歐石楠體細(xì)胞胚發(fā)生過程中的甲基化研究

歐石楠體細(xì)胞胚發(fā)生過程中的甲基化研究姚培娟李際紅木亓?xí)酝蹂\楠?dú)W石楠體細(xì)胞胚發(fā)生過程中的甲基化研究姚培娟李際紅木亓?xí)酝蹂\楠(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，農(nóng)業(yè)生態(tài)與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安271018)摘要：利用甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性(MSAP)方法，對歐石楠大田苗、胚性愈傷組織和再生苗的DNA甲基化進(jìn)行了研究。本試驗(yàn)從64對選擴(kuò)增引物中篩選出19對，共擴(kuò)增得到506條帶，統(tǒng)計(jì)顯示，大田苗、胚性愈傷組織和再生苗的全基因組DNA甲基化水平分別為31．42％、27．86％和29．05％，三種試材之間發(fā)生甲基化變異的有175條帶，變異率為34．58％。對比發(fā)現(xiàn)，體胚誘導(dǎo)形成胚性愈傷組織過程中，甲基化水平降低，而在再生苗中有所恢復(fù)，與大田苗接近。在外側(cè)胞嘧啶甲基化水平卜，胚性愈傷組織的甲基化水平有所增加，且在再生苗中可部分維持。分析3種試材之間175條變異帶的DNA甲基化變異帶型發(fā)現(xiàn)，再生苗中恢復(fù)到大舀苗DNA甲基化模式的有62條變異帶，占總變異條帶的35．43％，而與胚性愈傷組織維持相同DNA甲基化模式的有59條變異帶，占33．7l％；通過對部分甲基化變異條帶的回收，最終得到8條有效的基因組DNA序列，BLASTn比對分析表明，歐石楠基因組中包括抗性基因、蛋白激酶、質(zhì)體基因等在內(nèi)的多種類型的DNA序列中均存在DNA甲基化修飾現(xiàn)象。關(guān)鍵詞：歐石楠；DNA甲基化；體胚發(fā)生；胚性愈傷組織；再生苗DNAMethylationinSomaticEmbryogenesisofEricacarneaL．YA0Pei—Juan；LIJi—Hong+；OIXiao；WangJin—NanKeyLaboratoryofAgriculturalEcologyandEnvironrnent,CollegeofForestry，ShandongAgriculturalUniversity,Tai'a11．Shan—dong271018,ChinaAbstract：TheDNAmethylationofEricacarneaFieldseedlings，embryogeniccallusandregeneratedseedlingswereanalyzedbymethylationsensitiveamplifiedpolymorphism(MSAP)method．Here，19pairsofamplificationprimershadbeendugoutfrom64pairs，and506bandsweregotbyamplificationTheresultsshowedthatwhole—genomicDNAmethylationlevelsofFieldseedlings，embryogeniccallusandregeneratedseedlingswere31．42％．27．86％and29．05％．respectively,and175bandspresented34．58％ofmethylationmutationrate amongthreekindsoftestmaterials．Bycomparison．methylationlevelofembryogeniccallusreducedinprocessofinductionofsomaticembryos，andrecoveredclosetoficldseedlingsintheregeneratedseedlings．．Onlateralcytosinemethylationlevel，itwasincreasedinembryogeniccallus，andcouldpartiallymaintaininregeneratedseedlings．Byanalyzing175mutationbandsamongthreekindsoftestmaterials，amongthem， 62bandsfromregeneratedseedlingsreturningtofieldseedlingsofDNA methylationpatternaccountedfor35．43％ofmutationbands，while59bandsfromregeneratedseedlingsmaintainingthesameDNAmethylationpatternwithembryogeniccallusaccountedfor33．7l％．EightmethylatedDNAsequenceswereisolatedandsequencedbyextractingpartoftheamplificatedsites，TheDNAmethylatedmodi矗cationphenomenonexistedinmultipletypesofDNAsequencesbyBLASTncomparison，includingresistancegenesequences，proteinkinase，plastogene，etc．Kevwords：EricacarneaL|：DNAmethylation；somaticembryogenesis；embryogeniccallus：regenerationplant歐石楠是2006年我們課題組從德國引進(jìn)的適合我國北方廣大地區(qū)的地被開花植物，為迅速推廣應(yīng)用我們己成功建立了歐石楠體胚繁育技術(shù)體系。然而體細(xì)胞無性系變異在植物組織培養(yǎng)中是一種普遍現(xiàn)象，DNA甲基化變化作為體細(xì)胞無性系變異的分子機(jī)制之一，廣泛存在于組織培養(yǎng)過程(Kaeppler等2000)。目前，關(guān)于DNA甲基化變異在組織培養(yǎng)過程中的作用機(jī)制雖然還沒被完全揭示，但許多研究已顯示DNA甲基化以多種變異形式出現(xiàn)在植株再生過程中，且在組織培養(yǎng)過程中高頻發(fā)生(鮑智娟2009)。近年來，利用MSAP技術(shù)，對啤酒花(HumuluslupulusL．CV．Chinook)、豌豆(PisumsativumL．)、野生大麥(Hordeumbrevisubulatum(Trin．)Link)、香雪蘭(覷esiahybrida)、大葉蝴蝶蘭(Phalaenopsisbellina(Rchb．f)Christenson)、大花君子蘭(Cliviaminiata)幣I]茄子(SolanummelongenaL．)等植物組織培養(yǎng)過程中DNA甲基化變異的研究已有報(bào)道(Peredo等作者簡介姚培娟(1989一)，女，河北滄州人，就讀于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院林木遺傳育種專業(yè)。：+通訊作者E-mail：jhli4856@163．com5912006；Smykal等2007；Li等2007；Gao等2010；Amir等2010；Wang等2012；Mallaya和Ravishankar2013)。其研究多集中于禾本科植物及蔬菜作物中，對于木本觀賞植物還鮮有報(bào)道。2006；Smykal等2007；Li等2007；Gao等2010；Amir等2010；Wang等2012；Mallaya和Ravishankar2013)。其研究多集中于禾本科植物及蔬菜作物中，對于木本觀賞植物還鮮有報(bào)道。目前我們己建立了成熟的歐石楠體胚再生體系，為了檢測體胚再生方式形成的再生苗，在表觀遺傳方面是否存在變異，對其胚性愈傷組織和再生苗與大田苗之間DNA甲基化水平和模式的變異進(jìn)行研究。本試驗(yàn)利用MSAP技術(shù)，以山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)實(shí)驗(yàn)站的7年生歐石楠大田苗(CK)和實(shí)驗(yàn)室已有的胚性愈傷組織(E)以及胚性愈傷組織誘導(dǎo)的再生苗(s)為材料，對歐石楠胚性愈傷組織、再生苗與大田苗之間的胞嘧啶甲基化水平和模式的變異進(jìn)行分析，明確其變異趨勢，以期從DNA甲基化層面揭示歐石楠體胚再生過程中發(fā)生的DNA甲基化變異情況，為歐石楠體細(xì)胞胚發(fā)生過程中其表觀遺傳學(xué)特性提供一定的理論依據(jù)。1材料與方法1．1試驗(yàn)材料材料采自山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)實(shí)驗(yàn)站的七年生歐石楠(EricacarneaL．)大田苗的當(dāng)年生嫩梢(CK)及取實(shí)驗(yàn)室已有的胚性愈傷組織(E)(在1／2WPM+I．0mg·LJzT+O．3mg‘L。IBA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)約50d)，以表面具球形顆粒，結(jié)構(gòu)致密，顏色嫩黃的胚性愈傷組織為宜(參照李際紅2012)和胚性愈傷組織誘導(dǎo)形成的再生苗(s)，分別采集帶回實(shí)驗(yàn)室，用于DNA的提取。1．2試驗(yàn)方法1．2．1DNA的提取方法按照新型植物基因組提取試劑盒(TianGen))z步驟要求提取上述3個(gè)試材的總DNA，所提DNA經(jīng)1．5％瓊脂糖凝膠電泳檢測鑒定其含量及DNA模板的完整性，并用分光光度法定量后，一20。C保存?zhèn)溆谩?．2．2DNA甲基化分析采用甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)。l生(methylation—sensitiveamplificationpolymorphism，MSAP)方法，分析所有試材的DNA甲基化狀態(tài)。分析流程參照魏華麗等的(2010)的方法略有修改，所有接頭和引物參照Xiong(1999)，見表1。表l MSAP分析的接頭和引物序列：!!!!!! 蘭塑旦121寶211i!P!!：：!型2墨里!：：竺!塑!壘：堅(jiān)!些竺!!Z坐接頭和引物 序列正向EcoRl接頭 5'-CTCGTAGACTGCGTACC一3’反向EcoRI接頭 5'-AA丁TGGTACGCAGTCTAC一3正向HpalI—Mspl接頭 5'-GACGATGAGTCTAGAA-3’反向HpalI—MspI接頭 5'-CGTTCTAGACTCATC一3’預(yù)擴(kuò)增引物Presclectiveprimers(57-÷3’)EA00+A 5’．GTAGACTGCGTACCAATTCA．3’HpalI-MspI+T 5’．GATGAGTCTAGAACGGT一3’選擴(kuò)增引物Selecliveprimers(5’一3’)EAOO+ATG 5'-GTAGACTGCGTACCAATrCATG一3’EA00+ACG 5'-GTAGACTGCGTACCAATTCACG一3’EA00+ACT 5’一GTAGACTGCGTACCAATTCACT．3EA00+ACA 5’—5TAGACTGCGTACCAATTCACA一3’EAOO+AGT 57．GTAGACTGCGTACCAATTCAGT．3EA00+AGA 5’．GTAGACTGCGTACCAATTCAGA一3’EA00+AGG 57。GTAGACTGCGTACCAATTCAGG一3EAOO+ACC 5。．GTAGACTGCGTACCAATTCACC一3EAOO+ATC 5’．GTAGACTGCGTACCAAT丁CATC一3’HM+丁rc 5。．GATGAGTCTAGAACGGTTC一3’HM+TCG 5'-GATGAGTCTAGAACGGTCG．3’HM+TAG 5'-GATGAGTCTAGAACGGTAG．3’592HpalI和MspI的酶切位點(diǎn)均為(CCGG／GGCC)，但二者對酶切位點(diǎn)甲基化修飾敏感性不同，上勿aII能識別并切割未甲基化和外側(cè)胞嘧啶甲基化位點(diǎn)(smCCGG／GGCC)，面不能切割內(nèi)測胞嘧啶HpalI和MspI的酶切位點(diǎn)均為(CCGG／GGCC)，但二者對酶切位點(diǎn)甲基化修飾敏感性不同，上勿aII能識別并切割未甲基化和外側(cè)胞嘧啶甲基化位點(diǎn)(smCCGG／GGCC)，面不能切割內(nèi)測胞嘧啶甲基化位點(diǎn)(csmCGG／GG5mcc)：MspI能識別并切割未甲基化和外側(cè)胞嘧啶甲基化位點(diǎn)，而不能切割外側(cè)胞嘧啶甲基化位點(diǎn)。利用這兩種同裂酶分別與EcoRI組合進(jìn)行MSAP反應(yīng)時(shí)，如果被內(nèi)切酶識別，圖譜上就會顯示有帶，記為“1”；如未被識別則顯示無帶，記為“0”。根據(jù)條帶的有無，可將MSAP選擴(kuò)圖譜條帶分成四大類：“11”表示H和M泳道都有條帶，為I類型，表示未發(fā)生甲基化；“01”表示H泳道無條帶，而M泳道有條帶，為II類型，表示發(fā)生全甲基化；“10”表示H泳道有條帶，而M泳道無條帶，為III類型，表示發(fā)生半甲基化；“00”表示H和M泳道都無條帶，為IV類型，表示沒有CCGG位點(diǎn)存在(李際紅等2011)。1．2．3DNA甲基化變異模式為了更好的分析和統(tǒng)計(jì)胚性愈傷組織與再生苗的DNA甲基化變異模式，我們將大田苗，胚性愈傷組織以及再生苗三種試材之間的DNA甲基化模式變異類型劃分為四種類型：一類是在胚性愈傷組織中DNA甲基化模式已經(jīng)發(fā)生了變異，而再生苗恢復(fù)到之前的甲基化模式；二類是胚性愈傷組織中變異了的DNA甲基化模式在再生苗中可維持；三類足在胚性愈傷組織中已經(jīng)發(fā)生了變異的DNA甲基化模式，在再生苗中卻又發(fā)生新的甲基化變異：四類是在胚性愈傷組織中沒有發(fā)生DNA甲基化模式變異，而再生苗中卻發(fā)生了甲基化模式變異。1．2．4DNA甲基化變異率計(jì)算在兩組內(nèi)切酶消化產(chǎn)物的MSAP擴(kuò)增圖譜中，有一些片段是不同材料共有的片段f非變異片段)，而有些片段中發(fā)生了部分材料片段的變異，稱這些片段為變異片段。DNA甲基化的變異率m)=產(chǎn)生變異的片段數(shù)／(產(chǎn)生變異的片段數(shù)+非變異的片段數(shù)x100。1．2．5甲基化變異片段的回收、克隆及測序采用回收試劑盒(OMEGA)回收所有甲基化變異片段，克隆的甲基化變異片段，與pTZ57R．T(TaKaRa)載體連接，連接反應(yīng)在22℃進(jìn)行；測序由上海生工公司進(jìn)行。將所得的甲基化差異序列用BLASTn程序在NCBI(：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／)上進(jìn)行同源性檢索，以確定其基因功能。2結(jié)果與分析2．1歐石楠的MSAP擴(kuò)增圖譜采用優(yōu)化的MSAP技術(shù)體系，對歐石楠大田苗、胚性愈傷組織以及再生苗進(jìn)行分析，獲得了譜帶清晰，重復(fù)性好，甲基化修飾位點(diǎn)豐富的MSAP擴(kuò)增圖譜(圖1o依據(jù)方法1．2．2中對胞嘧啶甲基化帶型的分類，從64對選擴(kuò)增引物中篩選出的19對引物，共擴(kuò)增產(chǎn)生506條清晰可辨且可重復(fù)的DNA條帶，平均每對引物擴(kuò)增獲得26．63條帶(表21。593M隨刪Ⅲ￡烈SH島iM隨刪Ⅲ￡烈SH島iM口叫髓尉SH涮M凸I叫Ⅲl蹦sHSMX儺誡班f咧s}i瓢圖1 歐石楠基因組DNA的MSAP擴(kuò)增圖譜Fig．1MSAPfingerprintsofgenomicDNAinE1：非甲基化位點(diǎn)：II：全甲基化位點(diǎn)：III：半甲基化位點(diǎn)。CH：CK的EcoRI+坳口11雙酶切：CM：CK的EcoRI+Mspl雙酶切：EH：胚性愈傷組織的EcoRl+HpaII雙酶t：JJ．EM：胚性愈傷組織的EcoRl+MspI雙酶切；SH：再生苗的EcoRl+HpaII雙酶切：SM：再生苗的EcoRI+MspI雙酶切：M：100bp的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)：A～D：不同選擴(kuò)引物擴(kuò)增結(jié)果2．2歐石楠3種試材的DNA甲基化修飾水平由MSAP擴(kuò)增圖譜帶型統(tǒng)計(jì)可知(表2)，大田苗、胚性愈傷組織以及再生苗的全基因組甲基化水平分別為31．42％、27．86％、29．05％，可明顯看出，大田苗的全基因組甲基化水平最高，再生苗次之，胚性愈傷組織最低，由此得出在胚性愈傷組織發(fā)生過程當(dāng)中，以去甲基化為主，而在再生苗誘導(dǎo)過程中卻以重新甲基化為主，使得再生苗甲基化水平與大田苗相接近(圖2)。從外側(cè)胞嘧啶甲基化水平看，胚性愈傷組織的半甲基化水平高于大田苗，說明在胚性愈傷組織發(fā)生過程中，雖然以去甲基化為主，但同時(shí)也存在高頻的外側(cè)胞嘧啶重新甲基化。對比內(nèi)側(cè)胞嘧啶甲基化和外側(cè)胞嘧啶甲基化修飾水平，3種試材的內(nèi)側(cè)胞嘧啶甲基化水平均高于外側(cè)胞嘧啶甲基化水平(圖2)，由此可知DNA甲基化的發(fā)生以雙鏈內(nèi)側(cè)胞嘧啶甲基化為主。表219對MSAP選擴(kuò)引物組合在歐石楠全基因組中的檢測結(jié)果!!!!!：邕旦翌!!：2111望坐竺21i!i!璺竺!i翌g!!堅(jiān)i絲：!!!!壘∑!P巫巴!堅(jiān)12塵!i翌型i2呈：i呈量：絲2絲E引物HM引物 擴(kuò)增位點(diǎn) 娑基化警 s C全甲K基化位E點(diǎn) s弘∞弘∞ 27．86巧∞ 口外側(cè)胞嘧啶／％iii內(nèi)測胞嘧啶／％巧 目全基因組DM／％m00大田茁(cK) 胚性愈傷組織 再生苗圖2DNA甲基化水平／％Fig．2TheDNAmethylatedlevels／％2．3歐石楠3種試材之間的DNA甲基化變異從MSAP圖譜}==顯示的3種試材的DNA甲基化帶型可知，歐石楠大田苗、胚性愈傷組織和再生苗之間存在DNA甲基化變異。從擴(kuò)增出506條帶中，發(fā)生DNA甲基化模式變異的有175條帶，其變異率為34，58％，就其甲基化變異條帶進(jìn)行如下分析。2．3．1胚性愈傷組織與大田苗、再生苗與胚性愈傷組織之間的DNA甲基化變異模式根據(jù)大田苗到胚性愈傷組織、胚性愈傷組織到再生苗之間條帶的變異，可將其分為4大類和12亞類，即A為由未甲基化的位點(diǎn)，到發(fā)生了變化的位點(diǎn)：B為由外側(cè)胞嘧啶半甲基化的位點(diǎn)，其后又發(fā)生了變化的位點(diǎn)；C為由內(nèi)側(cè)胞嘧啶完全甲基化的位點(diǎn)，之后又發(fā)生了變化的位點(diǎn)：D為由外側(cè)胞嘧啶或者內(nèi)側(cè)和外側(cè)胞嘧啶位點(diǎn)均完全甲基化，而下一過程又重新出現(xiàn)帶的位點(diǎn)。175條變異帶的變異模式見表4。表33種歐石楠試材兩者之閶的變異模式!!!!!： !!盟!!i2翌P!垡!翌：!!豎：：：翌!!!壘豎：2翌!!!：i!!：i2墨生：2122：2Class Before Pattern After NumberofbandsH M H M ．r ¨A ● ● 川 ● O 6舵 O ● 3躬 0 0 張m，們 體B ● O 阱 ， ● 。 7陀 O ● ， 6盼 0 0 他c 0 a ， 4曉 ● 0 ¨。。 oQ 0 0 3D O O m ， ， 控眥 ● 0 H∞ 0 ● 9k湛 勰甜m，悅 M條帶的對比分析可知，相對于大田苗，胚性愈傷組織的帶型變異主要表現(xiàn)為新條帶的出現(xiàn)，產(chǎn)生63條新帶，占152個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的41．45％。通過對再生苗和胚性愈傷組織的變異帶分析可知，帶的消失即重新甲基化是在這一過程中主要發(fā)生的事件(表3中A3，B3和C3)。在所有發(fā)生變異的帶型中，內(nèi)外側(cè)甲基化位點(diǎn)的轉(zhuǎn)換頻率最低，即帶(10)和帶(O1)的轉(zhuǎn)換(表3B2和c2)。2．3，2三種試材之間的DNA甲基化變異模式依試驗(yàn)方法3甲基化變異模式的分類，分析獲得的175條變異帶(圖3)可知，再生苗恢復(fù)到595與大田苗帶型一致的有62條帶(圖3；圖4a)，占變異條帶的35．43％，為四種變異類型中所占比例最高的。胚性愈傷組織發(fā)生變異，并在再生苗中可維持的有59條帶(圖3；圖4b)，比例為33．71％，與大田苗帶型一致的有62條帶(圖3；圖4a)，占變異條帶的35．43％，為四種變異類型中所占比例最高的。胚性愈傷組織發(fā)生變異，并在再生苗中可維持的有59條帶(圖3；圖4b)，比例為33．71％，其中以外側(cè)胞嘧啶甲基化變異的遺傳穩(wěn)定性最好。胚性愈傷組織中已經(jīng)發(fā)生了變異，而再生苗中發(fā)生新甲基化變異的比例為18．86％。胚性愈傷組織沒發(fā)生變異，而再生苗卻發(fā)生甲基化模式變異的比例為12％。由以上兩種變異模式可以看出，胚性愈傷組織形成和再生苗誘導(dǎo)兩過程均存在豐富的DNA甲基化變異模式。胚性愈傷組織中發(fā)生的甲基化變異在再生苗中大部分會有所恢復(fù)，而在再生苗中表現(xiàn)的變異多為外側(cè)胞嘧啶半甲基化。4035．4335 33．7130摹25丑捂20咪制15圻10a0第一類 第二類DNA甲基化變異類型圖3胚性愈傷組織、再生苗與大田苗之間的變異模式Fig．3Variationpatternsamongembryogeniecallus，regenerationplantletsandCKc}f淵疆EMs缸sI{ 蹦cMEl!酬slI謝 C鞋烈EH翻SH鋱{旬 專I{鉀勺鉀 氣《。 {寫圖4胚性愈傷組織、再生苗與大田苗的DNA甲基化變異模式的MSAP圖譜Fig．4MSAPfingerprintsofvariationpatternsamongembryogeniccallus，regenerationplantletsandCKI：非甲基化位點(diǎn)；IlI：半甲基化位點(diǎn)：a：第一類；b：第二類；c：第三類捆：第四類A—C：不同選擴(kuò)引物擴(kuò)增結(jié)果2．4DNA甲基化變異片段的回收檢測及序列分析對部分產(chǎn)生甲基化變異的修飾位點(diǎn)進(jìn)行回收克隆，最終成功分離了8條發(fā)生甲基化變異的DNA序列(表4)。BLASTn比對分析表明，這8條甲基化變異序列均檢索到同源系列，包括抗性基因(M5)、蛋白激酶6(MKK6)(M12)、環(huán)斑病(PRSV)外殼蛋白(M19)、茶樹連鎖圖譜中相關(guān)基因(MI1)、質(zhì)體(M20、M30)、切割和多聚腺苷酸化特異性因子亞單位(M24)和大豆轉(zhuǎn)基因無性系(M29)，說明多種類型的基因組DNA序列均存在DNA甲基化修飾現(xiàn)象，可以看出歐石楠體胚誘導(dǎo)發(fā)生過程中發(fā)生了廣泛的甲基化變異。表4甲基化片段序列分析!塾曼!!皇墨!!理!里!!魚!坐!!塾Y!璺!!壘魚翌墨堡!望!!表4甲基化片段序列分析!塾曼!!皇墨!!理!里!!魚!坐!!塾Y!璺!!壘魚翌墨堡!望!!序列 長度／bp 條帶 同源序列 一致性／％ E值3 討論早在1994年，Phillips等就提出，DNA甲基化變化可能是體細(xì)胞無性系變異的一個(gè)重要原因。Shawn等(2000)指出，再生苗及其后代中存在廣泛的DNA甲基化模式變異。Prakash等(2003)利用兩組同裂酶(HpaII和MspI)對矮牽牛葉片再生苗誘導(dǎo)過程中，愈傷組織和再生苗的CCGG位點(diǎn)進(jìn)行酶切分析，得出胞嘧啶甲基化水平與葉片誘導(dǎo)再生苗的能力存在很強(qiáng)的正相關(guān)。本研究利用MSAP技術(shù)，對歐石楠胚性愈傷組織、再生苗與大田苗之間的DNA甲基化水平和模式的變異進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)胚性愈傷組織與大田苗相比，胚性愈傷組織的全基因組DNA甲基化水平有所降低；與胚性愈傷組織的DNA甲基化水平(27．86％)相比，再生苗的DNA甲基化水平(29．05％)有所回升，接近大田苗的甲基化水平(31．42％)。本研究得到的胚性愈傷組織甲基化水平的變異趨勢，與大豆_(Quemada等1987)、玉米(Kaeppler和Phillipsl993)、刺五加(Chakrabany等2003)、油棕(Kubis等2003)以及大麥(Li等2007)等的報(bào)道一致，卻與香蕉(Peraza．Echeverria等2001)和豌_再(Smykal等2007)上的研究結(jié)論不同。觀察歐石楠通過體胚誘導(dǎo)繁育獲得的再生苗的甲基化水平變化，可以推知其遺傳穩(wěn)定性較高。Kubis等(2003)冪0用HPLC對油棕愈傷組織和再生苗甲基化變異進(jìn)行檢測得出，愈傷組織形成過程中，全基因組DNA甲基化水平有所下降，但再生苗中會部分恢復(fù)，并接近正常苗水平。由此推知不同植物無性系繁殖獲得再生植株過程中，存在相似的甲基化水平變異趨勢。歐石楠胚性愈傷組織的全基因組DNA甲基化水平雖然有所降低，但其外側(cè)胞嘧啶甲基化水平卻有所增加，再生苗中也持續(xù)此變化(圖3)。與苗高健(2009)在水稻上的研究結(jié)論一致，而xu等(2004)在玫瑰愈傷組織中檢測發(fā)現(xiàn)，其外側(cè)胞嘧啶甲基化水平顯著下降，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論存在分歧；再生苗又恢復(fù)到之前的DNA甲基化模式，與歐石楠再生苗誘導(dǎo)形成過程中甲基化水平變異模式一致。關(guān)于愈傷組織形成過程中DNA甲基化水平的變異雖然存在多種報(bào)道，但再生苗誘導(dǎo)發(fā)生過程中大多數(shù)變異逐漸恢復(fù)的趨勢卻是一致的。這可能與愈傷組織培養(yǎng)過程中所用的外源激素有關(guān)。對歐石楠組織培養(yǎng)發(fā)生的胚性愈傷組織和誘導(dǎo)形成的再生苗的胞嘧啶甲基化變異模式具體類型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)生變異的175條帶中，有62條(35．43％)在胚性愈傷組織形成過程中發(fā)生變異的條帶又恢復(fù)到之前大田苗的甲基化模式，與聶麗娟(2008)對菊花的報(bào)道一致；另一方面，175條變異帶中33．71％的變異帶型卻可在再生苗中持續(xù)下去，大部分為外側(cè)胞嘧啶甲基化，與番茄(Smulders等1995)研究結(jié)論一致。Smulders等(1995)幣0用探針技術(shù)對番茄愈傷組織和再生苗葉片甲基化模式進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)沒有發(fā)生內(nèi)測胞嘧啶甲基化變異，僅存在外側(cè)胞嘧碇甲基化變異，且在再生苗中可以部分持續(xù)，且遺傳給后代，雖與本實(shí)驗(yàn)所用研究技術(shù)不同，但卻獲得與本實(shí)驗(yàn)一致的結(jié)論，進(jìn)一步說明，胚性愈傷組織發(fā)生過程中存在此類甲基化變異現(xiàn)象，且可部分遺傳，其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)中取得了8條存在有效比對結(jié)果的序列，涉及抗性基因、蛋白激酶、質(zhì)體基因等多種基因，這些基因都存在甲基化變異修飾現(xiàn)象。參考文獻(xiàn)[1]鮑智娟植物組織培養(yǎng)巾體細(xì)胞無性系變異的研究進(jìn)展．白城師范學(xué)院學(xué)，2009，23(6)[2]李際紅，邢世巖’，王聰聰，張侍，付茵茵。銀杏基因組DNA甲基化修飾位點(diǎn)的MSAP分板．園藝學(xué)搬，201l，38(8)：1429～1436[3]李際紅，邢世巖+，姚培娟，譚起航，王海林歐石楠體細(xì)胞胚發(fā)生和植株再生．植物生理學(xué)報(bào)，2012，48(11)：1043～1049597[4]孟凡志，徐力，戴百榮，趙祥文歐石楠的適應(yīng)性及其栽培．山東林業(yè)科技，2004，f4)·33～34[5]苗高健水稻胚性愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生伴隨DNA胞嘧啶甲基化的減少和恢復(fù)f學(xué)位論文]長春：東北師范大學(xué)，2009[4]孟凡志，徐力，戴百榮，趙祥文歐石楠的適應(yīng)性及其栽培．山東林業(yè)科技，2004，f4)·33～34[5]苗高健水稻胚性愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生伴隨DNA胞嘧啶甲基化的減少和恢復(fù)f學(xué)位論文]長春：東北師范大學(xué)，2009【6j聶麗娟，王子成，何艷霞菊花組織培養(yǎng)繼代過程中的DNA甲基化變化園藝學(xué)報(bào)，2008，35f“)：1689-1694[7]沙文勇歐洲常綠地被植物 歐石楠和彩萼石桶．中國花卉園藝，2002，(9)14～15[8]魏華麗，吳濤，楊文華，李萬峰，張俊紅，齊力旺，韓素英．落葉松體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中DNA甲基化模式變化分析．東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011．39(2)：33～37f9]AmirAK，UreaRS，MidhzarAK，MaziahM，SreeramananS，DetectionofsomaclonalvariationbyrandomamplifiedpolymorphicDNAanalysisduringmicropropagationofPhalaenopsisbelhna(Rchb．f)christensonAfricanJoumalofBIotechnoIogy，2010，9(40t：6632—6639f10]ChakrabartyD，YuKWPaekKY．DetectionofDNAmethylationchangesduringsomaticembryogenesisofSiberianginseng(Eleuterococcussenticosus)PlantSci．2003，165：61-68『11]FragaHPF,VieiraLN，CaprestanoCA，SteinmacherDA，MickeGA，SpudeitDA，PescadorR，GuerraMP5-Azacytidinecombinedwith2,4-DimprovessomaticembryogenesisofAccasellowianaf0Ber91BurretbymeansofchangesinglobalDNAmethylationlevelsPlantCellReports，2012，3Jf12)：2165-2176[12]GaoX，YangD，CaoD，AoM，SuiX，WangQ，KimamIN，WangL．InVitroMicropropagationofFreesiahybridaandtheAssessmentofGeneticandEpigeneticStabilityinRegeneratedPlantlets．JournalofPlantGrowthRegulation，2010．29f3、：257～267f13]HardingK．ThemethylationofDNAderivedfrompotatoplantsrecoveredfromslowgrowth．PlantCellTissOrgCult．1994．37：3l～38【14]KaepplerSM，KaepplerHF,RheeYEpigeneticaspectsofsomacionalvariationinplantsPlantMolBio／，2000．43：17％188n5]KaepplerSM，PhillipsPL．Tissueculture．inducedDNAmethylationvariationinmaize．ProcNatlAcadSciUSA，1993．90：8773～8776f16]KubisSE，CastilhoAM，VershininAV,Heslop．HarrisonJS．Retroelements，transposonsandmethylationstatusinthegenomeofoilpalm(ElaeisguineensislandtherelationshipsomaclonaIvariation．PlantMolecularBiology、2003．52：69-79[17]LiA，HuBQ，XueZY,ChenL，WangWX，SongWQ，ChenCB，WangCG．DNAMethylationingenomesofseveralannualherbaceousandwoodyperennialp／antsofvaryingploidydetectedbyMSAEPJan￡MolecularBiologyReporter,20t1、29f4)：784--793[1g]LiXL，YuXM，WangNN，F(xiàn)engQZ，LiuLx，Shen幾，LiuBGeneticandepigeneticinstabilitiesinducedbytissuecultureinwildbarley(Hordeumbrevisubulatum(Trin．)Link)PlantCellTissOrganCult，2007，90：153～168『19]LoSchiavoF，PittoL，GiulianoG．，TortiG．，Nuti-Ronehiv'MarazattiD，VergaraR，OrselliS，TerziMDNAmethylationofembryogeniccellculturesanditsvariationscausedbymutation，differentiation，hormones，andhypomethylatingdrugsTheorApplGenet．1989．77：325-33IMallayaNP,RavishankarGA、Invitropropagationandgeneticfidelitystudyofplantregeneratedfrominvegedhypocotylexplantsofeggplant(SolanummelongenaL)cv、ArkaShirish．3Biotech，2013，3(1)：45-52『20]Peraza—EcheverriaS，Herrera—ValenciaVA，Tames．KayA．Detec