醫(yī)療器械無菌和初始污染菌檢驗技術(shù)課件

醫(yī)療器械無菌和初始污染菌檢驗技術(shù)國家食品藥品監(jiān)督管理局北京醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心醫(yī)療器械無菌和初始污染菌檢驗技術(shù)國家食品藥品監(jiān)督管理局1醫(yī)療器械無菌檢驗技術(shù)醫(yī)療器械無菌檢驗技術(shù)2什么是無菌檢查法？

用于檢查要求無菌的醫(yī)療器械是否無菌的一種方法。若供試品符合無菌檢查法的規(guī)定，僅表明了供試品在該檢驗條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染。

無菌試驗的目的：將醫(yī)療器械或其浸提液接種于培養(yǎng)基內(nèi)，以檢驗供試品是否有細菌和真菌污染。什么是無菌檢查法？用于檢3醫(yī)療器械無菌檢驗標準GB/T14233.2-2005醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗方法第2部分：生物學試驗方法2010年版《中國藥典》無菌檢查法醫(yī)療器械無菌檢驗標準GB/T14233.2-2005醫(yī)4醫(yī)療器械無菌試驗檢查要點指南（2010版）

無菌檢驗是無菌醫(yī)療器械產(chǎn)品生產(chǎn)控制過程中的一項重要內(nèi)容。其檢驗方法、檢驗結(jié)果判定及檢驗人員業(yè)務能力等因素直接影響產(chǎn)品的質(zhì)量和安全。作為無菌醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)，其無菌檢驗工作應由本企業(yè)獨立完成。并要求企業(yè)的檢驗人員能當場操作或口述無菌檢驗的過程。醫(yī)療器械無菌試驗檢查要點指南（2010版）無菌5滅菌:殺滅或除去特定環(huán)境或物品中一切微生物的過程。目前國際上規(guī)定，滅菌過程必須使滅菌物品污染的微生物存活率減少到10-6及以下。

微生物:必須用光學顯微鏡或電子顯微鏡才能觀察到的微小生物。微生物具有一定的形態(tài)與結(jié)構(gòu),并能在適宜的環(huán)境中迅速地生長和繁殖,如細菌、病毒、真菌等。無菌：是指某一物體或某一環(huán)境中不含有活的微生物。無菌技術(shù):是指在微生物試驗工作中，控制或防止各類微生物的污染及其干擾的一系列操作方法和有關(guān)措施，其中包括無菌環(huán)境設施、無菌試驗器材以及無菌操作。滅菌:殺滅或除去特定環(huán)境或物品中一切微生物的過程。目6無菌操作:是指在無菌環(huán)境條件下，在對無菌制品或無菌器械進行檢驗的過程中，能防止微生物污染與干擾的一種常規(guī)操作方法。培養(yǎng)條件：用于促進微生物發(fā)育、生長和繁殖的生長培養(yǎng)基和培養(yǎng)方式的組合。抑細菌/抑霉菌試驗：用選定的微生物來演示某些物質(zhì)的存在能夠抑制這些微生物的繁殖。培養(yǎng)基:是人工配制的生物營養(yǎng)物質(zhì)，即用人工的方法將多種物質(zhì)按各種微生物生長繁殖的需要配成的一種混合營養(yǎng)物。無菌操作:是指在無菌環(huán)境條件下，在對無菌制品或無菌器械進7促生長試驗：用于證明生長培養(yǎng)基能夠支持微生物生長的技術(shù)操作。

假陰性：實際陽性的無菌試驗結(jié)果被變成了陰性。假陽性：實際陰性的無菌試驗結(jié)果被變成了陽性。

需氧菌：在代謝中，有氧條件下才能生存的微生物。

厭氧菌：在代謝中，沒有氧的條件下才能生存的微生物。

無菌保證水平（SAL）:滅菌后產(chǎn)品上存在單個活微生物的概率。促生長試驗：用于證明生長培養(yǎng)基能夠支持微生物8

細菌：為單細胞微生物,其細胞分化不完善，無完整細胞核及核膜、核仁，直徑一般為1μm~10μm。

9

真菌：為多細胞或單細胞微生物，其細胞分化完善，有細胞核和各種細胞器，故易在體外生長繁殖，直徑一般為10μm~100μm。

10醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備

超凈工作臺醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備超凈工作臺11醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備恒溫培養(yǎng)箱（至少2臺）醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備恒溫培養(yǎng)箱（至少2臺）12醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備壓力蒸汽滅菌器醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備壓力蒸汽滅菌器13醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備電熱干燥箱醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備電熱干燥箱14醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備集菌儀醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備集菌儀15醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備生物安全柜:（從試驗安全性考慮，建議陽性對照試驗使用生物安全柜）醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備生物安全柜:（從試驗安全性考慮，建議16醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備電子天平醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備電子天平17醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備光學顯微鏡醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備光學顯微鏡18醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備過濾裝置（無油真空泵、濾杯、濾頭、濾瓶、微孔濾膜、夾子）

醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備過濾裝置（無油真空泵、濾杯、濾頭、濾19

無菌檢查應在環(huán)境潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進行，其全過程必須嚴格遵守無菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區(qū)、工作臺面及環(huán)境應定期按《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現(xiàn)行國家標準進行潔凈度驗證。隔離系統(tǒng)按相關(guān)的要求進行驗證，其內(nèi)部環(huán)境的潔凈度須符合無菌檢查的要求。

無菌檢查人員必須具備微生物專業(yè)知識，并經(jīng)過無菌技術(shù)的培訓。還應該具有高度的責任心和嚴謹細致的工作作風。環(huán)境及人員要求無菌檢查應在環(huán)境潔凈度10000級下的局部潔凈20

無菌檢查法環(huán)境要求無菌檢查法環(huán)境要求21隔離系統(tǒng)無菌檢查法環(huán)境要求隔離系統(tǒng)無菌檢查法環(huán)境要求22

無菌室在消毒處理完畢后，應檢查空氣中的菌落數(shù)。

無菌檢查法環(huán)境要求TSA瓊脂平皿在30℃~35℃培養(yǎng)48h證明無菌取3只放無菌操作臺或超凈工作臺平均位置打開上蓋，暴露30min后蓋好3只培養(yǎng)皿上生長的菌落數(shù)平均應不超過1個無菌試驗過程中也應檢查空氣中的菌落數(shù)，方法要求同上無菌室在消毒處理完畢后，應檢查空氣中的菌落數(shù)。23無菌檢查法試驗前準備

器具滅菌：與供試液接觸的所有器具應采用可靠方法滅菌，置壓力蒸汽滅菌器內(nèi)121℃30min，或置電熱干燥箱內(nèi)160℃2h。

培養(yǎng)基：可按藥典中的處方制備培養(yǎng)基，亦可使用按該處方生產(chǎn)的符合規(guī)定的脫水培養(yǎng)基。應采用驗證合格的滅菌程序滅菌。制備好的培養(yǎng)基應保存在2℃~25℃，一般在3周內(nèi)使用。無菌檢查法試驗前準備器具滅菌：與供試液接觸的24無菌檢查法試驗前準備配制培養(yǎng)基所需器具:

無菌檢查法試驗前準備配制培養(yǎng)基所需器具:25無菌檢查法試驗前準備常用器具與稀釋液:

無菌檢查法試驗前準備常用器具與稀釋液:26無菌檢查法試驗前準備培養(yǎng)基:

無菌檢查法試驗前準備培養(yǎng)基:27無菌檢查法試驗前準備

硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基:在供試品接種前,培養(yǎng)基氧化層的高度不得超過培養(yǎng)基深度的1/5，否則,須經(jīng)100℃水浴加熱至粉紅色消失（不超過20分鐘）迅速冷卻,只限加熱一次，并應防止被污染。其裝量與容器高度的比例應符合培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)基氧化層（粉紅色）不超過培養(yǎng)基深度的1/2。30℃~35℃培養(yǎng)14天。

需氧菌生長厭氧菌生長無菌檢查法試驗前準備硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基:需氧菌厭氧28無菌檢查法試驗前準備100℃水浴加熱無菌檢查法試驗前準備100℃水浴加熱29無菌檢查法試驗前準備培養(yǎng)基:

無菌檢查法試驗前準備培養(yǎng)基:30無菌檢查法試驗前準備

改良馬丁培養(yǎng)基：23℃~

28℃培養(yǎng)14天無菌檢查法試驗前準備31無菌檢查法試驗前準備培養(yǎng)基:

無菌檢查法試驗前準備培養(yǎng)基:32無菌檢查用的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基等應符合培養(yǎng)基的無菌性檢查及靈敏度檢查的要求。

無菌性檢查

每批培養(yǎng)基隨機不少于5支（瓶），培養(yǎng)14天，應無菌生長。培養(yǎng)基的適用性檢查無菌檢查用的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基等應符合培養(yǎng)33靈敏度檢查：

菌種

培養(yǎng)基靈敏度檢查所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試驗菌株的生物學特性。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus

aureus)［CMCC（B）26

003］

銅綠假單胞菌

(Pseudomonas

aeruginosa)

［CMCC（B）10

104］

枯草芽孢桿菌

(Bacillus

subtilis

)

［CMCC（B）63

501］

生孢梭菌

(Clostridiumsporogenes)

[CMCC(B)

64

941]

白色念珠菌

(Candidaalbicans)

[CMCC(F)

98

001]

黑曲霉

(Aspergillus

niger

)

[CMCC(F)

98

003]培養(yǎng)基的適用性檢查靈敏度檢查：

34菌液制備：

接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30℃～35℃培養(yǎng)18小時～24小時；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上，（23～28）℃培養(yǎng)（24～48）小時，上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1mL含菌數(shù)小于100cfu（菌落形成單位）的菌懸液。培養(yǎng)基的適用性檢查菌液制備：

35

菌液制備：接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，（23～28）℃培養(yǎng)（5～7）天，加入（3～5）mL含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1mL含孢子數(shù)小于100cfu的孢子懸液。菌懸液在室溫下放置應在2小時內(nèi)使用，若保存在（2～8）℃可在24小時內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在（2～8）℃，在驗證過的貯存期內(nèi)使用。

培養(yǎng)基的適用性檢查菌液制備：接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面36

平板劃線法-斜線法：用接種環(huán)以無菌操作挑取菌懸液一環(huán)，先在平板培養(yǎng)基的一邊作第一次平行劃線（3-4）條，再轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿70°角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過第一次劃線部分作第二次平行劃線，再用同法通過第二次平行劃線部分作第三次平行劃線和第四次平行劃線。培養(yǎng)基的適用性檢查

平板劃線法-曲線法：將挑取有樣品的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基上作連續(xù)劃線。平板劃線法-斜線法：用接種環(huán)以無菌操作挑取菌懸液37

培養(yǎng)基的適用性檢查血瓊脂平板上的金黃色葡萄球菌（大的金黃色菌落）在劃線過程中，細胞逐漸分散，培養(yǎng)后可形成單個菌落。

培養(yǎng)基的適用性檢查血瓊脂平板上的金黃色葡萄球38

定期移植法:亦稱傳代培養(yǎng)保藏法，指將菌種接種于適宜的斜面培養(yǎng)基上，最適條件下培養(yǎng)，完成培養(yǎng)于(4～6)℃進行保存并間隔一定時間進行移植培養(yǎng)的一種短期菌種保藏方法。操作步驟：

斜面制備

接種

培養(yǎng)

保藏培養(yǎng)基的適用性檢查定期移植法:亦稱傳代培養(yǎng)保藏法，指將菌種接種于39

接種接種40培養(yǎng)基應符合無菌性檢查及靈敏度檢查的要求。檢查可在供試品的無菌檢查前或與供試品的無菌檢查同時進行。靈敏度檢查所用菌種（藥典2010版規(guī)定）金黃色葡萄球菌銅綠假單胞菌枯草芽孢桿菌生孢梭菌白色念珠菌黑曲霉分別接種各菌種新鮮培養(yǎng)物至相應培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成菌懸液（濃度小于100cfu/mL）硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（12mL）9支：分別接種小于100cfu的金葡、銅綠、枯草、生孢各2支，另一支不接種做空白對照，培養(yǎng)3天改良馬丁培養(yǎng)基（9mL）

5支：分別接種小于100cfu的白念、黑曲霉各2支，另1支不接種做空白對照，培養(yǎng)5天逐日觀察結(jié)果：空白對照管應無菌生長，若加菌的培養(yǎng)基管均生長良好，則靈敏度符合規(guī)定。培養(yǎng)基應符合無菌性檢查及靈敏度檢查的要求。檢查可在供試品的無41

培養(yǎng)基的適用性檢查

對起始樣品進行連續(xù)10倍稀釋，將高稀釋倍數(shù)的樣品與冷卻至適當溫度的溶化瓊脂培養(yǎng)基倒入無菌平皿后混合均勻，培養(yǎng)后獲得單菌落。培養(yǎng)基表面菌落為圓形，而培養(yǎng)基內(nèi)部菌落呈豆狀或透鏡狀。

培養(yǎng)基的適用性檢查對起始樣品42

培養(yǎng)基的適用性檢查

培養(yǎng)基的適用性檢查43無菌檢驗有兩種方法：直接接種法、薄膜過濾法直接接種法:將供試品或其有代表性的各部分直接投放入培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。薄膜過濾法:含抗菌、抑菌成分的供試品會抑制某些微生物的生長繁殖,所以用常規(guī)方法檢查會出現(xiàn)假陰性的結(jié)果,但并不等于產(chǎn)品中沒有微生物甚至是致病性微生物。所以采用薄膜過濾法來去除供試品中可溶的抑菌性成分,把細菌等微生物截留在濾膜上,然后再經(jīng)過處理培養(yǎng)使所含微生物生長繁殖,從而使微生物檢出。方法驗證試驗無菌檢驗有兩種方法：直接接種法、薄膜過濾法方法驗證試驗44當建立產(chǎn)品的無菌檢查法時，應進行方法的驗證，以證明所采用的方法適合于該產(chǎn)品的無菌檢查。若產(chǎn)品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變時，檢查方法應重新驗證。

驗證時，按“供試品的無菌檢查”的規(guī)定及下列要求進行操作。對每一試驗菌應逐一進行驗證。方法驗證試驗當建立產(chǎn)品的無菌檢查法時，應進行方法的驗證，以45菌種及菌液制備：除大腸埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC(B)44102〕外，金黃色葡萄球菌

、

枯草芽孢桿菌

、

生孢梭菌、

白色念珠菌、黑曲霉同培養(yǎng)基靈敏度檢查。大腸埃希菌的菌液制備同金黃色葡萄球菌。方法驗證試驗與靈敏度檢驗所有菌種區(qū)別：大腸埃希菌代替銅綠假單胞菌。方法驗證試驗菌種及菌液制備：除大腸埃希菌（Escheric46取每種培養(yǎng)基規(guī)定接種的供試品總量按薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入小于100cfu的試驗菌，過濾。取出濾膜接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基中，或?qū)⑴囵B(yǎng)基加至濾筒內(nèi)。另取一裝有同體積培養(yǎng)基的容器，加入等量試驗菌，作為對照。按規(guī)定溫度培養(yǎng)3天~5天。各試驗菌同法操作。方法驗證試驗：薄膜過濾法取每種培養(yǎng)基規(guī)定接種的供試品總量按薄膜過濾法過濾，沖47方法驗證所用菌種（藥典2010版規(guī)定）金黃色葡萄球菌大腸埃希菌枯草芽孢桿菌生孢梭菌白色念珠菌黑曲霉分別接種各菌種新鮮培養(yǎng)物至相應培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成菌懸液（濃度小于100cfu/mL）硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基8支：分別接種小于100cfu的金葡、大腸、枯草、生孢各2支，其中1管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定的供試品接種量，另1管作為對照，培養(yǎng)3天。改良馬丁培養(yǎng)基4支：分別接種小于100cfu的白念、黑曲霉各2支，其中1管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定的供試品接種量，另1管作為對照，培養(yǎng)5天。方法驗證試驗：直接接種法方法驗證所用菌種分別接種各菌種新鮮培養(yǎng)物至相應培養(yǎng)基中培養(yǎng)，48

與對照管比較，如含供試品各容器中的試驗菌均生長良好，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計，照此檢查法和檢查條件進行供試品的無菌檢查。如含供試品的任一容器中微生物生長微弱、緩慢或不生長，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下有抑菌作用，可采用增加沖洗量，或增加培養(yǎng)基的用量，或使用中和劑或更換濾膜品種等方法，消除供試品的抑菌作用，并重新進行方法驗證。

方法驗證試驗也可與供試品的無菌檢查同時進行。方法驗證試驗：結(jié)果判斷與對照管比較，如含供試品各容器中的試驗菌均49

供試品數(shù)量的選擇：檢驗數(shù)量是指一次試驗所用供試品最小包裝容器的數(shù)量。一般情況下，供試品無菌檢查若采用薄膜過濾法，應增加1/2的最小檢驗數(shù)量作陽性對照用；若采用直接接種法，應增加供試品1支（或瓶）作陽性對照用。供試品的無菌檢查供試品數(shù)量的選擇：供試品的無菌檢查50檢驗量是指一次試驗所用的供試品總量（g或ml）。若每支（瓶）供試品的裝量按規(guī)定足夠接種兩份培養(yǎng)基，則應分別接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基。采用薄膜過濾法時，檢驗量應不少于直接接種法的總接種量，只要供試品特性允許，應將所有容器內(nèi)的全部內(nèi)容物過濾。供試品的無菌檢查檢驗量是指一次試驗所用的供試品總量（g或ml）。51

供試品包裝須完好無損，尤其是只有一層包裝的樣品。進入無菌檢驗室的樣品若有兩層（或兩層以上）包裝的，需將外包裝在傳遞窗（或緩沖間）拆除后，傳入實驗室。

操作人員準備：帶口罩、帽子、穿專用無菌服、鞋進入無菌室。供試品的無菌檢查供試品包裝須完好無損，尤其是只有一層包52

供試品的無菌檢查

在100級超凈臺內(nèi)，酒精燈火焰周圍，以無菌操作法將規(guī)定量的供試品分別接種至含硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（不少于15ml/管）和改良馬丁培養(yǎng)基（不少于10ml/管）的容器中。正確的無菌操作，既不能引入外來菌污染培養(yǎng)物造成假陽性，也要注意接觸供試品的試驗用具溫度不可過高以免將可能存在的菌燙死。供試品的無菌檢查53陰性對照（目的是驗證試驗是否存在污染）：供試品無菌檢查時，應取相應溶劑和稀釋液同法操作，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。陽性對照（目的是驗證試驗可靠性，防止假陰性）：應根據(jù)供試品特性選擇陽性對照菌；無抑菌作用供試品以金黃色葡萄球菌為陽性對照菌。陽性對照試驗的菌液制備同方法驗證試驗，加菌量小于100cfu，供試品用量同供試品無菌檢查每份培養(yǎng)基接種的樣品量。陽性對照管培養(yǎng)(48~72)小時應生長良好。供試品的無菌檢查陰性對照（目的是驗證試驗是否存在污染）：供試品無菌檢查時，54無菌檢查法-直接接種法供試品數(shù)量：同一批號3個~11個單位供試品優(yōu)先采用將供試品或其有代表性的各部分直接投放入培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。如：棉簽、導尿包中的導尿管、注射器中的液體等無菌檢查法-直接接種法供試品數(shù)量：同一批號3個~11個單位55無菌檢查法–直接接種法不適宜直接投放的可制備供試液：浸提介質(zhì)：9g/L無菌氯化鈉溶液（生理鹽水）、0.1%蛋白胨水溶液、pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液

、根據(jù)供試品的特性，可選用其他驗證過的適宜的溶液作為稀釋液、沖洗液。管類器具：按管內(nèi)表面積每10cm2流過管內(nèi)腔1mL浸提介質(zhì)，流量約為10mL/min。容器類器具：已有液體的直接取液；空容器每10cm2加入浸提介質(zhì)1mL，振搖數(shù)次。實體類器具：表面積每10cm2加入浸提介質(zhì)1mL，振搖數(shù)次。供試液制備應按無菌操作法進行，在制備后2h內(nèi)使用。無菌檢查法–直接接種法不適宜直接投放的可制備供試液：56無菌檢查法–直接接種法

直接接種法：每個供試品按規(guī)定量分別接種至各含硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基的容器中。除另有規(guī)定外，每個容器中培養(yǎng)基的用量應符合接種的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的10%，同時，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少于15mL，改良馬丁培養(yǎng)基每管裝量不少于10mL。無菌檢查法–直接接種法直接接種法：每個供試品按57無菌檢查法-薄膜過濾法

2010年版《中國藥典》規(guī)定:只要供試品性狀允許，應采用薄膜過濾法。供試品無菌檢查所采用的檢查方法和檢驗條件應與驗證的方法相同。在蠕動泵的作用下，被測產(chǎn)品通過裝有帶空氣過濾器的針頭及無菌管路直接從樣品容器中進入濾筒中，免去了通常膜轉(zhuǎn)移過程中易產(chǎn)生的污染。無菌檢查法中薄膜過濾法所用的濾膜孔徑應不大于0.45μm，直徑約為50mm。無菌檢查法-薄膜過濾法2010年版《中國藥典》58水溶液供試品取規(guī)定量的供試液，直接過濾，或混合至含適量稀釋液的無菌容器內(nèi)，混勻，立即過濾。供試液經(jīng)薄膜過濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量為100ml，總沖洗量不得超過1000mL，以免濾膜上微生物受損傷。無菌檢查法-薄膜過濾法沖洗后分別將100mL硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基加入相應的濾筒內(nèi)，培養(yǎng)。水溶液供試品取規(guī)定量的供試液，直接過濾，或混合至含適量稀釋液59無菌檢查法培養(yǎng)及觀察

上述含培養(yǎng)基的容器按規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天。培養(yǎng)期間應逐日觀察并記錄是否有菌生長。如在加入供試品后或在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，培養(yǎng)14天后，不能從外觀上判斷有無微生物生長，可取該培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種至同種新鮮培養(yǎng)基中，細菌培養(yǎng)2天、真菌培養(yǎng)3天，觀察接種的同種新鮮培養(yǎng)基是否再出現(xiàn)渾濁；或取培養(yǎng)液涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌。無菌檢查法培養(yǎng)及觀察上述含培養(yǎng)基的容器按規(guī)定的溫60

若供試品管均澄清，或雖顯渾濁但經(jīng)確證無菌生長，判供試品符合規(guī)定；若供試品管中任何一管顯渾濁并確證有菌生長，判供試品不符合規(guī)定，除非能充分證明試驗結(jié)果無效，即生長的微生物非供試品所含。

試驗若經(jīng)確認無效，應重試。重試時，重新取同量供試品，依法檢查，若無菌生長，判供試品符合規(guī)定；若有菌生長，判供試品不符合規(guī)定。

陽性對照管應生長良好，陰性對照不得有菌生長。否則，試驗無效。無菌檢查法結(jié)果判斷若供試品管均澄清，或雖顯渾濁但經(jīng)確證無菌生長，判供試61

當符合下列至少一個條件時，方可判試驗結(jié)果無效：

（1）無菌檢查試驗所用的設備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結(jié)果不符合無菌檢查法的要求；

（2）回顧無菌試驗過程，發(fā)現(xiàn)有可能引起微生物污染的因素。

（3）供試品管中生長的微生物經(jīng)鑒定后，確證是因無菌試驗中所使用的物品和（或）無菌操作技術(shù)不當引起的。無菌檢查法結(jié)果判斷當符合下列至少一個條件時，方可判試驗結(jié)果無62

試驗若經(jīng)確認無效，應重試。重試時，重新取同量供試品，依法檢查，若無菌生長，判供試品符合規(guī)定；若有菌生長，判供試品不符合規(guī)定。

無菌檢查法結(jié)果判斷試驗若經(jīng)確認無效，應重試。重試時，重新取同量供63醫(yī)療器械無菌試驗檢查要點指南（2010版）

由于無菌檢驗時間跨度較長，因此過程的記錄應能夠完整體現(xiàn)試驗的全過程，對于在試驗過程中出現(xiàn)的各種情況，均應在記錄中客觀反映。醫(yī)療器械無菌試驗檢查要點指南（2010版）64直接接種法試驗結(jié)果

直接接種法試驗結(jié)果65薄膜過濾法試驗結(jié)果

薄膜過濾法試驗結(jié)果66無菌檢查法判定無菌檢查法判定67醫(yī)療器械無菌和初始污染菌檢驗技術(shù)課件68試驗報告中宜給出下列信息：

供試品名稱；生產(chǎn)批號和（或）滅菌批號；供試液制備方法；接種方式；每日觀察結(jié)果（包括陰、陽性對照）；結(jié)果判定試驗報告試驗報告中宜給出下列信息：試驗報告69（1）培養(yǎng)基配制記錄（2）滅菌器、天平等儀器的使用記錄（3）培養(yǎng)基無菌性檢查、靈敏度檢查記錄（4）菌種購買、傳代、使用記錄（5）方法學驗證記錄（6）無菌試驗記錄（7）滅菌物品制作（8）廢棄物處理記錄（9）潔凈間監(jiān)測記錄醫(yī)療器械無菌檢驗應有記錄（1）培養(yǎng)基配制記錄醫(yī)療器械無菌檢驗應有記錄70一、適用范圍二、檢查內(nèi)容1.選擇的無菌檢驗方法2.檢驗人員資質(zhì)3.現(xiàn)場察看無菌實驗室環(huán)境4.設備和器具5.管理制度、操作規(guī)程等相關(guān)技術(shù)文件

6.查閱試驗記錄三、其它應注意的問題醫(yī)療器械無菌試驗檢查要點指南（2010版）（1）培養(yǎng)基制備（2）供試品的無菌檢查（3）培養(yǎng)及觀察（4）結(jié)果判斷（1）樣品記錄（2）滅菌物品制作記錄（3）原始試驗記錄（4）廢棄物處理記錄一、適用范圍醫(yī)療器械無菌試驗檢查要點指南（2010版）（71醫(yī)療器械無菌試驗檢查要點指南（2010版）其它應注意的問題還包括：生產(chǎn)企業(yè)應確保樣品具有代表性：試驗樣品應從常規(guī)產(chǎn)品中能夠代表加工過程和條件的批中選擇。選擇樣品是隨機的。試驗樣品的選擇和處理技術(shù)應明確，以免對樣品上所含的微生物的數(shù)量和種類造成污染和改變。試驗樣品可以選擇制造過程中的不合格產(chǎn)品，它們應該代表這個生產(chǎn)批的加工程序和條件。用于試驗的不合格產(chǎn)品應不會影響無菌測試的有效性。醫(yī)療器械無菌試驗檢查要點指南（2010版）其它應注意的問題還72醫(yī)療器械無菌試驗檢查要點指南（2010版）其它應注意的問題還包括：生產(chǎn)企業(yè)對于供試品的選取、轉(zhuǎn)移過程要采取防止污染措施，確保試驗結(jié)果的可靠性。選取制作供試品的試驗樣品時，樣品包裝須完好無損，尤其是只有一層包裝的樣品。進入無菌檢驗室的樣品若有兩層（或兩層以上）包裝的，需將外包裝在傳遞窗（或緩沖間）拆除后，傳入實驗室。

醫(yī)療器械無菌試驗檢查要點指南（2010版）其它應注意的問題還73無菌試驗要點器具滅菌：所有器具高壓滅菌121℃30min，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基:接種前,培養(yǎng)基氧化層的高度不得超過培養(yǎng)基深度的1/5，30℃~35℃培養(yǎng)14天。改良馬丁培養(yǎng)基：

23℃~28℃培養(yǎng)14天。兩種培養(yǎng)基要符合無菌性檢查及靈敏度檢查的要求；無菌試驗要點器具滅菌：所有器具高壓滅菌121℃30min，74無菌試驗要點

供試品包裝完好。培養(yǎng)基、供試品消毒后帶入無菌室。采用驗證過檢查方法（直接接種法或薄膜過濾法）在潔凈度10000級下的局部100級區(qū)域內(nèi)，以無菌操作法將規(guī)定量的供試品或供試液分別接種至兩種培養(yǎng)基中，同時做陰性對照和陽性對照；按規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天。逐日觀察并記錄。如在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，培養(yǎng)14天后，不能從外觀上判斷有無微生物生長，可取該培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種至同種新鮮培養(yǎng)基中，細菌培養(yǎng)2天、真菌培養(yǎng)3天，觀察接種的同種新鮮培養(yǎng)基是否再出現(xiàn)渾濁；或取培養(yǎng)液涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌。無菌試驗要點供試品包裝完好。培養(yǎng)基、供試品消毒后75無菌試驗要點

陽性對照管應生長良好，陰性對照不得有菌生長。供試品管均應澄清，或雖顯渾濁但經(jīng)確證無菌生長，判供試品符合規(guī)定；若供試品管中任何一管顯渾濁并確證有菌生長，判供試品不符合規(guī)定，除非能充分證明試驗結(jié)果無效，即生長的微生物非供試品所含。出具試驗結(jié)果后，所有培養(yǎng)物121℃高壓滅菌30分鐘處理。做好相應試驗記錄。無菌試驗要點陽性對照管應生長良好，陰性76實例：薄膜過濾法——考察沖洗量

試驗菌：(1)生孢梭菌64941

(2)銅綠假單胞菌10104(3)枯草芽孢桿菌63501(4)金黃色葡萄球菌26003總?cè)恿浚?5g/每株試驗菌實例：薄膜過濾法——考察沖洗量77+:對照管;

1:沒有沖洗;

2:沖洗液體積200ml;3:沖洗液體積400ml.

35℃,培養(yǎng)24小時.+:對照管;1:沒有沖洗;

78+:對照管;

1:沒有沖洗;2:沖洗液體積200ml.

35℃,培養(yǎng)48小時.+:對照管;

1:沒有沖洗;2:沖洗液體79結(jié)論:1.紅霉素對生孢梭菌生長無抑制作用.2.紅霉素對銅綠假單孢菌生長無抑制作用.結(jié)論:1.紅霉素對生孢梭菌生長無抑制作用.80＋

:對照管;

1:沒有沖洗;

2:沖洗液體積200ml;3:沖洗液體積400ml.

35℃,培養(yǎng)72小時.＋:對照管;1:沒有沖洗;

2:沖洗液體811.紅霉素對枯草芽孢桿菌有抑制作用.每筒加樣量5g(相當于紅霉素25mg)。2.沖洗液體積400ml,枯草芽孢桿菌48小時后可見微弱生長,72小時生長良好。3.在該檢驗條件下,沖洗400ml,三天內(nèi)可檢出枯草芽孢桿菌.結(jié)論:1.紅霉素對枯草芽孢桿菌有抑制作用.結(jié)論:82+:對照管;

1:沒有沖洗;

2:沖洗液體積200ml;3:沖洗液體積400ml.

35℃,培養(yǎng)72小時.+:對照管;1:沒有沖洗;

2:沖洗液體積283500:沖洗液體積500ml;700:沖洗液體積700ml.

35℃,培養(yǎng)72小時.500:沖洗液體積500ml;700:沖洗液體積7084結(jié)論:1.紅霉素對金黃色葡萄球菌有抑制作用。2.在該檢驗條件下,沖洗700ml,殘留的紅霉素不影響金黃色葡萄球菌的生長。結(jié)論:1.紅霉素對金黃色葡萄球菌有抑制作用。85醫(yī)療器械初始污染菌檢驗技術(shù)醫(yī)療器械初始污染菌檢驗技術(shù)86GB15979-2002一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標準初始污染菌的檢驗

初始污染菌：產(chǎn)品消毒、滅菌前的細菌總數(shù)，可判明檢品受細菌污染的程度以及生產(chǎn)單位所用的原料、工具設備、工藝流程、生產(chǎn)人員的衛(wèi)生狀況，是對檢品進行衛(wèi)生學評價的綜合依據(jù)。GB15979-2002一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標準初始污87

GB15979-2002一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標準初始污染菌：產(chǎn)品消毒、滅菌前的細菌總數(shù)，可判明檢品受細菌污染的程度以及生產(chǎn)單位所用的原料、工具設備、工藝流程、生產(chǎn)人員的衛(wèi)生狀況，是對檢品進行衛(wèi)生學評價的綜合依據(jù)。微生物限度檢查法：檢查非規(guī)定滅菌產(chǎn)品受微生物污染程度的方法。消毒與滅菌的區(qū)別:消毒是殺滅清除傳播媒介上病原微生物。但不能殺死芽孢等全部微生物。所以消毒是不徹底的，不能代替滅菌。初始污染菌的檢驗

GB15979-2002一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標準初88

初始污染菌的檢驗

初始污染菌的檢驗89部分一次性使用衛(wèi)生產(chǎn)品微生物學指標要求產(chǎn)品種類微生物指標初始污染菌cfu/g細菌菌落總數(shù)cfu/g或cfu/mL大腸菌群致病性化膿菌真菌菌落總數(shù)cfu/g或cfu/mL口罩普通級消毒級—≤10000≤200≤20不得檢出不得檢出不得檢出不得檢出≤100不得檢出尿布等普通級消毒級—≤10000≤200≤20不得檢出不得檢出不得檢出不得檢出≤100不得檢出注：致病性化膿菌指綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌與溶血性鏈球菌。部分一次性使用衛(wèi)生產(chǎn)品微生物學指標要求產(chǎn)品種類微生物指標初始90初始污染菌的檢驗準備：平皿洗凈、烘干；牛皮紙包好滅菌營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基配制、滅菌。步驟：采樣，供試液制備，培養(yǎng)，菌落計數(shù)

在100級凈化條件下用無菌方法打開至少3個包裝；從每個包裝中取樣，準確稱取10g±1g樣品；剪碎后加入200mL無菌生理鹽水中，充分混勻。液體產(chǎn)品用原液直接做樣液。初始污染菌的檢驗準備：平皿洗凈、烘干；牛皮紙包好滅菌91初始污染菌的檢驗取上清液共接種5個平皿，每個平皿中加入1mL供試液用冷卻至45℃左右的熔化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（15~20）mL，倒入每個平皿內(nèi)混合均勻。待瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平皿置35℃±2℃培養(yǎng)48h后，計算平板上的菌落數(shù)。稀釋度

5細菌菌落總數(shù)=5塊平板上的細菌菌落總數(shù)×（cfu/g或cfu/mL）如：取10g樣品入200mL生理鹽水中，則稀釋20倍當菌落數(shù)在100以內(nèi)，按實有數(shù)報告，大于100時采用二位有效數(shù)字。初始污染菌的檢驗取上清液共接種5個平皿，每個平皿中加入1mL92初始污染菌的檢驗計數(shù)方法：將平板置菌落計數(shù)器或從平板的背面直接以肉眼用標記筆點計，以投射光襯以暗色背景，仔細觀察，計數(shù)。必要時可以借助于放大鏡、菌落計數(shù)器。菌落特征：⑴形態(tài)特征：常為白色、灰白色或灰色，亦有淡褐色、淡黃色。⑵邊緣整齊或不整齊，表面有光滑、粗糙，皺褶、突起或扁平。⑶大小差異很大。初始污染菌的檢驗計數(shù)方法：將平板置菌落計數(shù)器或從平板的背面直93初始污染菌的檢驗

如果樣品菌落總數(shù)超過本標準的規(guī)定，應將留存的復檢樣品依前法復測2次，2次結(jié)果平均值都達到本標準的規(guī)定，則判定被檢樣品合格；其中有任何一次結(jié)果平均值超過本標準的規(guī)定，則判定被檢樣品不合格。初始污染菌的檢驗如果樣品菌落總數(shù)超過94大腸菌群檢測方法樣液5mL接種至50mL乳糖膽鹽發(fā)酵管，置35℃±2℃培養(yǎng)24h，如不產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則大腸菌群為陰性。如產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則劃線接種伊紅美藍瓊脂平板，置35℃±2℃培養(yǎng)18~24h，觀察平板上菌落形態(tài)。取疑似菌落作革蘭氏染色鏡檢，同時接種乳糖發(fā)酵管，置35℃±2℃培養(yǎng)24h，觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖膽鹽發(fā)酵管產(chǎn)酸產(chǎn)氣，乳糖發(fā)酵管產(chǎn)酸產(chǎn)氣，在伊紅美藍平板上有典型大腸菌落，革蘭氏染色為陰性無芽孢桿菌，可報告被檢樣品檢出大腸桿菌。大腸菌群檢測方法樣液5mL接種至50mL乳糖膽鹽發(fā)酵管，置95乳糖膽鹽培養(yǎng)基中用的是溴甲酚紫作指示劑，該指示劑中性時呈藍紫色，酸性時呈黃色，大腸桿菌能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，因此培養(yǎng)基變成黃色和產(chǎn)生氣泡。乳糖膽鹽培養(yǎng)基中用的是溴甲酚紫作指示劑，該指96綠膿桿菌檢測方法樣液5mL接種至50mLSCDLP培養(yǎng)液中，充分混勻，置35℃±2℃培養(yǎng)(18~24)h，如有綠膿桿菌生長，表面呈現(xiàn)一層薄菌膜，培養(yǎng)液常呈黃綠色或藍綠色。從培養(yǎng)液菌膜處挑取培養(yǎng)物，劃線接種十六烷三甲基溴化銨瓊脂平板，置35℃±2℃培養(yǎng)(18~24)h，觀察菌落特征。綠膿桿菌生長良好，其他菌不長。取疑似菌落作革蘭氏染色鏡檢，為陰性者需進行氧化酶、綠膿菌素、硝酸鹽還原產(chǎn)氣、明膠液化等一系列試驗。綠膿桿菌檢測方法樣液5mL接種至50mLSCDLP培養(yǎng)液中97金黃色葡萄球菌檢測方法樣液5mL接種至50mLSCDLP培養(yǎng)液中，充分混勻，置35℃±2℃培養(yǎng)24h。如有菌生長，劃線接種在血瓊脂培養(yǎng)基上，置35℃±2℃培養(yǎng)(18~24)h，觀察菌落特征。取疑似菌落作革蘭氏染色鏡檢，為陽性呈葡萄狀，無芽孢莢膜者，需進行甘露醇發(fā)酵、血漿凝固酶等一系列試驗。金黃色葡萄球菌檢測方法樣液5mL接種至50mLSCDLP培98溶血性鏈球菌檢測方法樣液5mL接種至50mL葡萄糖肉湯中，充分混勻，置35℃±2℃培養(yǎng)24h。如有菌生長，劃線接種在血瓊脂培養(yǎng)基上，置35℃±2℃培養(yǎng)18h~24h，觀察菌落特征。取疑似菌落作革蘭氏染色鏡檢，如為陽性呈鏈狀排列的球菌，需進行鏈激酶桿菌肽敏感等一系列試驗。溶血性鏈球菌檢測方法樣液5mL接種至50mL葡萄糖肉湯中，充99真菌菌落總數(shù)檢測方法若標準對真菌菌落總數(shù)有具體數(shù)值要求，則測試方法基本同細菌菌落總數(shù)檢測方法，只是培養(yǎng)基采用沙氏培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為25℃±2℃培養(yǎng)7天。若標準要求真菌不得檢出，則取樣液5mL接種至50mL沙氏培養(yǎng)基中，25℃±2℃培養(yǎng)7天，逐日觀察有無真菌生長；若培養(yǎng)管渾濁應轉(zhuǎn)種沙氏瓊脂培養(yǎng)基，證實有真菌生長，可報告被檢樣品檢出真菌。真菌菌落總數(shù)檢測方法若標準對真菌菌落總數(shù)有具體數(shù)值要100微生物學檢查無菌檢查微生物限度檢查其他（初始污染菌）細菌、真菌數(shù)量控制菌（大腸、金葡、綠膿等）微生物學檢查無菌檢查微生物限度檢查其他細菌、真菌數(shù)量控制菌（101醫(yī)療器械的無菌和初始污染菌檢驗相關(guān)標準GB/T14233.2-2005醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗方法第2部分：生物學試驗方法2010年版《中國藥典》無菌檢查法GB15979-2002

一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標準GB/T15980-1995一次性使用醫(yī)療用品衛(wèi)生標準YY0033-2000無菌醫(yī)療器具生產(chǎn)管理規(guī)范醫(yī)療器械的無菌和初始污染菌檢驗相關(guān)標準GB/T14233.102醫(yī)療器械無菌和初始污染菌檢驗技術(shù)課件103醫(yī)療器械無菌和初始污染菌檢驗技術(shù)國家食品藥品監(jiān)督管理局北京醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心醫(yī)療器械無菌和初始污染菌檢驗技術(shù)國家食品藥品監(jiān)督管理局104醫(yī)療器械無菌檢驗技術(shù)醫(yī)療器械無菌檢驗技術(shù)105什么是無菌檢查法？

用于檢查要求無菌的醫(yī)療器械是否無菌的一種方法。若供試品符合無菌檢查法的規(guī)定，僅表明了供試品在該檢驗條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染。

無菌試驗的目的：將醫(yī)療器械或其浸提液接種于培養(yǎng)基內(nèi)，以檢驗供試品是否有細菌和真菌污染。什么是無菌檢查法？用于檢106醫(yī)療器械無菌檢驗標準GB/T14233.2-2005醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗方法第2部分：生物學試驗方法2010年版《中國藥典》無菌檢查法醫(yī)療器械無菌檢驗標準GB/T14233.2-2005醫(yī)107醫(yī)療器械無菌試驗檢查要點指南（2010版）

無菌檢驗是無菌醫(yī)療器械產(chǎn)品生產(chǎn)控制過程中的一項重要內(nèi)容。其檢驗方法、檢驗結(jié)果判定及檢驗人員業(yè)務能力等因素直接影響產(chǎn)品的質(zhì)量和安全。作為無菌醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)，其無菌檢驗工作應由本企業(yè)獨立完成。并要求企業(yè)的檢驗人員能當場操作或口述無菌檢驗的過程。醫(yī)療器械無菌試驗檢查要點指南（2010版）無菌108滅菌:殺滅或除去特定環(huán)境或物品中一切微生物的過程。目前國際上規(guī)定，滅菌過程必須使滅菌物品污染的微生物存活率減少到10-6及以下。

微生物:必須用光學顯微鏡或電子顯微鏡才能觀察到的微小生物。微生物具有一定的形態(tài)與結(jié)構(gòu),并能在適宜的環(huán)境中迅速地生長和繁殖,如細菌、病毒、真菌等。無菌：是指某一物體或某一環(huán)境中不含有活的微生物。無菌技術(shù):是指在微生物試驗工作中，控制或防止各類微生物的污染及其干擾的一系列操作方法和有關(guān)措施，其中包括無菌環(huán)境設施、無菌試驗器材以及無菌操作。滅菌:殺滅或除去特定環(huán)境或物品中一切微生物的過程。目109無菌操作:是指在無菌環(huán)境條件下，在對無菌制品或無菌器械進行檢驗的過程中，能防止微生物污染與干擾的一種常規(guī)操作方法。培養(yǎng)條件：用于促進微生物發(fā)育、生長和繁殖的生長培養(yǎng)基和培養(yǎng)方式的組合。抑細菌/抑霉菌試驗：用選定的微生物來演示某些物質(zhì)的存在能夠抑制這些微生物的繁殖。培養(yǎng)基:是人工配制的生物營養(yǎng)物質(zhì)，即用人工的方法將多種物質(zhì)按各種微生物生長繁殖的需要配成的一種混合營養(yǎng)物。無菌操作:是指在無菌環(huán)境條件下，在對無菌制品或無菌器械進110促生長試驗：用于證明生長培養(yǎng)基能夠支持微生物生長的技術(shù)操作。

假陰性：實際陽性的無菌試驗結(jié)果被變成了陰性。假陽性：實際陰性的無菌試驗結(jié)果被變成了陽性。

需氧菌：在代謝中，有氧條件下才能生存的微生物。

厭氧菌：在代謝中，沒有氧的條件下才能生存的微生物。

無菌保證水平（SAL）:滅菌后產(chǎn)品上存在單個活微生物的概率。促生長試驗：用于證明生長培養(yǎng)基能夠支持微生物111

細菌：為單細胞微生物,其細胞分化不完善，無完整細胞核及核膜、核仁，直徑一般為1μm~10μm。

112

真菌：為多細胞或單細胞微生物，其細胞分化完善，有細胞核和各種細胞器，故易在體外生長繁殖，直徑一般為10μm~100μm。

113醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備

超凈工作臺醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備超凈工作臺114醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備恒溫培養(yǎng)箱（至少2臺）醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備恒溫培養(yǎng)箱（至少2臺）115醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備壓力蒸汽滅菌器醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備壓力蒸汽滅菌器116醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備電熱干燥箱醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備電熱干燥箱117醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備集菌儀醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備集菌儀118醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備生物安全柜:（從試驗安全性考慮，建議陽性對照試驗使用生物安全柜）醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備生物安全柜:（從試驗安全性考慮，建議119醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備電子天平醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備電子天平120醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備光學顯微鏡醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備光學顯微鏡121醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備過濾裝置（無油真空泵、濾杯、濾頭、濾瓶、微孔濾膜、夾子）

醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備過濾裝置（無油真空泵、濾杯、濾頭、濾122

無菌檢查應在環(huán)境潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進行，其全過程必須嚴格遵守無菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區(qū)、工作臺面及環(huán)境應定期按《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現(xiàn)行國家標準進行潔凈度驗證。隔離系統(tǒng)按相關(guān)的要求進行驗證，其內(nèi)部環(huán)境的潔凈度須符合無菌檢查的要求。

無菌檢查人員必須具備微生物專業(yè)知識，并經(jīng)過無菌技術(shù)的培訓。還應該具有高度的責任心和嚴謹細致的工作作風。環(huán)境及人員要求無菌檢查應在環(huán)境潔凈度10000級下的局部潔凈123

無菌檢查法環(huán)境要求無菌檢查法環(huán)境要求124隔離系統(tǒng)無菌檢查法環(huán)境要求隔離系統(tǒng)無菌檢查法環(huán)境要求125

無菌室在消毒處理完畢后，應檢查空氣中的菌落數(shù)。

無菌檢查法環(huán)境要求TSA瓊脂平皿在30℃~35℃培養(yǎng)48h證明無菌取3只放無菌操作臺或超凈工作臺平均位置打開上蓋，暴露30min后蓋好3只培養(yǎng)皿上生長的菌落數(shù)平均應不超過1個無菌試驗過程中也應檢查空氣中的菌落數(shù)，方法要求同上無菌室在消毒處理完畢后，應檢查空氣中的菌落數(shù)。126無菌檢查法試驗前準備

器具滅菌：與供試液接觸的所有器具應采用可靠方法滅菌，置壓力蒸汽滅菌器內(nèi)121℃30min，或置電熱干燥箱內(nèi)160℃2h。

培養(yǎng)基：可按藥典中的處方制備培養(yǎng)基，亦可使用按該處方生產(chǎn)的符合規(guī)定的脫水培養(yǎng)基。應采用驗證合格的滅菌程序滅菌。制備好的培養(yǎng)基應保存在2℃~25℃，一般在3周內(nèi)使用。無菌檢查法試驗前準備器具滅菌：與供試液接觸的127無菌檢查法試驗前準備配制培養(yǎng)基所需器具:

無菌檢查法試驗前準備配制培養(yǎng)基所需器具:128無菌檢查法試驗前準備常用器具與稀釋液:

無菌檢查法試驗前準備常用器具與稀釋液:129無菌檢查法試驗前準備培養(yǎng)基:

無菌檢查法試驗前準備培養(yǎng)基:130無菌檢查法試驗前準備

硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基:在供試品接種前,培養(yǎng)基氧化層的高度不得超過培養(yǎng)基深度的1/5，否則,須經(jīng)100℃水浴加熱至粉紅色消失（不超過20分鐘）迅速冷卻,只限加熱一次，并應防止被污染。其裝量與容器高度的比例應符合培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)基氧化層（粉紅色）不超過培養(yǎng)基深度的1/2。30℃~35℃培養(yǎng)14天。

需氧菌生長厭氧菌生長無菌檢查法試驗前準備硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基:需氧菌厭氧131無菌檢查法試驗前準備100℃水浴加熱無菌檢查法試驗前準備100℃水浴加熱132無菌檢查法試驗前準備培養(yǎng)基:

無菌檢查法試驗前準備培養(yǎng)基:133無菌檢查法試驗前準備

改良馬丁培養(yǎng)基：23℃~

28℃培養(yǎng)14天無菌檢查法試驗前準備134無菌檢查法試驗前準備培養(yǎng)基:

無菌檢查法試驗前準備培養(yǎng)基:135無菌檢查用的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基等應符合培養(yǎng)基的無菌性檢查及靈敏度檢查的要求。

無菌性檢查

每批培養(yǎng)基隨機不少于5支（瓶），培養(yǎng)14天，應無菌生長。培養(yǎng)基的適用性檢查無菌檢查用的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基等應符合培養(yǎng)136靈敏度檢查：

菌種

培養(yǎng)基靈敏度檢查所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試驗菌株的生物學特性。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus

aureus)［CMCC（B）26

003］

銅綠假單胞菌

(Pseudomonas

aeruginosa)

［CMCC（B）10

104］

枯草芽孢桿菌

(Bacillus

subtilis

)

［CMCC（B）63

501］

生孢梭菌

(Clostridiumsporogenes)

[CMCC(B)

64

941]

白色念珠菌

(Candidaalbicans)

[CMCC(F)

98

001]

黑曲霉

(Aspergillus

niger

)

[CMCC(F)

98

003]培養(yǎng)基的適用性檢查靈敏度檢查：

137菌液制備：

接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30℃～35℃培養(yǎng)18小時～24小時；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上，（23～28）℃培養(yǎng)（24～48）小時，上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1mL含菌數(shù)小于100cfu（菌落形成單位）的菌懸液。培養(yǎng)基的適用性檢查菌液制備：

138

菌液制備：接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，（23～28）℃培養(yǎng)（5～7）天，加入（3～5）mL含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1mL含孢子數(shù)小于100cfu的孢子懸液。菌懸液在室溫下放置應在2小時內(nèi)使用，若保存在（2～8）℃可在24小時內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在（2～8）℃，在驗證過的貯存期內(nèi)使用。

培養(yǎng)基的適用性檢查菌液制備：接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面139

平板劃線法-斜線法：用接種環(huán)以無菌操作挑取菌懸液一環(huán)，先在平板培養(yǎng)基的一邊作第一次平行劃線（3-4）條，再轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿70°角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過第一次劃線部分作第二次平行劃線，再用同法通過第二次平行劃線部分作第三次平行劃線和第四次平行劃線。培養(yǎng)基的適用性檢查

平板劃線法-曲線法：將挑取有樣品的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基上作連續(xù)劃線。平板劃線法-斜線法：用接種環(huán)以無菌操作挑取菌懸液140

培養(yǎng)基的適用性檢查血瓊脂平板上的金黃色葡萄球菌（大的金黃色菌落）在劃線過程中，細胞逐漸分散，培養(yǎng)后可形成單個菌落。

培養(yǎng)基的適用性檢查血瓊脂平板上的金黃色葡萄球141

定期移植法:亦稱傳代培養(yǎng)保藏法，指將菌種接種于適宜的斜面培養(yǎng)基上，最適條件下培養(yǎng)，完成培養(yǎng)于(4～6)℃進行保存并間隔一定時間進行移植培養(yǎng)的一種短期菌種保藏方法。操作步驟：

斜面制備

接種

培養(yǎng)

保藏培養(yǎng)基的適用性檢查定期移植法:亦稱傳代培養(yǎng)保藏法，指將菌種接種于142

接種接種143培養(yǎng)基應符合無菌性檢查及靈敏度檢查的要求。檢查可在供試品的無菌檢查前或與供試品的無菌檢查同時進行。靈敏度檢查所用菌種（藥典2010版規(guī)定）金黃色葡萄球菌銅綠假單胞菌枯草芽孢桿菌生孢梭菌白色念珠菌黑曲霉分別接種各菌種新鮮培養(yǎng)物至相應培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成菌懸液（濃度小于100cfu/mL）硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（12mL）9支：分別接種小于100cfu的金葡、銅綠、枯草、生孢各2支，另一支不接種做空白對照，培養(yǎng)3天改良馬丁培養(yǎng)基（9mL）

5支：分別接種小于100cfu的白念、黑曲霉各2支，另1支不接種做空白對照，培養(yǎng)5天逐日觀察結(jié)果：空白對照管應無菌生長，若加菌的培養(yǎng)基管均生長良好，則靈敏度符合規(guī)定。培養(yǎng)基應符合無菌性檢查及靈敏度檢查的要求。檢查可在供試品的無144

培養(yǎng)基的適用性檢查

對起始樣品進行連續(xù)10倍稀釋，將高稀釋倍數(shù)的樣品與冷卻至適當溫度的溶化瓊脂培養(yǎng)基倒入無菌平皿后混合均勻，培養(yǎng)后獲得單菌落。培養(yǎng)基表面菌落為圓形，而培養(yǎng)基內(nèi)部菌落呈豆狀或透鏡狀。

培養(yǎng)基的適用性檢查對起始樣品145

培養(yǎng)基的適用性檢查

培養(yǎng)基的適用性檢查146無菌檢驗有兩種方法：直接接種法、薄膜過濾法直接接種法:將供試品或其有代表性的各部分直接投放入培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。薄膜過濾法:含抗菌、抑菌成分的供試品會抑制某些微生物的生長繁殖,所以用常規(guī)方法檢查會出現(xiàn)假陰性的結(jié)果,但并不等于產(chǎn)品中沒有微生物甚至是致病性微生物。所以采用薄膜過濾法來去除供試品中可溶的抑菌性成分,把細菌等微生物截留在濾膜上,然后再經(jīng)過處理培養(yǎng)使所含微生物生長繁殖,從而使微生物檢出。方法驗證試驗無菌檢驗有兩種方法：直接接種法、薄膜過濾法方法驗證試驗147當建立產(chǎn)品的無菌檢查法時，應進行方法的驗證，以證明所采用的方法適合于該產(chǎn)品的無菌檢查。若產(chǎn)品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變時，檢查方法應重新驗證。

驗證時，按“供試品的無菌檢查”的規(guī)定及下列要求進行操作。對每一試驗菌應逐一進行驗證。方法驗證試驗當建立產(chǎn)品的無菌檢查法時，應進行方法的驗證，以148菌種及菌液制備：除大腸埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC(B)44102〕外，金黃色葡萄球菌

、

枯草芽孢桿菌

、

生孢梭菌、

白色念珠菌、黑曲霉同培養(yǎng)基靈敏度檢查。大腸埃希菌的菌液制備同金黃色葡萄球菌。方法驗證試驗與靈敏度檢驗所有菌種區(qū)別：大腸埃希菌代替銅綠假單胞菌。方法驗證試驗菌種及菌液制備：除大腸埃希菌（Escheric149取每種培養(yǎng)基規(guī)定接種的供試品總量按薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入小于100cfu的試驗菌，過濾。取出濾膜接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基中，或?qū)⑴囵B(yǎng)基加至濾筒內(nèi)。另取一裝有同體積培養(yǎng)基的容器，加入等量試驗菌，作為對照。按規(guī)定溫度培養(yǎng)3天~5天。各試驗菌同法操作。方法驗證試驗：薄膜過濾法取每種培養(yǎng)基規(guī)定接種的供試品總量按薄膜過濾法過濾，沖150方法驗證所用菌種（藥典2010版規(guī)定）金黃色葡萄球菌大腸埃希菌枯草芽孢桿菌生孢梭菌白色念珠菌黑曲霉分別接種各菌種新鮮培養(yǎng)物至相應培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成菌懸液（濃度小于100cfu/mL）硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基8支：分別接種小于100cfu的金葡、大腸、枯草、生孢各2支，其中1管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定的供試品接種量，另1管作為對照，培養(yǎng)3天。改良馬丁培養(yǎng)基4支：分別接種小于100cfu的白念、黑曲霉各2支，其中1管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定的供試品接種量，另1管作為對照，培養(yǎng)5天。方法驗證試驗：直接接種法方法驗證所用菌種分別接種各菌種新鮮培養(yǎng)物至相應培養(yǎng)基中培養(yǎng)，151

與對照管比較，如含供試品各容器中的試驗菌均生長良好，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計，照此檢查法和檢查條件進行供試品的無菌檢查。如含供試品的任一容器中微生物生長微弱、緩慢或不生長，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下有抑菌作用，可采用增加沖洗量，或增加培養(yǎng)基的用量，或使用中和劑或更換濾膜品種等方法，消除供試品的抑菌作用，并重新進行方法驗證。

方法驗證試驗也可與供試品的無菌檢查同時進行。方法驗證試驗：結(jié)果判斷與對照管比較，如含供試品各容器中的試驗菌均152

供試品數(shù)量的選擇：檢驗數(shù)量是指一次試驗所用供試品最小包裝容器的數(shù)量。一般情況下，供試品無菌檢查若采用薄膜過濾法，應增加1/2的最小檢驗數(shù)量作陽性對照用；若采用直接接種法，應增加供試品1支（或瓶）作陽性對照用。供試品的無菌檢查供試品數(shù)量的選擇：供試品的無菌檢查153檢驗量是指一次試驗所用的供試品總量（g或ml）。若每支（瓶）供試品的裝量按規(guī)定足夠接種兩份培養(yǎng)基，則應分別接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基。采用薄膜過濾法時，檢驗量應不少于直接接種法的總接種量，只要供試品特性允許，應將所有容器內(nèi)的全部內(nèi)容物過濾。供試品的無菌檢查檢驗量是指一次試驗所用的供試品總量（g或ml）。154

供試品包裝須完好無損，尤其是只有一層包裝的樣品。進入無菌檢驗室的樣品若有兩層（或兩層以上）包裝的，需將外包裝在傳遞窗（或緩沖間）拆除后，傳入實驗室。

操作人員準備：帶口罩、帽子、穿專用無菌服、鞋進入無菌室。供試品的無菌檢查供試品包裝須完好無損，尤其是只有一層包155

供試品的無菌檢查

在100級超凈臺內(nèi)，酒精燈火焰周圍，以無菌操作法將規(guī)定量的供試品分別接種至含硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（不少于15ml/管）和改良馬丁培養(yǎng)基（不少于10ml/管）的容器中。正確的無菌操作，既不能引入外來菌污染培養(yǎng)物造成假陽性，也要注意接觸供試品的試驗用具溫度不可過高以免將可能存在的菌燙死。供試品的無菌檢查156陰性對照（目的是驗證試驗是否存在污染）：供試品無菌檢查時，應取相應溶劑和稀釋液同法操作，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。陽性對照（目的是驗證試驗可靠性，防止假陰性）：應根據(jù)供試品特性選擇陽性對照菌；無抑菌作用供試品以金黃色葡萄球菌為陽性對照菌。陽性對照試驗的菌液制備同方法驗證試驗，加菌量小于100cfu，供試品用量同供試品無菌檢查每份培養(yǎng)基接種的樣品量。陽性對照管培養(yǎng)(48~72)小時應生長良好。供試品的無菌檢查陰性對照（目的是驗證試驗是否存在污染）：供試品無菌檢查時，157無菌檢查法-直接接種法供試品數(shù)量：同一批號3個~11個單位供試品優(yōu)先采用將供試品或其有代表性的各部分直接投放入培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。如：棉簽、導尿包中的導尿管、注射器中的液體等無菌檢查法-直接接種法供試品數(shù)量：同一批號3個~11個單位158無菌檢查法–直接接種法不適宜直接投放的可制備供試液：浸提介質(zhì)：9g/L無菌氯化鈉溶液（生理鹽水）、0.1%蛋白胨水溶液、pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液

、根據(jù)供試品的特性，可選用其他驗證過的適宜的溶液作為稀釋液、沖洗液。管類器具：按管內(nèi)表面積每10cm2流過管內(nèi)腔1mL浸提介質(zhì)，流量約為10mL/min。容器類器具：已有液體的直接取液；空容器每10cm2加入浸提介質(zhì)1mL，振搖數(shù)次。實體類器具：表面積每10cm2加入浸提介質(zhì)1mL，振搖數(shù)次。供試液制備應按無菌操作法進行，在制備后2h內(nèi)使用。無菌檢查法–直接接種法不適宜直接投放的可制備供試液：159無菌檢查法–直接接種法

直接接種法：每個供試品按規(guī)定量分別接種至各含硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基的容器中。除另有規(guī)定外，每個容器中培養(yǎng)基的用量應符合接種的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的10%，同時，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少于15mL，改良馬丁培養(yǎng)基每管裝量不少于10mL。無菌檢查法–直接接種法直接接種法：每個供試品按160無菌檢查法-薄膜過濾法

2010年版《中國藥典》規(guī)定:只要供試品性狀允許，應采用薄膜過濾法。供試品無菌檢查所采用的檢查方法和檢驗條件應與驗證的方法相同。在蠕動泵的作用下，被測產(chǎn)品通過裝有帶空氣過濾器的針頭及無菌管路直接從樣品容器中進入濾筒中，免去了通常膜轉(zhuǎn)移過程中易產(chǎn)生的污染。無菌檢查法中薄膜過濾法所用的濾膜孔徑應不大于0.45μm，直徑約為50mm。無菌檢查法-薄膜過濾法2010年版《中國藥典》161水溶液供試品取規(guī)定量的供試液，直接過濾，或混合至含適量稀釋液的無菌容器內(nèi)，混勻，立即過濾。供試液經(jīng)薄膜過濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量為100ml，總沖洗量不得超過1000mL，以免濾膜上微生物受損傷。無菌檢查法-薄膜過濾法沖洗后分別將100mL硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基加入相應的濾筒內(nèi)，培養(yǎng)。水溶液供試品取規(guī)定量的供試液，直接過濾，或混合至含適量稀釋液162無菌檢查法培養(yǎng)及觀察

上述含培養(yǎng)基的容器按規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天。培養(yǎng)期間應逐日觀察并記錄是否有菌生長。如在加入供試品后或在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，培養(yǎng)14天后，不能從外觀上判斷有無微生物生長，可取該培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種至同種新鮮培養(yǎng)基中，細菌培養(yǎng)2天、真菌培養(yǎng)3天，觀察接種的同種新鮮培養(yǎng)基是否再出現(xiàn)渾濁；或取培養(yǎng)液涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌。無菌檢查法培養(yǎng)及觀察上述含培養(yǎng)基的容器按規(guī)定的溫163

若供試品管均澄清，或雖顯渾濁但經(jīng)確證無菌生長，判供試品符合規(guī)定；若供試品管中任何一管顯渾濁并確證有菌生長，判供試品不符合規(guī)定，除非能充分證明試驗結(jié)果無效，即生