2014細(xì)胞生物學(xué)新技術(shù)簡

細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究技術(shù)孫岳平細(xì)胞與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中心

2014.11FromUnicellularToMulticellularOrganism--細(xì)胞感受環(huán)境信號、把這種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，并做出反應(yīng)的過程。細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)：

細(xì)胞外信號分子受體蛋白細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子效應(yīng)蛋白細(xì)胞反應(yīng)細(xì)胞信號通路的基本組成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的分子組成

主要由蛋白質(zhì)組成：1.蛋白質(zhì)往往具有酶活性：RTK、腺苷酸環(huán)化酶、磷脂酶C、磷酸激酶等，特異性和信號放大。2.蛋白質(zhì)相互作用：結(jié)合域，特異性。3.蛋白質(zhì)修飾：激活/失活、蛋白質(zhì)相互作用第二信使（Secondmessenger)：在傳遞過程中產(chǎn)生的小分子：cAMP、cGMP、IP3、DG等，放大信號。

Signaltransductionininsulinaction這些不同的反應(yīng)由不同的信號通路來介導(dǎo)Whensignalsgowrong….AbnormalsignalingcanhavedrasticanddramaticeffectsAchondroplasiaRetinoblastomaHumanbodyhas~75trillioncells

細(xì)胞對信號的反應(yīng):1.細(xì)胞質(zhì)：蛋白質(zhì)活性改變2.細(xì)胞核：基因表達(dá)改變-

轉(zhuǎn)錄出新的或更多的蛋白質(zhì)ToKnowLife:FromMoleculeToCellGeneProteinBiologicalprocess由以下幾個方面決定：合成速率：mRNA水平

穩(wěn)定性：蛋白水平定位：細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器活性：酶活性：激酶、NADPH氧化酶、組蛋白脫乙酰酶（HDAC）等轉(zhuǎn)錄活性：主要指轉(zhuǎn)錄因子(TF)，促進(jìn)靶基因轉(zhuǎn)錄的活性注意：轉(zhuǎn)錄因子活性受到co-activator或co-repressor的調(diào)節(jié)和哪些蛋白在一起相互作用、相互影響？研究蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的活動情況需要從哪些方面入手？

研究實(shí)例（數(shù)據(jù)有所調(diào)整）

藥物A可增強(qiáng)某種腫瘤細(xì)胞對化療誘導(dǎo)凋亡的敏感性，欲研究藥物A的作用機(jī)制。在某種生理或病理過程（如細(xì)胞分化、腫瘤發(fā)生、藥物誘導(dǎo)）中，最初的有關(guān)基因表達(dá)變化的信息往往可以通過mRNA水平的變化（增高或降低）來獲得,并開展進(jìn)一步的研究。DNAmicroarray

（基因芯片）是一種用于分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的高通量技術(shù).它由一系列成千上萬個精微的DNA寡核苷酸點(diǎn)排列而成，這些DNA寡核苷酸含有百億分之一摩爾特定序列的。它們或者是一小截基因，或者是DNA的其他成分。它們被作為探針，在非常嚴(yán)格的條件下和一個叫做靶分子的cDNA或cRNA樣本雜交。由于靶分子帶有熒光標(biāo)記，因此通過探針-靶分子的雜交，并根據(jù)雜交后熒光的有或無

，強(qiáng)或弱，對靶分子中特定核酸序列的豐度進(jìn)行檢測。GlobalgeneexpressionanalysisinstromalPten-deletedmammaryfibroblasts1、LossofstromalPtenactivatesanEts2-dependenttranscriptionalprogram。2、StromalEts2promotesmammarytumorigenesis。3、LossofEts2diminishestumorformationinPtenstromal-deletedmammaryglands。170non-codingRNAs(ncRNAs)63HOXexons(stageIandII)QuantitativePCRHOTAIR的高表達(dá)是轉(zhuǎn)移和死亡的一個有意義的判斷指標(biāo)關(guān)注HOTAIR（一種lncRNA，與甲基化酶PRC2復(fù)合體相結(jié)合）基因芯片的結(jié)果如何驗(yàn)證？Real-timePCRandRT-PCROVERVIEW組織或細(xì)胞抽提RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成cDNA實(shí)時定量PCR結(jié)果分析RNA的質(zhì)量Shouldbefreeofprotein(absorbance260nm/280nm)Shouldbeundegraded(28S/18S~2:1)ShouldbefreeofDNA(DNasetreat)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的引物Oligo(dt)Randomhexamer(NNNNNN)SpecificPCR反應(yīng)的引物specifichighefficiencynoprimer-dimersIdeallyshouldnotgiveaDNAsignalcrossexon/exonboundaryEXON1EXON2INTRON2DNAEXON1EXON2RNA設(shè)置對照陰性對照(noDNA)checksreagentsforcontamination陽性對照checksthatreagentsandprimersworkespeciallyimportanceiftryingtoshowabsenceofexpressionofagene750bp

Markerbrain(+)brain()()兩種標(biāo)記技術(shù)染料染色SYBRGreen探針標(biāo)記TaqMan探針定量原理SYBRGreen染料染料法的優(yōu)缺點(diǎn)成本低廣譜性適合初篩無模板特異性靈敏度低條件優(yōu)化

研究實(shí)例（數(shù)據(jù)有所調(diào)整）

藥物A可增強(qiáng)某種腫瘤細(xì)胞對化療誘導(dǎo)凋亡的敏感性，欲研究藥物A的作用機(jī)制，對藥物A處理前后的細(xì)胞進(jìn)行cDNAarray分析，發(fā)現(xiàn)藥物A可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)CaxmRNA水平的增高。

以NorthernBlot檢測Cax在各種組織中的表達(dá)，包括一些腫瘤標(biāo)本。

研究實(shí)例（數(shù)據(jù)有所調(diào)整）

以NorthernBlot檢測Cax在各種組織中的表達(dá)ExpressionofCAXinMouseTissuesByNorthernblotanalysismCAXBeta-actin5.5kb4.2kb

文獻(xiàn)檢索表明，Cax是一種未被研究的蛋白質(zhì)，基本特點(diǎn)和功能不明，且序列不完整。首先可對其作一個生物信息學(xué)的分析。例如，在NCBI數(shù)據(jù)庫里尋找一些信息。

*EST（BB664436）有236bp的5’端延伸，RESULTSFROMBLASTINGENEBANKPCR驗(yàn)證電子克隆的結(jié)果PCRPRODUCTWITHPRIMERBANDCEST(BB664436)cbc750bp

Markerbrain(+)brain()()電子克隆拼接后形成完整的5’端序列拼接產(chǎn)物編碼的蛋白與人的CAX高度同源欲進(jìn)一步研究Cax的作用機(jī)制，常用的方法是尋找與Cax相互作用的蛋白，最常用的方法為酵母雙雜交（yeasttwo-hybrid)酵母雙雜交系統(tǒng)是在真核模式生物酵母中進(jìn)行的，研究活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用，對蛋白質(zhì)之間微弱的、瞬間的作用也能夠通過報告基因的表達(dá)產(chǎn)物敏感地檢測得到，它是一種具有很高靈敏度的研究蛋白質(zhì)之間關(guān)系的技術(shù)。酵母雙雜交技術(shù)已經(jīng)成為發(fā)現(xiàn)新基因的主要途徑。當(dāng)我們將已知基因作為誘餌，在選定的cDNA文庫中篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白，從篩選到的陽性酵母菌株中可以分離得到AD-LIBRARY載體，并從載體中進(jìn)一步克隆得到隨機(jī)插入的cDNA片段，并對該片段的編碼序列在GENEBANK中進(jìn)行比較，研究與已知基因在生物學(xué)功能上的聯(lián)系。另外，也可作為研究已知基因的新功能或多個篩選到的已知基因之間功能相關(guān)的主要方法。GAL4為轉(zhuǎn)錄因子，含DBD(DNA-bindingdomain)和AD(Activatingdomain)兩個結(jié)構(gòu)域Cax

asbait,clonedtoGAL4-BDvectorcDNAlibrary,clonedtoGAL4-ADvector

CAX的全長cDNA序列Caxp50p65Caxp65Yeasttwo-hybrid

screening：p65（RelA）是Cax的相互作用蛋白以DBD-Cax和AD-p65共轉(zhuǎn)染酵母，進(jìn)一步證實(shí)它們的相互作用或體外翻譯的蛋白，如35S標(biāo)記的p65。InVitroBindingAssay

[GST

pull-downassay,Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巰基轉(zhuǎn)移酶]glutathione-SepharosebeadsInVitroBindingAssay

[GST

pull-downassay,Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巰基轉(zhuǎn)移酶]GSTorGST-CaxfusionproteinswereexpressedinE.coliBL21cellsandpurifiedwithglutathione-Sepharosebeads.pcDNA-p65wassubjectedtoinvitrotranslationtoproduceap65proteinlabeledwith

[35S]methionine.PurifiedGST-CaxorGSTproteinsbound

toglutathione-Sepharosebeadswereincubatedwith35S-labeledp65

Afterintensivewashing,thebeadswereresuspendedandsubjectedto(SDS)andautoradiography.

InputGSTGST-Cax

GSTpull-downsamplep65GST-CaxGSTBorgproteinscontrolseptinorganizationandarenegativelyregulatedbyCdc42NATURECELLBIOLOGY/VOL3OCTOBER2001GérardJoberty,RichardR.Perlungher?,PeterJ.SheffieldGSTfusionproteinswereimmobilizedonglutathione–Sepharosebeadsandincubatedwithcelllysates.NIH3T3cellswerelabelledwith[35S]methionine.Thecellextractswerecentrifugedandthesupernatantswerepreclearedwithglutathione–SepharosebeadsandincubatedwiththeGST–Borg3for20min.Beadswerewashedwiththesamebuffer.Proteinswereelutedwith20mMglutathione.GST–Borg3wasdigestedwiththrombin.Proteinswerethenseparated,digestedandidentifiedasdescribedpreviously.GSTpull-down實(shí)驗(yàn)是一個行之有效的驗(yàn)證酵母雙雜交系統(tǒng)的體外試驗(yàn)技術(shù)。其基本原理是將靶蛋白-GST融合蛋白固化在谷胱甘肽親和樹脂上,充當(dāng)一種“誘餌蛋白”。當(dāng)目的蛋白溶液過柱,可從中捕獲與之相互作用的“捕獲蛋白”(目的蛋白),洗脫結(jié)合物后通過SDS電泳分析,從而證實(shí)兩種蛋白間的相互作用或篩選相應(yīng)的目的蛋白,“誘餌蛋白”和“捕獲蛋白”均可通過細(xì)胞裂解物、純化的蛋白以及體外翻譯等方法獲得。

His-Cax-+-+HA-p65--++

IP:Anti-HisIB:Anti-HA

Anti-His

Anti-HA

IP:Anti-HAIB:Anti-HisTotalcelllysates1234InVivoBindingAssay

(Co-mmunoprecipitation,CoIP)(免疫共沉淀)proteinA-agarosebeadsHA-p65Anti-His-IgGProteinAHis-Caxagarosebeads有時侯，抗體可以直接偶聯(lián)到agarosebeads上Anti-HA-IgGHis-CaxHA-p65agarosebeadsMNO現(xiàn)在我們有足夠的證據(jù)表明，p65是Cax的相互作用蛋白p65是轉(zhuǎn)錄因子NF–κB的一個亞基，NF–κB已經(jīng)得到廣泛深入的研究。下一步的研究應(yīng)該是Cax是否參與調(diào)節(jié)NF–κB的活性，如何調(diào)節(jié)？NF-κB的激活

轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionfactor)在GPCR途徑中有CREB酶偶聯(lián)受體：

RTK-Ras-MAPK途徑中有cMyc,cJun,cFos

其他：STAT、Smad在受調(diào)蛋白水解依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中有NF-κB

在核受體信號途徑中,核受體自身為轉(zhuǎn)錄因子。

轉(zhuǎn)錄因子就是基因調(diào)控蛋白，通過與DNA上基因調(diào)控序列結(jié)合，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。在研究某些因素對NF–κB信號系統(tǒng)的影響的時候，分為不同層次：細(xì)胞質(zhì)層次：

IκB激酶的激活（kinaseassay)IκB的降解(Westernblot)細(xì)胞核層次：NF–κB與DNA的結(jié)合能力（invitro)（EMSA)NF–κB與DNA的結(jié)合（invivo)(ChIP)NF–κB與co-activator或co-repressor的關(guān)系05101530600510153060min

VectorHis-CaxIκBα(37KD)β-actinCax對IκB降解的影響(Westernblot)制備穩(wěn)定表達(dá)Cax的細(xì)胞系：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或pcDNA3G418篩選TNFα抗原等蛋白樣品經(jīng)SDS處理后全部帶上負(fù)電荷，從而使蛋白之間僅有分子大小的差異。將少量待測蛋白樣本加入夾在兩塊玻璃平板之間的聚丙烯酰酰凝膠頂部的加樣孔中。組織或細(xì)胞的蛋白裂解產(chǎn)物凝膠玻璃平板將凝膠置于電場中，凝膠的底部接正極。帶負(fù)電荷的蛋白向凝膠底部的正極泳動，并按分子大小的不同形成分離的條帶。蛋白分子的泳動速率與分子的大小成反比，最小的多肽最先到達(dá)凝膠的底部。凝膠可以用能結(jié)合多肽的染液進(jìn)行染色。最終在凝膠中顯示樣本中各多肽的位置。BlottingUsedtoidentifyasingleprotein/DNA/RNAmoleculeinacomplexmixturethathasbeenseparatedbygelelectrophoresisProbesarelabeledforeasyvisualizationWhenantibodiesareusedtoprobeforspecificproteinsinagel,thisiscalled“westernblotting”SouthernblottingisprobingforaDNAsequencewithaDNAprobeNorthernblottingisprobingforanRNAsequencewithaDNAprobeAntibodiesProteinsthatplayacriticalroleinhumoralimmunityTocellbiologists,theyare“tools”forresearchHighlyselectiveforspecificmoleculesEasytopurifyEasytochemicallymodifywith“tags”thatcanbevisualizedCansometimesimpactthefunctionofaproteininalivingcell(e.g.,herceptin)Polyclonalantibodies次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶（HGPRT）胸腺嘧啶核苷激酶（TK）次黃嘌呤（hypoxanthine,H）氨甲喋呤（aminopterin,A）胸腺嘧啶核苷（thymidine,T）氨甲喋呤是葉酸的拮抗劑DAPIHis-Cax

Anti-His免疫熒光：p65可能位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)，那么Cax定位于哪里呢？亞細(xì)胞定位帶標(biāo)簽的重組蛋白重組蛋白His-tagHA-tag共定位重組DNA技術(shù)ＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＴＴＡＡＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＡＴＴＣＸＹＡＴＧCax與p65的細(xì)胞核共定位:TNFalpha處理2小時

Anti-p65

Anti-PML

Anti-Cax

Anti-Cax

Merge

MergeP65與Cax共定位于細(xì)胞核內(nèi)對NF-kB的功能有何影響？

轉(zhuǎn)錄因子受到co-activator或co-repressor的調(diào)節(jié)，可以引起染色體重構(gòu)，從而改變核小體的局部構(gòu)象，使得轉(zhuǎn)錄復(fù)合體易于或不易于接近轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。?Cax很可能是NF–κB的共激活因子（co-activator)或共抑制因子(co-repressor)用報告基因來檢測轉(zhuǎn)錄因子的活化：綠色熒光蛋白2.半乳糖苷酶

3.熒光素酶(Luciferase)TitrationHis-CaxJ16Cax抑制NF–κB的轉(zhuǎn)錄活性5’-deletionanalysiscanidentifytranscription-controlsequencesinDNAupstreamofageneIFN-、IFN-可誘導(dǎo)胚胎成纖維細(xì)胞CAX的表達(dá)RT-PCR結(jié)果1000U/mlIFN-

M--+/+c6h12h24h-/-cG3PDHmCAXNorthern100U/mlIFN-

C6h12h24hC6h12h24hG3PDHmCAX+/+-/-Anelectrophoreticmobilityshiftassay(EMSA),alsoreferredasagelshiftassay,gelmobilityshiftassay,isacommontechniqueusedtostudyprotein-DNAorprotein-RNAinteractions.ThisprocedurecandetermineifaproteinormixtureofproteinsiscapableofbindingtoagivenDNAorRNAsequence,andcansometimesindicateifmorethanoneproteinmoleculeisinvolvedinthebindingcomplex.

p65NFκBbindingsites凝膠電泳遷移率變遷分析（Electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA）

，也稱GelShift。檢測轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合的能力（invitro)：檢測轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合的能力（invitro)：凝膠電泳遷移率變遷分析（Electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA）

，也稱GelShift。TNFα-+-+

NF-κBFreeprobeVectorHis-CaxCax不影響NFκB與DNA結(jié)合的能力（DNAbindingcapacity）核蛋白粗提物32P標(biāo)記NF-κB探針1與2孵育,SDS,放射自顯影檢測轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合的能力（invitro)：凝膠電泳遷移率變遷分析（Electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA）

，也稱GelShift。

凝膠電泳遷移率改變分析（EMSA）是目前研究轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白和相應(yīng)核苷酸序列結(jié)合的常用方法，但是由于許多轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白有相似或相同的DNA結(jié)合位點(diǎn)，這種體外分析獲取的結(jié)果不一定能真實(shí)地反映體內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白和DNA結(jié)合的狀況。染色質(zhì)免疫沉淀分析（ChIP）是基于體內(nèi)分析發(fā)展起來的方法，它能真實(shí)、完整地反映結(jié)合在DNA序列上的調(diào)控蛋白，是目前確定與特定蛋白結(jié)合的基因組區(qū)域或確定與特定基因組區(qū)域結(jié)合的蛋白質(zhì)的最好方法。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（chromatinimmunoprecipitationassay,CHIP）

研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法。它的基本原理是在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)－DNA復(fù)合物，并將其隨機(jī)切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。該技術(shù)主要應(yīng)用：1.組蛋白修飾研究2.轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析3.藥物開發(fā)研究4.有絲分裂研究5.DNA損失與凋亡分析。下圖是ChIP技術(shù)的作用原理。=p65IntactcellCrosslinkwithformaldehydeHarvestcellsSonicatetofragmentchromatinReversecrosslinkingbyheatingat65°CovernightanduseRNAseandproteinaseKtodegradeproteinandRNACheckfragmentationbyrunninganagarosegelDividechromatininto3aliquots:(1)input,(2)IPwithIgG,(3)IPwithp65antibodyPerformIP活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)－DNA復(fù)合物將其隨機(jī)切斷免疫學(xué)方法沉淀Reversecrosslinkingbyheatingat65°CovernightUseRNAseandproteinaseKtodegradeproteinandRNAPurifyDNAandrunPCRontargetsequences(cyclinD)RunSDStocheckifproteinwasprecipitatedbytheantibodyspecificallyinputIgGp65IgGp65inputIgGp65Positiveprimer檢測轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合（invivo)：染色體免疫沉淀（chromotinimmunoprecipitation,ChIP）

InputAntip65

His-Cax

cyclinD1promoter

cyclinD1promoter

VectorIgGCax不影響NFκB與DNA的結(jié)合（DNAbinding）Anti-p65-IgGp65NFκBbindingsites

cyclinD1promoterChromotinprocessingtosmallfragments(500-600bp)Anti-p65immunoprecipitationPCRforcyclinD1promoter(containingNFκBbindingsites)細(xì)胞質(zhì)層次：

IκB激酶的激活（kinaseassay)IκB的降解(Westernblot)細(xì)胞核層次：NF–κB與DNA的結(jié)合能力（invitro)（EMSA)NF–κB與DNA的結(jié)合（invivo)(ChIP)Cax對NF–κB信號系統(tǒng)的影響作用環(huán)節(jié)可能在co-repressor

共激活因子（co-activator)或共抑制因子(co-repressor)往往就是通過調(diào)節(jié)組蛋白的翻譯后修飾實(shí)現(xiàn)其功能的組蛋白可以有多種翻譯后修飾形式：

磷酸化乙酰化泛素化甲基化這些修飾會影響組蛋白的構(gòu)象，從而影響轉(zhuǎn)錄復(fù)合體與DNA的結(jié)合：Histonecode引起染色體重構(gòu)(Remodeling)的因子：ATP-dependantRemodelingComplexesHATorHDACComplexesHAT:histoneacetyltransferase（組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶）

HDAC:histonedeacetylase（組蛋白脫乙酰酶）His-CaxHis-CaxTSA，不影響Cax對NFκB的抑制作用；NAM,可解除Cax對NFκB的抑制作用。

TSA，第一、二類組蛋白脫乙酰酶（HDAC）的抑制劑；NAM,第三類HDAC的抑制劑。Cax是依賴于第三類HDAC活性的co-repressorHela細(xì)胞，anti-His純化Cax體外表達(dá)GST-Cax,無HDAC活性Cax可募集HDAC活性（Recruitsdeactylaseactivity)CAX——HDAC活性？Anti-SIRT1Anti-HisAnti-SIRT1IPwithanti-HisTotalcelllysateVectorHis-CaxCax可募集第三類HDAC

SIRT1p50p65p50p65SIRT1CaxSIRT1藥物A

已知NFκB有對抗細(xì)胞凋亡的作用，目前數(shù)據(jù)提示Cax可能通過抑制NFκB的活化，從而具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用要證實(shí)這一點(diǎn)，需對細(xì)胞內(nèi)Cax的水平進(jìn)行干預(yù)，考察NFκB活化和細(xì)胞凋亡的情況干預(yù)方法：正：過度表達(dá)

負(fù)：siRNADominantNegativeMutant當(dāng)然，也可以制備Cax轉(zhuǎn)基因小鼠或Cax基因剔除小鼠DominantNegativeMutant(負(fù)顯性突變)：對影響蛋白質(zhì)功能的關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行突變，所得突變體不僅喪失了原有功能，并且可以抑制內(nèi)源性蛋白質(zhì)的功能。例如，對Cax和SIRT1的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行研究后，發(fā)現(xiàn)某個位點(diǎn)的氨基酸對Cax募集SIRT1的功能非常重要，該氨基酸突變后，Cax喪失了募集SIRT1的功能。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CaxM具有負(fù)顯性功能，可促進(jìn)NF–κB的激活,其機(jī)制可能是對內(nèi)源性Cax的競爭性抑制。Anti-SIRT1Anti-HisAnti-SIRT1IPwithanti-HisTotalcelllysateVectorHis-CaxHis-CaxM

ControlTNFLuciferaseactivity(fold)VectorHis-CaxHis-CaxMp50p65p50p65SIRT1內(nèi)源性CaxSIRT1外源性CaxM內(nèi)源性Cax?siRNA(smallinterferingRNA)或RNAi(RNAinterference)的原理siRNA的設(shè)計:可進(jìn)入各生物公司網(wǎng)站在線設(shè)計或請專業(yè)公司設(shè)計siRNA如何轉(zhuǎn)入細(xì)胞:瞬時和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染siRNA效果鑒定:NorthernBlot或WesternBlotCax沉默促進(jìn)由TNFalpha刺激引起的NFκB-依賴的轉(zhuǎn)錄CaxAnnexinV-FITCPIControl藥物A+化療藥

CaxsiRNA

ControlsiRNACaxsilencingdecreasestheapoptoticcellsp50p65SIRT1內(nèi)源性CaxCaxreconstitutioncouldrescuetheapoptoticsusceptibilityofcellstoTNFCax*isresistantfordegradationinducedbysiRNA.ItssequencehasmultiplenucleotidesubstitutionswithinthesiRNAbindingsite,butretainthecodingofidenticalaminoacidsasthewildtypeCax,toallowforreconstitutioninthesiRNAenvironmentHis-Cax*Anti-His

WT:5’CAAAGCGTGGACCTGGTCTTCCCT3’;Mutant:5’CAgtcCGTaGattTaGTaTTtCCg3’

forthesameaminoacidssequence:QSVDLVFP

現(xiàn)在我們可以得出結(jié)論:1.Cax具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用2.藥物A通過誘導(dǎo)Cax表達(dá)的增加,增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化療誘導(dǎo)凋亡的敏感性3.Cax促進(jìn)細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能是抑制了NFκB的激活基因打靶原理:

生物界同源重組現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，為基因打靶奠定了堅實(shí)的理論基礎(chǔ)，而胚胎干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，促進(jìn)了基因打靶的廣泛應(yīng)用。同源重組(Homologousbination)又稱一般性重組或非特異性重組(Generalbination)，是指相似的DNA交換遺傳信息的過程,外源DNA片段可與宿主基因組的相應(yīng)片段發(fā)生交換（即重組）?；虼虬型ǔＪ侵赣煤阎蛄械腄NA片段與受體細(xì)胞基因組中序列相同或相近的基因發(fā)生同源重組，整合至受體細(xì)胞基因組中并得以表達(dá)的一種外源DNA導(dǎo)入技術(shù)。XpPNT－mCAX基因敲除載體ES細(xì)胞電穿孔，篩選同源重組克隆ES細(xì)胞囊胚注射，嵌合體小鼠的產(chǎn)生基因剔除流程圖嵌合體小鼠回交，獲得雜合子小鼠(胸苷激酶蛋白)TK可使無毒的丙氧鳥苷（GANC）轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘院塑账幔鴼⑺兰?xì)胞，因而可用丙氧鳥苷篩選排除隨機(jī)整合的細(xì)胞株。CAX小鼠基因型的檢測策略Southernblot+/+-/-+/-22.86kb22.86/9.9kb9.9kbBh2.1Kb2.5KbprobeBhBh8.1kb1.8kb22.86kb6.4kbabcd同源重組陽性的ES細(xì)胞鑒定結(jié)果ES細(xì)胞陽性克隆

5195MCAX的嵌合體小鼠CAX小鼠基因型的檢測策略PCR+/+-/-+/-2.8kb1.5/2.8kb1.5kbBh2.1Kb2.5KbprobeBhBh8.1kb1.8kb22.86kb6.4kbabcdCAX小鼠后代的基因型檢測結(jié)果F1代鑒定結(jié)果F3代鑒定結(jié)果a/bprimera/bprimerc/dprimerInactivationofCAXthroughHomologousbinationG3PDHmCAXM+/++/++/-+/--/--/-ＣＡＸ剔除小鼠的雜合子后代符合孟德爾的遺傳規(guī)律ＣＡＸ-/-小鼠的胚胎發(fā)育正常對出生后小鼠的觀察表明，ＣＡＸ-/-小鼠的形態(tài)、生長、繁殖無明顯異常條件性基因打靶LoxP（locusofX-overP1）序列：5'-ATAACTTCGTATA-ATGTATGC-TATACGAAGTTAT-3'3'-TATTGAAGCATAT-TACATACG-ATATGCTTCAATA-5'Cre重組酶：能介導(dǎo)兩個LoxP位點(diǎn)（序列）之間的特異性重組，使LoxP位點(diǎn)間的基因序列被刪除或重組。1、如果兩個LoxP位點(diǎn)位于一條DNA鏈上，且方向相同，Cre重組酶能有效切除兩個LoxP位點(diǎn)間的序列；

2、如果兩個LoxP位點(diǎn)位于一條DNA鏈上，但方向相反，Cre重組酶能導(dǎo)致兩個LoxP位點(diǎn)間的序列倒位；Brainbowinvivo神經(jīng)系統(tǒng)中熒