siRNA序列搜索課件

siRNA序列搜索RNAi實驗所需的4大要素對應(yīng)目標(biāo)基因的dsRNA(siRNA,長dsRNA，shRNA載體,看實驗需要）；適合的轉(zhuǎn)染或者其他將dsRNA遞送進入細胞的方法；適當(dāng)?shù)膶φ?；檢測目標(biāo)基因表達情況的方法！??！注意：shRNA表達水平未必是越高越好，過表達也有潛在可能導(dǎo)致細胞毒性或者脫靶。三條路線線路1和2均為誘發(fā)瞬時基因沉默，持續(xù)時間約3－7天，根據(jù)目標(biāo)基因而異，shRNA表達載體則可以建立長效基因沉默的細胞株，進行功能缺失基因組篩選研究，也可用于體內(nèi)RNAi研究。線路1，藍色：非哺乳動物細胞中，直接向細胞導(dǎo)入長雙鏈RNA(dsRNA)線路2，紅色：哺乳動物細胞中，直接將siRNAs轉(zhuǎn)入哺乳動物細胞線路3，黃色：將短發(fā)夾結(jié)構(gòu)shRNA的DNA表達載體轉(zhuǎn)入細胞siRNA的研究結(jié)論1研究發(fā)現(xiàn)：21-23bp的短dsRNA介導(dǎo)的RNAi效率最高；小于21bp或者25bp的短鏈RNA效率較低；大于30bp的RNA足以引起干擾素樣反應(yīng)。3’端突出對于RNaseⅢ識別siRNA過程十分關(guān)鍵。siRNA末端的3’的3’-UU突出或3’-TT均可增加siRNA的穩(wěn)定性，但其它序列未被證明有這樣的作用。siRNA的研究結(jié)論2使用化學(xué)修飾的siRNA介導(dǎo)的RNAi實驗顯示，正義鏈的微小修飾如標(biāo)記熒光探針一般不會影響siRNA的作用效果，但是反義鏈的微小變化卻能降低siRNA的活性。（Chiu和Rana，2002）。如果siRNA反義鏈的3’-OH標(biāo)記有一個龐大的FITC熒光基團，siRNA的活性常常會大打折扣。siRNA的研究結(jié)論3siRNA的5’-端而不是3’-端的完整性對RNAi十分重要。所以，在解鏈過程中，siRNA識別具有非對稱性特征。（Chiu和Rana，2003）。5-末端’的前十個核苷酸的錯配對RNAi效應(yīng)的影響較大。而siRNA序列3’-端的錯配對siRNA活性影響卻小的多。此外，5’-端堿基配對的低穩(wěn)定性對反義鏈尤為重要，但對正義鏈的影響不明顯。siRNA的研究結(jié)論4與siRNA的反義鏈相似，正義鏈也可導(dǎo)致非特異性的基因沉默，這些基因至少含有11個與siRNA同源的連續(xù)核苷酸，這種沉默作用被稱為脫靶效應(yīng)（off-targeteffect）。通過Smith-Waterman或BLAST搜索可能的靶點，并評價反義序列的特異性，或參考Zamore（Schwarzetal，2003）和Khvorova（Khvor-ova等2003；Reynolds等，2004）提出的新設(shè)計原則，我們可以盡量避免脫靶效應(yīng)。此外，我們還可以設(shè)計不對稱的siRNA，使得僅僅反義鏈可以進入RNAi通路。siRNA的研究結(jié)論6進一步研究表明，是siRNA的每條鏈的第2-4個位位置上的單個核苷酸的錯配而不是siRNA鏈的G-U擺動影響了siRNA摻入到RISC這一過程。siRNA設(shè)計N21序列的最后兩個核苷酸被替換成TT來輔助合成。合成的siRNA反義鏈與23nt核苷酸的1～21位堿基互補。由于23nt的第1個核苷酸對于沉默作用并不是必須的，siRNA反義鏈的3’-核苷酸可以換成3’-T。但是23nt的第2個核苷酸應(yīng)該始終與靶序列互補。siRNA選擇標(biāo)準(zhǔn)三、設(shè)計合適的對照siRNA——確保數(shù)據(jù)的有效性陰性對照siRNA：與所選的siRNA核酸組成相同，但與其他基因相比缺乏顯著的同源序列。打亂所選的基因特異性siRNA的核酸序列，并進行搜索使其與其他基因無同源性。針對相同基因的其他siRNA：也許是確保siRNA數(shù)據(jù)的可靠性的最佳途徑。siRNAOligo設(shè)計原則

1．

希望軟件可以在web上使用。即用戶可以訪問我們的網(wǎng)站，輸入基因代碼，即可自行在網(wǎng)上設(shè)計siRNAOligo。2．

可參照的軟件形式：見如下網(wǎng)站：

3．

希望能就每一個所指定的基因找到至少四對以上可合成的雙鏈RNA

oligo。4．

軟件設(shè)計中的幾個關(guān)鍵步驟如下：A．進入GeneBank調(diào)出指定基因序列；B．根據(jù)特定的一些規(guī)則選出一個基因片段；C．再根據(jù)一些規(guī)則寫出正義和反義兩段各21個堿基的序列；D．最后通過反轉(zhuǎn)，替代，空格得出最后結(jié)果。具體設(shè)計原則1．

在所選基因的啟動子100個堿基以后開始自5’-端開始2．

尋找基因序列中的23個堿基，最好是5‘-

AA（N19）TT-3’

（N是任何堿基）3．

如果找不到以上AA（N19）TT，則用AA（N21）補足。4．

如果找不到以上AA（N21），則用NA（N21）補足。5．

所選定序列中，G和C的數(shù)目的總和在總數(shù)（23）的35-55%.6．

滿足以上1-5項要求的片段數(shù)目如果不足四個，將G和C的數(shù)目的總和放寬至總數(shù)（23）的30-70%.7．

選好上述序列后，以此確定所需合成雙鏈RNA

oligo的序列如下：8．

正義序列（N19）TT與上述選定的23個堿基序列中的第3-23個堿基相同9．

反義序列的3’----5’的序列與目標(biāo)序列中的第1-21個堿基互補，即A變成T，C變成G，T變成A，G變成C。10．將反義序列3’----5’改寫成5’----3’.11．將最后所得序列中除3’-末端的兩個堿基之外的所有堿基中的T都用U來替代。最后每三個組成一個字節(jié)，中間斷開。12．將所選定的正義序列和反義序列與gene

bank中已知同物種的基因序列進行比較，確定其唯一性（BLAST）具體設(shè)計原則13．上述7-10項可見如下例子：假如通過1-5項的條件選出的一段23個堿基的序列是5’-

AAGCTAGTCATGGCCATTGACTT

-3’正義序列就應(yīng)該是：

5’-

GCTAGTCATGGCCATTGACTT

-3’反義序列就應(yīng)該是:

3’-

TTCGATCAGTACCGGTAACTG

-5’反轉(zhuǎn)處理后即得：正義序列：

5’-

GCTAGTCATGGCCATTGACTT

-3’反義序列：

5’-

GTCAATGGCCATGACTAGCTT

-3’U替代T以后得到：正義序列：

5’-

GCUAGUCAUGGCCAUUGACTT

-3’反義序列：

5’-

GUCAAUGGCCAUGACUAGCTT

-3’段開字節(jié)后最后得到：正義序列：

5’-

GCU

AGU

CAU

GGC

CAU

UGA

CTT

-3’反義序列：

5’-

GUC

AAU

GGC

CAU

GAC

UAG

CTT

-3’“Tuschl”法則Tuschl提出21bp、3’末端帶有2個堿基突出的siRNA（正符合Dicer酶切產(chǎn)物的特征）最有效?！镄隆癟uschl”法則最新一個公布的算法，推薦序列是（N4）A（N6）T（N2）H（N5）W（N2）

N代表任意核苷酸，H不為G，W為A而不是G或C。siRNA序列選擇標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)ⅠG/C含量=30～52%標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ在第15～19位核苷酸的位置上有3個或更多的A/U堿基對（正義鏈）標(biāo)準(zhǔn)Ⅲ發(fā)夾結(jié)構(gòu)預(yù)測（沒有內(nèi)部重復(fù)序列或回文結(jié)構(gòu)）Tm<20℃標(biāo)準(zhǔn)Ⅳ19位核苷酸為A（正義鏈）標(biāo)準(zhǔn)Ⅴ3位核苷酸為A（正義鏈）標(biāo)準(zhǔn)Ⅵ10位核苷酸為U（正義鏈）siRNA序列選擇標(biāo)準(zhǔn)避免多個堿基的重復(fù)序列，如超過3個鳥嘌呤或包嘧啶以及4個腺嘌呤核苷酸組成的序列。注意?。?！多聚鳥嘌呤和多聚包嘧啶核苷酸形成的大互補區(qū)可能會干預(yù)siRNA的沉默機制；而多聚腺嘌呤通過提前終止轉(zhuǎn)錄從而干擾shRNA合成。siRNA序列選擇標(biāo)準(zhǔn)避免選擇5’-UTR區(qū)的序列，因為這個區(qū)域的序列包含有阻止靶向識別的蛋白質(zhì)結(jié)合位點，至少要從AUG啟動子的第100個核苷酸開始搜索。3’-端可以是合適的靶序列，可特異性防止非必要保守基因的沉默。構(gòu)建shRNA表達載體shRNA設(shè)計，DNAOligo合成，克隆shRNA片段到適當(dāng)?shù)妮d體，篩選正確的重組子，測序驗證，最后才是shRNA載體轉(zhuǎn)染細胞，檢測結(jié)果。shRNA序列設(shè)計啟動子的選擇載體類型的選擇抗生素篩選標(biāo)記構(gòu)建、克隆和測序驗病毒表達載體病毒感染細胞的效率遠遠高于任何轉(zhuǎn)染試劑，對付那些難轉(zhuǎn)染的細胞系，原代細胞，徹底分化的靜止細胞等，病毒載體是除電轉(zhuǎn)之外的另一個選擇，病毒載體也是動物活體內(nèi)表達shRNA的手段之一。目前最常用的哺乳動物細胞病毒載體包括：逆轉(zhuǎn)錄病毒(Retrovirus)，腺病毒(Adenovirus)，腺相關(guān)病毒(Adeno-AssociatedVirus,AAV)，和慢病毒(Lentivirus)。其中逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒等載體還可以用于構(gòu)建整合到染色體上的穩(wěn)定的長期基因沉默細胞株。病毒表達載體在幾個病毒體系中，以慢病毒和腺病毒載體最有代表性。慢病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，具有逆轉(zhuǎn)錄病毒的幾乎全部優(yōu)點，可以整合到染色體穩(wěn)定表達，也可以感染包括靜止期細胞在內(nèi)的各種細胞，更優(yōu)于傳統(tǒng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒。而腺病毒則以游離染色體外做瞬時表達而見長。想要建立長期穩(wěn)定的shRNA表達細胞株，研究長期基因沉默，逆轉(zhuǎn)錄病毒是更適合的選擇?！锫《緎hRNA載體慢病毒Lentivirus是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，可整合到染色體上，也很少引發(fā)干擾素響應(yīng)，經(jīng)過改造后，可以感染幾乎任何一種細胞，包括靜止期的細胞如神經(jīng)細胞，因而兼具前面幾種病毒載體的優(yōu)勢，優(yōu)于傳統(tǒng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒。慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率一般90%以上，可以高達100%。不過也要留意染色體上隨機插入整合可能導(dǎo)致沉默效果的差異，也可能導(dǎo)致非預(yù)期的結(jié)果。

shRNA(shorthairpinRNA)

shRNA由siRNA和環(huán)狀連接序列組成。就是目標(biāo)siRNA與其反向互補序列之間由特定的連接序列間隔，得到的RNA兩端反向互補退火，與連接序列形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，類似發(fā)夾。攜帶目標(biāo)基因shRNA的表達載體轉(zhuǎn)染或者轉(zhuǎn)導(dǎo)到目標(biāo)細胞中，載體表達shRNA并被Dicer酶切割為siRNA，就可以引發(fā)目標(biāo)基因的沉默。microRNA在自然界的RNAi通路中，microRNA才是真正的主角。這種內(nèi)源性的非編碼區(qū)小分子RNA針對3’端非編碼區(qū)，有著極高的保守性，并在組織中廣泛表達，可在轉(zhuǎn)錄后以及翻譯水平上調(diào)控基因表達，可能在不影響mRNA的水平下調(diào)控基因表達。

★miRNA與siRNA的區(qū)別內(nèi)源而非外源序列針對非編碼區(qū)物種進化極為高度保守組織中廣泛表達miRNA可能調(diào)控多種關(guān)鍵基因可在轉(zhuǎn)錄后以及翻譯水平上調(diào)控基因表達，可能在不影響mRNA的水平下調(diào)控基因表達shRNA的免費設(shè)計工具Genelink公司shRNADesignersiSearchNCBIshRNA資源庫:

設(shè)置好參照未轉(zhuǎn)染細胞對照：不加轉(zhuǎn)染試劑的空白對照，用于排除轉(zhuǎn)染試劑對細胞活力的影響（這個可以在摸轉(zhuǎn)染條件時先做）空白對照：只加轉(zhuǎn)染試劑(如果實驗用到載體則可做一組空載體對照)，用于排除siRNA轉(zhuǎn)染對細胞活力的影響負對照：設(shè)置不針對目標(biāo)細胞內(nèi)源任何基因的siRNA對照，用以排除轉(zhuǎn)染siRNA對基因表達可能造成的任何非特異影響。正對照：設(shè)置針對易于檢測的參照基因的siRNAs，用于確證siRNAs的遞送、轉(zhuǎn)染以及反應(yīng)條件環(huán)境是可行的。也有建議選擇和目標(biāo)基因同一信號通路的另一個基因作為參照，便于排除脫靶等副反應(yīng)，以及進一步確認目標(biāo)基因的功能。SchematicofaTypicalHairpinsiRNA

theloopformedby“UUCAAGAGA”seemstohaveahigherefficiencythanloopsformedbyothersequencesInsertDesignforpSilencer1.0-U6.ThisinsertisspecificforthepSilencer1.0-U6Vectorandcontainstheappropriate3'overhangsfordirectionalcloningintothisvector.Theloopsequenceandlengthcanbevariedasdesired.ForcloningintothepSilencer1.0-U6vector,nucleotideoverhangstotheEcoRIandApaIrestrictionsitesareaddedtothe5'and3'endoftheDNAoligonucleotides,respectivelyInsertDesignforpSilencer2.0-U6andpSilencer3.0-H1.TheinsertdesignisspecificforthepSilencer2.0-U6,2.1-U6,3.0-H1and3.1-H1ExpressionVectorsandcontainstheappropriateoverhanging5'endsfordirectionalcloningintotheseplasmids.AswithpSilencer1.0-U6showninFigure2,earlyindicationssuggestthatagreatdealoflatitudeispossibleinthedesignoftheloop;hereweprovideoneloopsequencethatwefindworkswell.siRNA設(shè)計軟件

（跟blast不同算法）

(港大)

（友好，文獻支持，可視性強）

（whitehouse,多人贊）

...2/index.php?type=fc

（避免offtarget效應(yīng)在BLAST方面，siDIRECT有獨到之處）

（ambion公司，簡單，有blast鏈接）

公司

RationalsiRNADesign

（excel做的siRNA設(shè)計模板）

★如何維持實驗室無RNase污染經(jīng)常定期處理各種表面，防止RNase污染實驗全程戴手套，一旦手套觸及其他表面立即更換加樣槍專用選擇無RNase污染的指管槍頭和試劑減少RNA實驗區(qū)通風(fēng)或者空氣流動?！鳵NA聚合酶III啟動子多數(shù)siRNA表達載體依賴三種RNA聚合酶III啟動子(polIII)中的一種，操縱一段小的發(fā)夾RNA在哺乳動物細胞中的表達。這三類啟動子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6啟動子和人H1啟動子。之所以采用RNApolIII啟動子是由于它可以在哺乳動物細胞中表達更多的小分子RNA，而且它是通過添加一串（3到6個）U來終止轉(zhuǎn)錄的。使用這類載體，需要2段編碼短發(fā)夾RNA序列的DNA單鏈，退火，克隆到相應(yīng)載體的polIII啟動子下游。這個過程需要較長時間，也需要經(jīng)過測序以保證克隆的序列是正確的。

◆啟動子的選擇shRNA的表達產(chǎn)量取決于啟動子的強弱U6啟動子比H1強，而且表達持續(xù)時間較長，是多數(shù)人的首選。除此之外，RNA聚合酶II類的啟動子如CMV啟動子和U1啟動子也比較常見。當(dāng)你的shRNA序列有連續(xù)的U/T

時應(yīng)該優(yōu)先考慮CMV啟動子載體。上述的啟動子都是組成型表達的啟動子，在人源，小鼠或者大鼠細胞中都能通用?！魡幼拥倪x擇選用U6啟動子載體時，設(shè)計shRNA要避免連續(xù)3個以上的U或者A，以防提前轉(zhuǎn)錄終止而得不到預(yù)期的shRNA。切記??！

含U6啟動子的表達框是由內(nèi)源性的U6啟動子和前27nt的核苷酸組成的嵌合體，即U6snRNA（U6+27）?！羁股睾Y選抗生素篩選本來不是必須的，有人甚至覺得會干擾細胞原有的表達模式。不過有抗生素篩選能得到穩(wěn)定表達shRNA的細胞株，便于長時間研究RNAi；而且可以有效避免未轉(zhuǎn)染細胞影響后繼的mRNA檢測?？股剡x擇的另外一個作用是促進shRNA表達，防止shRNA表達減弱而影響基因表達沉默的效果。所以，如果有，還是選一個抗性標(biāo)記比較好。實驗結(jié)果分析由于RNA干擾首先表現(xiàn)在mRNA水平降低，其次是蛋白質(zhì)水平的降低，然后才是表型或者功能的變化。所以最簡單通用的方法首先就是轉(zhuǎn)染后24-48小時做定量RT-PCR，檢測mRNA的水平。其次是通過WesternBlot或者免疫印跡，流式等方法檢測蛋白質(zhì)水平的下降。實驗結(jié)果分析由于和siRNA關(guān)系密切的microRNA可以在不影響mRNA水平的情況下在翻譯水平上抑制蛋白的表達，所以，在檢測mRNA水平之余，多數(shù)研究人員同意需要檢測蛋白質(zhì)水平的下降。如果你的siRNA實驗中檢測不到明顯的mRNA水平下降而又檢測到蛋白水平的下降，那么可以推測該siRNA以microRNA的作用方式調(diào)控蛋白表達。檢測mRNA水平要檢測mRNA水平，首先要純化細胞RNA。其次是做熒光定量RT-PCR。