眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件

眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法1眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法HE染色視網(wǎng)膜血管ADP酶染色視網(wǎng)膜血管FC染色,免疫組織化學(xué)染色尼氏染色RT-PCRwestern-blotunnel染色法elisa眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法2HE染色HE制作的全過程包括組織固定、取材、脫水、包埋、修整蠟塊、切片、貼片、烤片、去蠟、加水、蘇木素染色返藍(lán)、伊紅染色、脫水、透等十多個(gè)步驟,每一步都必須仔細(xì)操作,即每一環(huán)節(jié)都必須高度重視,才能制作出高質(zhì)量的HE染色切片,就每個(gè)環(huán)節(jié)應(yīng)注意的問題闡述于下HE染色3(1)組織固定固定一定要及時(shí),組織離體3n內(nèi)必須固定,且越新鮮固定越好,涂片、刷片印片等尤其如此。配制固定液時(shí),稱藥要準(zhǔn)確,pH值調(diào)節(jié)要適當(dāng),固定液的選擇與濃度的配制均要做好:固定液的用量以多于組織體積的5-10倍組織固定為宜。盛固定液的容器,瓶口要大,以防人為的擠壓。由于10%福爾馬林的組織滲透力約為每小時(shí)1mm,滲入組織的深度約為2-3mm故大標(biāo)本要求正中先切開(如肝肺則最好用支氣管灌注10%福爾馬林后再浸入固定液內(nèi)、腦及眼球應(yīng)用懸吊法固定。(1)組織固定固定一定要及時(shí),組織離體34(2)取材大小1.5×1.53cm,厚度不宜超過0.5cm,取材整齊平整、切成方形、圓形或矩形,不要切成三角形要選取具有代表性的病變組織。內(nèi)窺鏡活檢、診斷性刮宮等碎組織要用紗布包好,再用大頭針扎緊后取材刪水固定3)脫水利用梯度酒精逐步脫水,適當(dāng)掌握其濃度與脫水的時(shí)間。加溫脫水可使組織固縮,以室溫脫水為佳;只有脫水徹底,組織才能透明充分,有利于石蠟的滲入。脫水劑要定期更換,組織塊的周圍脂肪組織不宜過多,否則將引起脫水不良,難以切片。(2)取材大小1.5×1.55透明浸蠟4)透明一殺同二甲本,小塊組織5)浸先放入熔點(diǎn)低(54-56℃),后浸入熔大埃組織1h即可,透的時(shí)間過長,組織容易變硬、變底點(diǎn)高的(58-60℃)石;浸蠟的變應(yīng)高于所石蠟切不成片,甚至一切就成驗(yàn)宋狀,故要恰當(dāng)?shù)爻Ｒ窘M織塊的透明度,王誼,制透明的時(shí)間。大塊組織2-3h,溫度過高或時(shí)間過長均可使組織收縮、變榎、變脆、切不成片,如能采用飫壓真空方法,則浸蜻的時(shí)間可以適當(dāng)?shù)乜s短透明浸蠟6(6)包埋石蠟包埋的溫度可以比浸蠟的溫度高5℃,但動(dòng)作要快,須將組織塊放平整,尤其是兩塊以上的小組織或多塊小組織應(yīng)仔細(xì)地包埋成條直線與包埋框橫軸平行,這樣既有利于防止病理醫(yī)師診斷時(shí)不小心漏掉一塊小組織同時(shí)也有利于包埋完整地切片,形成蠟帶;更要注意包埋面的解剖組織學(xué)關(guān)系,凡分層次的組織,層次表面應(yīng)向下放平皮膚可將表皮放在上端,應(yīng)保證各層組織結(jié)構(gòu)都能被觀察到:如果包埋面的方向有錯(cuò)誤,在鏡下就無法觀察到全層的組織結(jié)構(gòu),則必然會(huì)造成診斷上的困難。(6)包埋石蠟包埋的溫度可以比浸蠟的溫度高7修整蠟塊切片(8)切片須備有一臺(tái)優(yōu)質(zhì)的切片機(jī),切片時(shí),把固定蠟塊的各個(gè)螺絲旋紊,刀要快,可定期更新一次性刀片,須無缺口,切3(7)修整蠟塊包坦的蠟塊,在冷卻后應(yīng)5μm厚。組織的長軸應(yīng)與切片刀平行,切進(jìn)行修整,組織塊周國的蠟邊不宜太寬,只片刀應(yīng)先從刀的一端使用,角度4-6需留下約2mm的空間,以免貼片時(shí)不易祓角度太大會(huì)將切片刮碎,過小則切不到紐織切片時(shí)將組織切齊全,要求厚灣均勻且形成蠟情,避免人為損害。蠟塊內(nèi)的被膜應(yīng)放上端,組織的臟層應(yīng)朝下;淋巴瘤或細(xì)菌染色宣澎切,觀察鐙神經(jīng)軸索則可切厚些修整蠟塊切片8烤片脫蠟、水化,蘇木素染色(11)脫蠟、水化,蘇木素染色染色前,切片須經(jīng)過兩次二甲苯脫蠟,務(wù)求將10)烤片烤片時(shí)溫度的控制與時(shí)間石蠟脫盡,再經(jīng)梯度酒精脫苯,最后至水的把握最為重要,溫度過高,組織與紐胞再入蘇木素液染色。該染液的配置要準(zhǔn)確會(huì)出現(xiàn)龜裂;溫度過低或烤片時(shí)間不足染色時(shí)間的控制應(yīng)依據(jù)蘇木素的配方、染切下的組織塊容易脫落,一般65℃烤2洨的新舊、季節(jié)、室溫等多種因素綜合考0-30min,可防止上述現(xiàn)象慮,一般情況下染5-15min;冬天室溫過低蘇木素的鉀明礬容易析出,影響染色效果,可加溫染液烤片脫蠟、水化,蘇木素染色9》(12)鹽酸分化染蘇木素后,除胞核著色外胞漿,間質(zhì)等也不同程度被染上了淡蘭色。分化的日的是讓應(yīng)著色的細(xì)胞核更加清晰,使不應(yīng)著色的部分,盡可能褪盡。分化的時(shí)間要看分化液的濃度溶液的新舊,組織本身的特性,切片的厚薄及要求著色的深淺等因素酌情來定,最好是在顯微鏡觀察鹽酸分化下控制,一般分化數(shù)秒至30s。分化后的切片應(yīng)立即入水中沖洗,讓組織堿化,使胞核返蘭。應(yīng)注意的是:①入水動(dòng)作要輕;②用細(xì)流水沖洗,請(qǐng)勿直接對(duì)著切片沖洗,以免脫片。③堿化采用自來水或溫水(30-40℃),讓其自然返蘭并洗凈殘留的鹽酸,有利于切片的長期保存。如果用碳酸鋰氨水等弱堿來返蘭,切片則較易褪色。》(12)鹽酸分化染蘇木素后,除胞核著色外10眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件11眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件12眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件13眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件14眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件15眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件16眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件17眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件18眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件19眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件20眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件21眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件22眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件23眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件24眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件25眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件26眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件27眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件28眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件29眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件30眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件31眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件32眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件33眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件34眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件35眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件36眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件37眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件38眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件39眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件40眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件41眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件42眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件43眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件44眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件45眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件46眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件47眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件48眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件49眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件50眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件51眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件52眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件53眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件54眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件55眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件56眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件57眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件58眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件59眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件60眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件61眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法62眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法HE染色視網(wǎng)膜血管ADP酶染色視網(wǎng)膜血管FC染色,免疫組織化學(xué)染色尼氏染色RT-PCRwestern-blotunnel染色法elisa眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法63HE染色HE制作的全過程包括組織固定、取材、脫水、包埋、修整蠟塊、切片、貼片、烤片、去蠟、加水、蘇木素染色返藍(lán)、伊紅染色、脫水、透等十多個(gè)步驟,每一步都必須仔細(xì)操作,即每一環(huán)節(jié)都必須高度重視,才能制作出高質(zhì)量的HE染色切片,就每個(gè)環(huán)節(jié)應(yīng)注意的問題闡述于下HE染色64(1)組織固定固定一定要及時(shí),組織離體3n內(nèi)必須固定,且越新鮮固定越好,涂片、刷片印片等尤其如此。配制固定液時(shí),稱藥要準(zhǔn)確,pH值調(diào)節(jié)要適當(dāng),固定液的選擇與濃度的配制均要做好:固定液的用量以多于組織體積的5-10倍組織固定為宜。盛固定液的容器,瓶口要大,以防人為的擠壓。由于10%福爾馬林的組織滲透力約為每小時(shí)1mm,滲入組織的深度約為2-3mm故大標(biāo)本要求正中先切開(如肝肺則最好用支氣管灌注10%福爾馬林后再浸入固定液內(nèi)、腦及眼球應(yīng)用懸吊法固定。(1)組織固定固定一定要及時(shí),組織離體365(2)取材大小1.5×1.53cm,厚度不宜超過0.5cm,取材整齊平整、切成方形、圓形或矩形,不要切成三角形要選取具有代表性的病變組織。內(nèi)窺鏡活檢、診斷性刮宮等碎組織要用紗布包好,再用大頭針扎緊后取材刪水固定3)脫水利用梯度酒精逐步脫水,適當(dāng)掌握其濃度與脫水的時(shí)間。加溫脫水可使組織固縮,以室溫脫水為佳;只有脫水徹底,組織才能透明充分,有利于石蠟的滲入。脫水劑要定期更換,組織塊的周圍脂肪組織不宜過多,否則將引起脫水不良,難以切片。(2)取材大小1.5×1.566透明浸蠟4)透明一殺同二甲本,小塊組織5)浸先放入熔點(diǎn)低(54-56℃),后浸入熔大埃組織1h即可,透的時(shí)間過長,組織容易變硬、變底點(diǎn)高的(58-60℃)石;浸蠟的變應(yīng)高于所石蠟切不成片,甚至一切就成驗(yàn)宋狀,故要恰當(dāng)?shù)爻Ｒ窘M織塊的透明度,王誼,制透明的時(shí)間。大塊組織2-3h,溫度過高或時(shí)間過長均可使組織收縮、變榎、變脆、切不成片,如能采用飫壓真空方法,則浸蜻的時(shí)間可以適當(dāng)?shù)乜s短透明浸蠟67(6)包埋石蠟包埋的溫度可以比浸蠟的溫度高5℃,但動(dòng)作要快,須將組織塊放平整,尤其是兩塊以上的小組織或多塊小組織應(yīng)仔細(xì)地包埋成條直線與包埋框橫軸平行,這樣既有利于防止病理醫(yī)師診斷時(shí)不小心漏掉一塊小組織同時(shí)也有利于包埋完整地切片,形成蠟帶;更要注意包埋面的解剖組織學(xué)關(guān)系,凡分層次的組織,層次表面應(yīng)向下放平皮膚可將表皮放在上端,應(yīng)保證各層組織結(jié)構(gòu)都能被觀察到:如果包埋面的方向有錯(cuò)誤,在鏡下就無法觀察到全層的組織結(jié)構(gòu),則必然會(huì)造成診斷上的困難。(6)包埋石蠟包埋的溫度可以比浸蠟的溫度高68修整蠟塊切片(8)切片須備有一臺(tái)優(yōu)質(zhì)的切片機(jī),切片時(shí),把固定蠟塊的各個(gè)螺絲旋紊,刀要快,可定期更新一次性刀片,須無缺口,切3(7)修整蠟塊包坦的蠟塊,在冷卻后應(yīng)5μm厚。組織的長軸應(yīng)與切片刀平行,切進(jìn)行修整,組織塊周國的蠟邊不宜太寬,只片刀應(yīng)先從刀的一端使用,角度4-6需留下約2mm的空間,以免貼片時(shí)不易祓角度太大會(huì)將切片刮碎,過小則切不到紐織切片時(shí)將組織切齊全,要求厚灣均勻且形成蠟情,避免人為損害。蠟塊內(nèi)的被膜應(yīng)放上端,組織的臟層應(yīng)朝下;淋巴瘤或細(xì)菌染色宣澎切,觀察鐙神經(jīng)軸索則可切厚些修整蠟塊切片69烤片脫蠟、水化,蘇木素染色(11)脫蠟、水化,蘇木素染色染色前,切片須經(jīng)過兩次二甲苯脫蠟,務(wù)求將10)烤片烤片時(shí)溫度的控制與時(shí)間石蠟脫盡,再經(jīng)梯度酒精脫苯,最后至水的把握最為重要,溫度過高,組織與紐胞再入蘇木素液染色。該染液的配置要準(zhǔn)確會(huì)出現(xiàn)龜裂;溫度過低或烤片時(shí)間不足染色時(shí)間的控制應(yīng)依據(jù)蘇木素的配方、染切下的組織塊容易脫落,一般65℃烤2洨的新舊、季節(jié)、室溫等多種因素綜合考0-30min,可防止上述現(xiàn)象慮,一般情況下染5-15min;冬天室溫過低蘇木素的鉀明礬容易析出,影響染色效果,可加溫染液烤片脫蠟、水化,蘇木素染色70》(12)鹽酸分化染蘇木素后,除胞核著色外胞漿,間質(zhì)等也不同程度被染上了淡蘭色。分化的日的是讓應(yīng)著色的細(xì)胞核更加清晰,使不應(yīng)著色的部分,盡可能褪盡。分化的時(shí)間要看分化液的濃度溶液的新舊,組織本身的特性,切片的厚薄及要求著色的深淺等因素酌情來定,最好是在顯微鏡觀察鹽酸分化下控制,一般分化數(shù)秒至30s。分化后的切片應(yīng)立即入水中沖洗,讓組織堿化,使胞核返蘭。應(yīng)注意的是:①入水動(dòng)作要輕;②用細(xì)流水沖洗,請(qǐng)勿直接對(duì)著切片沖洗,以免脫片。③堿化采用自來水或溫水(30-40℃),讓其自然返蘭并洗凈殘留的鹽酸,有利于切片的長期保存。如果用碳酸鋰氨水等弱堿來返蘭,切片則較易褪色。》(12)鹽酸分化染蘇木素后,除胞核著色外71眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件72眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件73眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件74眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件75眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件76眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件77眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件78眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件79眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件80眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件81眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件82眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件83眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件84眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件85眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件86眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件87眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件88眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件89眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件90眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件91眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件92眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件93眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件94眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件95眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件96眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件97眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件98眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件99眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件100眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件101眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件102眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件103眼科學(xué)常見實(shí)驗(yàn)方法課件104