程度，使藥物的有效性達到最大化。2.檢測藥物應(yīng)答基因的多態(tài)性，依據(jù)個體的遺傳差異實現(xiàn)個性化用藥。3.確定疾病發(fā)生相關(guān)基因，篩選新的藥物作用靶點，研究藥物代謝酶基因譜及藥物產(chǎn)生毒副反應(yīng)的相關(guān)基因，從而提高新藥開發(fā)命中率，增強藥物療效和安全性，縮短開發(fā)周期，降低研究開發(fā)成本。藥物基因組學(xué)在以下藥學(xué)領(lǐng)域中將獲得廣泛應(yīng)用：檢測、評估個體對118第十九章

藥物研究的生物化學(xué)基礎(chǔ)第十九章

藥物研究的生物化學(xué)基礎(chǔ)119第一節(jié)生物藥物制造的生物化學(xué)基礎(chǔ)第一節(jié)生物藥物制造的生物化學(xué)基礎(chǔ)120

生物藥物主要包括生化藥物、微生物藥物、生物技術(shù)藥物和生物制品。制造技術(shù)的特點：1.目的物存在于組成非常復(fù)雜的生物材料中一種生物材料含有成千上萬種成分，各種化合物的形狀、大小、分子形式和理化性質(zhì)各不相同，其中不少還是未知物，而且有效物質(zhì)在制備過程尚處于代謝動態(tài)中，故常常無固定工藝可循。一、生物藥物制備方法的特點生物藥物主要包括生化藥物、微生物藥物、生物技術(shù)藥物1212.有些目的物在生物材料中含量極微只達萬分之一、十萬分之一、甚至百萬分之一，因此分離純化步驟多，難于獲得高收率。3.生物活性成分易變性、破壞4.生物藥物制造受理化因素和生物學(xué)因素影響生物活性成分離開生物體后，易變性破壞，分離過程必須十分小心，以保護有效物質(zhì)的生物活性。以致許多工藝設(shè)計理論性不強制造工藝幾乎都在溶液中進行溫度、pH、離子強度對溶液中各種組分的綜合影響常常難于固定2.有些目的物在生物材料中含量極微只達萬分之一、1225.生物藥物常采用“多階式”法純化一種有效物質(zhì)常常要聯(lián)用幾個，甚至十幾個步驟并變換不同類型的分離方法交互進行才能達到目的。為了保護目的物的活性及結(jié)構(gòu)完整性即“逐級分離”法。生物藥物的均一性檢測與化學(xué)上的純度概念不完全相同5.生物藥物常采用“多階式”法純化一種有效物質(zhì)常常要聯(lián)用123生物大分子類藥物的分離純化主要原理是：1）根據(jù)分子形狀和分子大小不同的分離方法如，差速離心，超速離心，膜分離透析。電透析、超濾和凝膠過濾等。2）根據(jù)分子電離性質(zhì)（帶電性）不同的分離方法如，離子交換法、電泳法和電聚焦法等。3）根據(jù)分子極性大小與溶解度不同的分離方法如，溶劑提取法、逆流分配法、分配層析法、鹽析法、等電點沉淀法和有機溶劑分級沉淀法。4）根據(jù)配基特異性不同的分離方法——親和層析生物大分子類藥物的分離純化主要原理是：1）根據(jù)分子形狀和分子124是指利用生物細胞的代謝反應(yīng)（更多的是利用微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)）來合成化學(xué)方法難于合成的藥物或藥物中間體。生物合成：微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)：是指利用微生物的代謝作用來進行某些化學(xué)反應(yīng)，確切地說就是利用微生物代謝過程中某種酶對底物進行催化反應(yīng)，以生成所需要的活性物質(zhì)。二、生物合成技術(shù)原理

是指利用生物細胞的代謝反應(yīng)（更多的是利用微生物轉(zhuǎn)化125微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物特點：轉(zhuǎn)化條件溫和具有立體構(gòu)型單一公害少后處理簡便能進行某些化學(xué)反應(yīng)難于進行或不能合成的反應(yīng)為此，在制藥工業(yè)中得到愈來愈廣泛的應(yīng)用，現(xiàn)已形成一個以遺傳工程為指導(dǎo)，以發(fā)酵工程為基礎(chǔ)，包括細胞工程和酶工程有機結(jié)合的生物合成技術(shù)體系，微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物特點：轉(zhuǎn)化條件溫和具有立體126半合成技術(shù)：1）藥物其部分結(jié)構(gòu)由天然資源得到化學(xué)合成法制得最終產(chǎn)品＋2）化學(xué)合成的中間產(chǎn)物微生物轉(zhuǎn)化法獲得最終有效化合物＋半合成技術(shù)：1）藥物其部分結(jié)構(gòu)由天然資源得到化學(xué)合成法制得最127

生物技術(shù)（biotechnology）

又稱為生物工程（bioengineering），是利用生物有機體（動物、植物和微生物）或其組成部分（包括器官、組織、細胞或細胞器等）發(fā)展新產(chǎn)品或新工藝的一種技術(shù)體系。三、生物技術(shù)原理（前述）生物技術(shù)（biotechnology）128包括：發(fā)酵工程基因工程細胞工程酶工程包括：發(fā)酵工程基因工程細胞工程酶工程129

基因工程技術(shù)的定義

用人工方法，提取或制備某種細胞的某種基因，在體外把它和一種載體連接構(gòu)造雜種DNA分子，然后導(dǎo)入受體細胞，讓其復(fù)制與表達，以改變受體細胞的某些性狀或產(chǎn)生人們所需的產(chǎn)物的工程技術(shù)?；蚬こ碳夹g(shù)的定義130

細胞工程的定義

應(yīng)用細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的方法,通過類似于工程學(xué)的步驟,在細胞整體水平或細胞器水平上按照人們的意愿來改變細胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)以獲得新型生物或一定細胞產(chǎn)品的一門綜合性科學(xué)技術(shù)。其技術(shù)涉及細胞融合技術(shù)、細胞拆和技術(shù)、染色體導(dǎo)入技術(shù)、基因轉(zhuǎn)移技術(shù)、胚胎移植技術(shù)、細胞與組織培養(yǎng)技術(shù)等。

細胞工程的定義應(yīng)用細胞131

酶工程的定義

在酶反應(yīng)器中,利用酶的生物催化作用,生產(chǎn)出人類所需要產(chǎn)品的一門科學(xué)技術(shù)。例如過去蔗糖幾乎全部通過加工甘蔗或甜菜獲得,但現(xiàn)在科學(xué)家利用α-淀粉酶等多種酶的催化作用,在酶反應(yīng)器中將淀粉轉(zhuǎn)化成和蔗糖具有同樣甜度的高果糖漿。酶工程的定義在酶反應(yīng)132

發(fā)酵工程發(fā)酵工程也稱為微生物工程，是在最適合條件下，對單一菌種進行培養(yǎng)，是生物特定產(chǎn)品的一種生物工藝。發(fā)酵工程發(fā)酵工程也稱為微生物工程，是在133單克隆抗體技術(shù)現(xiàn)代生物技術(shù)核心重組DNA技術(shù)生物工程藥物是指運用重組DNA技術(shù)和單克隆抗體技術(shù)生產(chǎn)的多肽、蛋白質(zhì)、激素和酶類藥物以及疫苗、單抗和細胞生長因子類藥物。單克隆抗體技術(shù)現(xiàn)代生物技術(shù)核心重組DNA技術(shù)生物工程藥物134工程菌（或細胞）的大量培養(yǎng)與目的蛋白的生產(chǎn)基因工程是生物技術(shù)中最重要的一種。目的基因制備載體的選擇和制備DNA片段重組連接重組DNA導(dǎo)入受體細胞轉(zhuǎn)化子的篩選DNA重組體的篩選DNA重組體的鑒定工程菌（或細胞）的大量培養(yǎng)與目的蛋白的生產(chǎn)基因工程是生物技術(shù)135

(一)基因載體（Vector）1、定義：攜帶目的基因片段進入受體細胞的DNA一個理想的載體應(yīng)具備以下幾個條件：（a）本身是一個復(fù)制子，能自我復(fù)制。載體在進入受體細胞后，可自身復(fù)制或插入到基因組中，隨受體細胞的基因組一起復(fù)制。（b）分子量小，小分子的DNA制備時不易損傷，小分子DNA限制酶的切點少。（c）目的基因與載體連結(jié)后，可在受體細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄，翻譯成蛋白質(zhì)產(chǎn)物（表達載體）。（d）能給寄主（受體）細胞提供可選擇的標(biāo)記：如抗藥性，營養(yǎng)缺陷型或顯色表型等，以利于篩選。

（E）具有多克隆位點，便于目的基因片段與載體連接。(F)拷貝數(shù)多，便于分離提純。(一)基因載體（Vector）1、定義：攜帶目的136

2、載體的分類

功能分類：克隆載體表達載體轉(zhuǎn)移載體探針載體組成元件的來源分類:

質(zhì)粒（plasmid）載體噬菌體載體：如λ噬菌體載體、M13噬菌體載體雜合載體(如粘粒cosmid)病毒性載體：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體等人工染色體載體

2、載體的分類

功能分類：克1373、克隆載體（cloningvector）（1）克隆載體的功能：用來克隆和擴增DNA片段（目的基因）的載體具備條件：（a）必須是一個復(fù)制子，能在受體細胞中復(fù)制。復(fù)制起點Ori復(fù)制區(qū)復(fù)制終點term（b）帶有抗藥性基因Tetr：編碼膜蛋白，阻止Tet進入細胞Ampr：β-內(nèi)酰胺環(huán)水解酶。Kanr：

Kan～P,neo～pCamr：氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶

3、克隆載體（cloningvector）（1）克隆載體的138

（C）具有多克隆位點（multiplecloningsits，MCS）載體上含有的一個人工合成的DNA片段，其上含有數(shù)個單一酶切位點，是外源DNA的插入部位具備條件：是載體中的一段堿基序列，由數(shù)個酶切位點組成。這些位點在載體上都是單一位點（d）可導(dǎo)入受體細胞（C）具有多克隆位點（multiplecloni139pBR322質(zhì)粒有兩個抗藥性基因，每個抗性基因中均含有單克隆位點，外源DNA插入后使相應(yīng)的抗性基因失活，宿主細胞失去相應(yīng)的抗藥性，不能在含相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基中生長，這一現(xiàn)象稱為插入失活。pBR322質(zhì)粒有兩個抗藥性基因，140質(zhì)粒pBR322的抗性基因篩選示意圖質(zhì)粒pBR322的抗性基因篩選示意圖1414、表達載體（expressingvector）（1）表達載體的功能：在受體細胞中表達外源基因的載體

結(jié)構(gòu)：克隆載體+表達構(gòu)件—原核生物表達真核生物表達

oriampr基礎(chǔ)上加轉(zhuǎn)錄和翻譯相關(guān)elementMCS

（2）原核（大腸桿菌）表達載體表達載體=克隆載體+表達元件“啟動子—核糖體結(jié)合位點—克隆位點—轉(zhuǎn)錄終止信號”

“P—RBS—MCS—term”4、表達載體（expressingvector）（1）表達142原核表達載體結(jié)構(gòu)示意圖用T7表達系統(tǒng)質(zhì)粒的基本結(jié)構(gòu)元件原核表達載體結(jié)構(gòu)示意圖用T7表達系統(tǒng)質(zhì)粒的基本結(jié)構(gòu)元件143

(3)哺乳動物表達載體（1）病毒載體整合性載體：外源基因通過這種載體與宿主細胞的染色體整合。如pSV系列載體游離型載體：外源基因與這種載體重組后，以病毒顆粒形式在宿主細胞內(nèi)自行復(fù)制或在輔助病毒存在下進行復(fù)制。如痘苗病毒、腺病毒、桿狀病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒等。（2）質(zhì)粒載體常常是穿梭質(zhì)粒載體。既含原核的復(fù)制位點和篩選標(biāo)記，又含真核的復(fù)制位點篩選標(biāo)記和表達構(gòu)件。(3)哺乳動物表達載體（1）病毒載體1441.直接從染色體DNA分離

如果物理圖譜已確定，可用限制酶直接從原核生物，噬菌體及動物病毒基因組切取目的基因。（二）目的基因的來源（Isolation）1.直接從染色體DNA分離如果物理圖譜已確定，1452.化學(xué)合成要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列

基因小2.化學(xué)合成要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸1463.從cDNA文庫（cDNA文庫）篩選目的基因

將不同細胞類型或不同階段細胞的mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后,將所有cDNA混合體與載體進行連接后，將所有的重組體分子都引入宿主細胞并進行擴增，所得到的分子克隆的混合體稱為cDNA文庫。

3.從cDNA文庫（cDNA文庫）篩選目的基因147mRNAcDNA雙鏈cDNA重組DNA分子cDNA文庫反轉(zhuǎn)錄酶載體受體菌復(fù)制*從cDNA文庫獲取目的基因逆轉(zhuǎn)錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTTmRNAcDNA雙鏈cDNA重組DNA分子148

4.從基因組文庫（genomiclibrary）篩選目的基因

采用限制酶將基因組DNA切成片段，每一個DNA片段都與一個載體分子拼接成重組DNA，然后將所有的重組體都引入宿主細胞并進行擴增，得到的分子克隆的混合體稱為“基因組文庫”。從基因組文庫中通過雜交篩選得到目的基因片段。從細胞中分離基因組DNA、用Sau3A或MboI部分消化、回收大小在一定范圍內(nèi)的片段、構(gòu)建重組體。4.從基因組文庫（genomiclibrary）篩選目149組織或細胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫：存在于轉(zhuǎn)化細胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合*從基因組DNA文庫獲取目的基因組織或細胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分1505.PCR或RT-PCR

根據(jù)目的基因的核苷酸序列設(shè)計一對引物以基因組DNA為模板經(jīng)PCR擴增目的基因。以mRNA或RNA為模板經(jīng)RT-PCR擴增目的基因。5.PCR或RT-PCR151（三）限制酶的應(yīng)用

限制酶(restrictionenzyme):一類專門切割DNA的酶。是一類能識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并與其特異結(jié)合，并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類核酸內(nèi)切酶。

“Restrictionendonucleasesarebacteriaenzymewhichcut(hydrolyze)DNAintodefinedandreproduciblefragments.Inbacteriatheyformpartoftherestriction—modificationdefensemechanismagainstforeignDNA.Theyarebasicgenecloningtools.”

1.定義：（三）限制酶的應(yīng)用1.定義：1522.限制酶的識別和切割位點識別：

4～6堿基對，多具有回文結(jié)構(gòu)（palindrom），少數(shù)識別長序列為8個或8個以上堿基對，有的存在簡并序列（有的核苷酸位點可以不同）。Sau3AI

EcoRI

PstⅠSmaⅠ5′GATCGAATTCCTGCAGCCCGGG3′3′CTAGCTTAAGGACGTCGGGCCC5′

簡并序列：GTYRAC——Y=C/TR=G/AYR=CG/CA/TG/TA∴HindⅡ可識別4個特定序列

2.限制酶的識別和切割位點識別：4～6堿基對，多具有回文1533.限制酶的切割方式(1)識別序列內(nèi)兩條鏈上交錯切割，產(chǎn)生單鏈突出的粘性末端(2)對稱處同時切斷DNA的兩條鏈，產(chǎn)生平端DNA片段3.限制酶的切割方式(1)識別序列內(nèi)兩條鏈上交錯切割，產(chǎn)生單1544.限制酶的切割結(jié)果切割的結(jié)果：產(chǎn)生三種不同的末端平末端—bluntend5’突出—5’-protruding（cohesiveend）3’突出—3’-protruding（overhangtail）切割的化學(xué)本質(zhì)：磷酸二酯鍵的斷裂,形成含5’—P和3’—OH末端的兩個DNA片段。對一特定的DNA而言，識別序列堿基對少的，則切點數(shù)多，產(chǎn)生的片段小。4.限制酶的切割結(jié)果切割的結(jié)果：產(chǎn)生三種不同的末端155第十九章藥物研究的生物化學(xué)基礎(chǔ)課件156(四)重組體的構(gòu)建1.粘性末端連接：用同一種酶裂解后，產(chǎn)生相同的粘性末端，很容易按照堿基配對的原則以氫鍵結(jié)合，在T4DNA連接酶的作用下，共價閉合。

連接方式：

定向取代

雙向插入（正向/反向）（雙酶切）（單酶切）措施：載體酶切后，用AP（堿性磷酸酶）水解5’端的磷酸基團防止載體的自身環(huán)化。(四)重組體的構(gòu)建1.粘性末端連接：用157

同一種限制酶切割DNA產(chǎn)生的粘性末端的連接

G

G

A

T

C

CC

C

T

A

G

GBamHⅠ的識別序列及切割部位G

G

A

T

C

CC

C

T

A

G

GBamHⅠ含目的基因的DNA片段BamHⅠGC

C

T

A

G5'3'5'3'3'5'5'3'5'3'5'3'G

G

A

T

C

CC

C

T

A

G

G

G

A

T

C

C

G目的基因片段混合、退火G

C

C

T

A

G

G

A

T

C

C

G

G

A

T

C

C

GG

C

C

T

A

G質(zhì)粒載體含目的基因的重組質(zhì)粒G

C

C

T

A

G

G

A

T

C

C

GDNA連接酶同一種限制酶切割DNA產(chǎn)生的粘性末端的連接GGAT158雙酶切DNA片段粘性末端的連接

G

G

A

T

C

CC

C

T

A

G

GBamHⅠBamHⅠBamHⅠG

C

C

T

A

G5'3'5'3'5'5'5'3'5'3'3'G

A

A

T

T

CC

T

T

A

A

G

A

A

T

T

C

G目的基因片段混合、退火G

C

T

T

A

A

G

A

T

C

C

G

A

A

T

T

C

GG

C

C

T

A

G重組質(zhì)粒DNA連接酶EcoRIEco

RI5'

G

A

T

C

C

G

G

C

T

T

A

A

A

A

T

T

C

G

G

C

C

T

A

G

G

A

T

C

C

G

G

C

T

T

A

AEcoRI

GATCC