氨基酸類藥物的制備

第二章生化藥物制備工藝第一節(jié)氨基酸類藥物的制備第二節(jié)多肽與蛋白質(zhì)類藥物的制備第三節(jié)核酸類藥物的制備第四節(jié)酶類藥物的制備第五節(jié)糖類藥物的制備第六節(jié)脂類藥物的制備第七節(jié)維生素與輔酶類藥物的制備第二篇重要生物藥物制備工藝第一節(jié)氨基酸類藥物的制備一、氨基酸及其衍生物在醫(yī)藥中的應(yīng)用

氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本組成單位，蛋白質(zhì)的生物功能與構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸種類、數(shù)量、排列順序及由其形成的空間構(gòu)象有密切的關(guān)系。

氨基酸通過體內(nèi)轉(zhuǎn)化而維持其動態(tài)平衡，若其動態(tài)平衡失調(diào)，則機體代謝紊亂，甚至引起病變。必需氨基酸：人及哺乳動物自身不能合成，需由食物供應(yīng)。氨基酸具有豐富的營養(yǎng)價值，能治療多種疾病，氨基酸及其衍生物能夠治療消化道疾病、肝病、腦及神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤和其它與氨基酸相關(guān)聯(lián)的疾病。二、氨基酸類藥物的生產(chǎn)方法

1、目前全世界天然氨基酸的年總產(chǎn)量在百萬噸左右，其中產(chǎn)量較大者有谷氨酸、蛋氨酸及賴氨酸，其次為天門冬氨酸、苯丙氨酸及胱氨酸等。它們主要用于醫(yī)藥、食品、飼料及化工行業(yè)中。2、氨基酸的生產(chǎn)方法有天然蛋白質(zhì)水解法、發(fā)酵法、酶轉(zhuǎn)化法及化學(xué)合成法等四種。3、氨基酸及其衍生物類藥物已有百種之多，但主要是以20種氨基酸為原料經(jīng)酯化、酰化、取代及成鹽等化學(xué)方法或酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)。（一）水解法1、基本原理與過程

以毛發(fā)、血粉及廢蠶絲等蛋白質(zhì)為原料，通過酸、堿或酶水解成多種氨基酸混合物，經(jīng)分離純化獲得各種藥用氨基酸的方法稱為水解法。目前用水解法生產(chǎn)的氨基酸有L-胱氨酸、L-精氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-組氨酸、L-脯氨酸及L-絲氨酸等。水解法生產(chǎn)氨基酸的主要過程為水解、分離和結(jié)晶精制三個步驟。

（1）蛋白質(zhì)水解方法

目前蛋白質(zhì)水解分為酸水解法、堿水解法及酶水解法三種。①酸水解法：蛋白質(zhì)原料用6～10mol／L鹽酸或8mol／L硫酸于110～120℃（回流煮沸）水解12～24h，除酸后即得多種氨基酸混合物。此法優(yōu)點是水解迅速而徹底，產(chǎn)物全部為L-型氨基酸，無消旋作用。缺點是色氨酸全部被破壞，絲氨酸及酪氨酸部分被破壞，且產(chǎn)生大量廢酸污染環(huán)境。工業(yè)上較普遍采用。②堿水解法：蛋白質(zhì)原料經(jīng)6mol／L氫氧化鈉或4mol／L氫氧化鋇于100℃水解6h即得多種氨基酸混合物。該法水解迅速而徹底，且色氨酸不被破壞，但含羥基或巰基的氨基酸全部被破壞，且產(chǎn)生消旋作用。工業(yè)上多不采用。③酶水解法：蛋白質(zhì)原料在一定pH和溫度條件下經(jīng)蛋白水解酶作用分解成氨基酸和小肽的過程稱為酶水解法。此法優(yōu)點為反應(yīng)條件溫和，無需特殊設(shè)備，氨基酸不破壞，無消旋作用。缺點是水解不徹底，產(chǎn)物中除氨基酸外，尚含較多肽類。工業(yè)上很少用該法生產(chǎn)氨基酸而主要用于生產(chǎn)水解蛋白及蛋白胨。（2）氨基酸分離方法

氨基酸分離方法較多，通常有溶解度法、等電點沉淀法、特殊試劑沉淀法、吸附法及離子交換法等。

①溶解度法：是依據(jù)不同氨基酸在水中或其它溶劑中的溶解度差異而進行分離的方法。

胱氨酸和酪氨酸均難溶于水，但在熱水中酪氨酸溶解度較大，而胱氨酸溶解度變化不大，故可將混合物中胱氨酸、酪氨酸及其它氨基酸彼此分開。

②特殊試劑沉淀法：系采用某些有機或無機試劑與相應(yīng)氨基酸形成不溶性衍生物的分離方法。③吸附法：是利用吸附劑對不同氨基酸吸附力的差異進行分離的方法。如顆?；钚蕴繉Ρ奖彼?、酪氨酸及色氨酸的吸附力大于對其它非芳香族氨基酸的吸附力，故可從氨基酸混合液中將上述氨基酸分離出來。

④離子交換法：是利用離子交換劑對不同氨基酸吸附能力的差異進行分離的方法。氨基酸為兩性電解質(zhì)，在特定條件下，不同氨基酸的帶電性質(zhì)及解離狀態(tài)不同，故同一種離子交換劑對不同氨基酸的吸附力不同。（3）氨基酸的精制方法

分離出的特定氨基酸中常含有少量其它雜質(zhì)，需進行精制，常用的有結(jié)晶和重結(jié)晶技術(shù)，也可采用溶解度法或結(jié)晶與溶解度法相結(jié)合的技術(shù)。丙氨酸在稀乙醇或甲醇中溶解度較小，且pI為6.0，故丙氨酸可在pH6.0時，用50％冷乙醇結(jié)晶或重結(jié)晶加以精制。

溶解度與結(jié)晶技術(shù)相結(jié)合的方法精制氨基酸。如在沸水中苯丙氨酸溶解度大于酪氨酸100倍，若將含少量酪氨酸的苯丙氨酸粗品溶于15倍體積（w／v）的熱水中，調(diào)pH4.0左右，經(jīng)脫色過濾可除去大部分酪氨酸；濾液濃縮至原體積的1／3，加2倍體積（v／v）的95％乙醇，4℃放置，濾取結(jié)晶，用95%乙醇洗滌，烘干即得苯丙氨酸精品。2、用水解法生產(chǎn)氨基酸的品種及工藝

絕大多數(shù)氨基酸均可采用酸水解法生產(chǎn)，但目前由于發(fā)酵方法及酶工程技術(shù)的迅速發(fā)展，僅有幾種氨基酸仍采用酸水解法生產(chǎn)?，F(xiàn)胱氨酸與亮氨酸生產(chǎn)為例。L-胱氨酸（L-Cystine，L-Cys2）的制備：

（1）L-胱氨酸的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)：以毛、發(fā)及蹄甲等角蛋白中含量最多。其分子由兩分子半胱氨酸脫氫氧化而成，結(jié)構(gòu)為：L-胱胱氨氨酸酸自自稀稀酸酸中中形形成成六角形或六角柱形形晶體，分解點258~261℃，pI為5.05，〔αα〕25D為-232°。在25℃水中溶解解度為0.011，在75℃水中為0.052。溶于無無機酸及及無機堿堿，在熱堿液中中可被分分解。不溶于于乙醇、乙乙醚及丙丙酮?？杀贿€原為L-半胱胱氨酸。（2）工工藝路線線（3）工工藝過程程①水解：在1-1.5h內(nèi)升升溫至110～～117℃水解解7h（自100℃時時計）后后出料,玻璃布過過濾,收集濾濾液。②中和：用30%工業(yè)業(yè)堿調(diào)至至pH4.8，靜靜置36h，滌綸布布濾取沉沉淀，離離心甩干干得L-胱氨酸酸粗品Ⅰ。③粗制：加入10mol/L鹽酸、、水，升升溫至65～70℃，，攪拌0.5小小時，加加活性炭炭16kg/0.2t粗品Ⅰ，于80～90℃保溫溫0.5h，濾濾除活性性炭。用用30%工業(yè)堿堿調(diào)濾液液至pH4.8，靜置置結(jié)晶，，吸出上上清液后后，底部部沉淀經(jīng)經(jīng)離心甩甩干得胱胱氨酸粗粗品（ⅡⅡ）。④精制、、中和：粗品Ⅱ加加入1mol/LHCl，升溫至70℃，，加活性性炭1.5～2.5kg/50kg粗品Ⅱ，85℃℃攪拌0.5h，過濾濾，加1.5倍倍體積蒸蒸餾水，，升溫至至75～～80℃℃，攪拌拌下用12％氨氨水（化化學(xué)純））中和至至pH3.5～～4.0，析出出結(jié)晶，，濾取胱胱氨酸結(jié)結(jié)晶，蒸蒸餾水洗洗至無氯氯離子，，真空干干燥得L-胱氨氨酸成品品。⑤檢驗與含量測定定：應(yīng)為六六角形或或六角柱柱形白色色結(jié)晶，，含量在在98.5％以以上，干干燥失重重小于0.5％％，熾灼灼殘渣小小于0.2％，，氯化物物小于0.15％，鐵鐵鹽小于于0.001％％，重金金屬小于于20ppm。。⑥作用與與用途：L-胱胱氨酸具具有增強造血血機能、、升高白白細胞、、促進皮皮膚損傷傷的修復(fù)復(fù)及抗輻輻射作用用。臨床上上用于治治療輻射損傷傷、重金金屬中毒毒、慢性性肝炎、、牛皮癬癬及病后或產(chǎn)產(chǎn)后繼發(fā)發(fā)性脫發(fā)發(fā)。L-亮氨氨酸（L-Leucine，，L-leu））的制備備（自學(xué)學(xué)）(二)發(fā)發(fā)酵法1、基本本原理與與過程工業(yè)上，，發(fā)酵實實質(zhì)上是是利用微微生物細細胞中酶酶的作用用，將培培養(yǎng)基中中有機物物轉(zhuǎn)化為為細胞或或其它有有機物的的過程。。利用微生生物代謝謝中間產(chǎn)產(chǎn)物加入入NH3或HNO3，合成氨氨基酸。。★初生氨基基酸：微生物物通過固氮作用用、硝酸酸還原及自外界界吸收氨氨使酮酸氨基基化成相應(yīng)的的氨基酸酸，或微微生物通通過轉(zhuǎn)氨酶作用，將將一種氨氨基酸的的氨基轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移到另另一種酮酸上，生成成的新氨氨基酸也也稱為初生氨基基酸?！锎紊被幔涸谖⑸镒饔糜孟?，以以初生氨氨基酸為為前體轉(zhuǎn)化成的其它它氨基酸酸。大多數(shù)氨氨基酸均均可通過過以初生生氨基酸酸為原料料的微生生物轉(zhuǎn)化化作用而而產(chǎn)生。。2、發(fā)酵酵法生產(chǎn)產(chǎn)的氨基基酸品種種及工藝藝微生生物物利利用用碳碳源源、、氮氮源源及及鹽鹽類類幾幾乎乎可可合合成成所所有有氨氨基基酸酸。目前前絕絕大大部部分分氨氨基基酸酸皆皆可可通通過過發(fā)酵酵法法生產(chǎn)產(chǎn)，，其其缺點點是產(chǎn)產(chǎn)物物濃濃度度低低，，設(shè)設(shè)備備投投資資大大，，工工藝藝管管理理要要求求嚴嚴格格，，生生產(chǎn)產(chǎn)周周期期長長，，成成本本高高。。本本文文僅僅以以L-異異亮亮氨氨酸酸直直接接發(fā)發(fā)酵酵法法為為例例，，說說明明發(fā)發(fā)酵酵法法的的基基本本過過程程。。L-異異亮亮氨氨酸酸（（L-Isoleucine，，L-Ile））的的制制備備（1））L-異異亮亮氨氨酸酸的的結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)與與性性質(zhì)質(zhì)：L-Ile存存在在子子所所有有蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)中中，，為為人體體必必需需氨氨基基酸酸之一一，，分分子子式式為為C6H13NO2，分分子子量量為為131.17，，結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)式式為為：：L-Ile在在乙乙醇醇中中形形成成菱形形葉葉片片狀狀或片狀狀晶體體，，分分解解點點為為285～～286℃℃，，L-Ile溶于于熱熱醋醋酸酸，在在20℃℃乙醇醇中溶溶解解度度為為0.072，，在在25℃℃水水中中為為4.12，，在在75℃℃水水中中為為6.08，，不不溶溶于于乙乙醚醚。。（2）工藝藝路線（3）工藝藝過程①

菌種種培養(yǎng)種子培養(yǎng)基基組成（%）為：葡萄糖2尿尿素0.3玉玉米漿2.5豆餅水解液液0.1（（以干豆餅餅計）pH6.5。二級種子培培養(yǎng)基另加加菜籽油0.4，其其余同一級級種子培養(yǎng)養(yǎng)基。一級種子培培養(yǎng)：1000ml三解瓶中中培養(yǎng)基裝裝量為200ml，，接種一環(huán)環(huán)牛肉膏斜斜面AS1.998菌種，搖搖床30℃℃培養(yǎng)（沖沖程7cm，頻率105次／／min））16h。。二級種子培培養(yǎng)：接種種量3.5％，培養(yǎng)養(yǎng)8h，如如此逐級放大培養(yǎng)得得足夠量菌菌種。②滅菌、發(fā)酵酵發(fā)酵培養(yǎng)液液組成（%）為:硫酸銨4.5豆豆餅水解解液0.4，玉玉米漿2.0碳酸鈣4.5pH7.2，淀粉粉水解還原原糖初糖濃濃度11.5。在5m3發(fā)酵罐中添添加3噸發(fā)發(fā)酵培養(yǎng)液液，加熱至至118～～120℃℃，維持在在1.1××105Pa壓力，，滅菌30min，，立即通冰鹽水冷卻卻至25℃。。接入1％％菌種（v／v），，維持180轉(zhuǎn)／min的攪攪拌速度，，升溫至30～31℃，以0.2L／（min·L））通氣量發(fā)發(fā)酵60h，在24～50h之間不斷斷補加尿素至0.6，，氨水至0.27。。③除菌體體、酸化發(fā)酵結(jié)束后后，發(fā)酵液液加熱至100℃并并維持10min，，冷卻過濾濾，濾液加加工業(yè)硫酸酸和草酸至至pH3.5，過濾濾除沉淀。。④離子交交換、吸附附分離上述濾液每每分鐘以樹脂量1.5％的的流速進H十-型732離子交換換柱（Φ40××100cm），以以100L去去離子水洗洗柱，再以60℃、0.5mol／L氨氨水按3L/min的流速進進行洗脫，分部收集集洗脫液。。⑤濃縮趕趕氨合并pH3～12的的洗脫液，，70～80℃減壓蒸餾餾、濃縮縮至粘稠狀狀，加去去離子水水至原體體積的1／4，，再濃縮縮至粘稠稠狀。如如此重復(fù)復(fù)三次。。⑥脫色色、濃縮縮、中和和上述濃縮縮物加去去離子水水至原體體積的1／4，，攪拌均均勻，加加2mol／L鹽酸調(diào)pH3.5，加上1％（w／v））活性炭，70℃℃攪拌脫色1h。濾濾除活性性炭，濾濾液減壓壓濃縮至至適當體體積，用用2mol／L氨水調(diào)pH6.0，5℃沉淀淀過夜,過濾抽抽干，105℃℃烘干得得：L-異亮氨氨酸半成成品。⑦精制、、烘干每10kgL-異亮亮氨酸半半成品加加8L濃鹽酸和20L去離子水水，加熱至至80℃℃，攪拌拌溶解，，加10kg氯化化鈉鈉至飽飽和和，，加加工工業(yè)業(yè)堿液液調(diào)調(diào)pH10.5，過過濾濾，，濾濾液液用用堿堿調(diào)調(diào)pH1.5，，5℃℃放放置置過過夜夜。。濾濾取取沉沉淀淀，，用用80L，，去去離離子子水水加加熱熱至至80℃℃攪攪拌拌溶溶解解，，加加適適量量氯化化鈉鈉和1%（（w／／v））活性性炭炭，70℃℃攪攪拌拌脫色色lh過過濾濾，，濾濾液液減減壓壓濃濃縮縮至至適適當當濃濃度度，，用用氨水水調(diào)調(diào)pH6.0，，5℃℃放放置置結(jié)結(jié)晶晶過過夜夜。次次日日過過濾濾收收集集結(jié)結(jié)晶晶，，抽抽干干，，于于105℃℃烘烘房房中中烘烘干干得得L-異異亮亮氨氨酸酸成成品品。。（4））檢檢驗驗應(yīng)為為菱形形葉葉片片狀或或片狀狀晶體體，，含含量量應(yīng)應(yīng)為為98.5％％～～101.5％％，，干干燥燥失失重重不不超超過過0.3％％，，熾灼灼殘殘渣渣不大大于于含含量量測測定定與與L-亮亮氨氨酸酸的的規(guī)規(guī)定定相相同同。。氯化化物物低低于于0.05％％，，硫硫酸酸鹽鹽低低于于0.03％％，，鐵鐵鹽鹽低低于于0.003％％,重重金金屬屬低低于于0.0015％％，，砷砷鹽鹽低低于于1.5ppm。。（5））作作用用與與用用途途L-Ile為為必必需需氨氨基基酸酸，，是是復(fù)復(fù)方方氨氨基基酸酸輸輸液液的的重重要要成成份份之之一一。。（三三））酶酶轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化法法（（自自學(xué)學(xué)））（四四））化化學(xué)學(xué)合合成成法法（（自自學(xué)學(xué)））三、、氨氨基基酸酸輸輸液液氨基基酸酸輸輸液液：：多種種結(jié)結(jié)晶晶L-氨氨基基酸酸依依特特定定比比例例混混合合制制成成的的靜靜脈脈內(nèi)內(nèi)輸輸注注液液。氨氨基基酸酸輸輸液液可可直直接接注注入入血血液液中中，，促進進蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)、、酶酶及及肽肽類類激激素素的的合合成成，，提提高高血血漿漿蛋蛋白白濃濃度度與與組組織織蛋蛋白白含含量量，，維維持持氮氮平平衡衡，，調(diào)調(diào)節(jié)節(jié)肌肌體體正正常常代代謝謝?！，F(xiàn)已已有有含含氨氨基基酸酸數(shù)數(shù)目目為為11、、14、、17、、18及及20、、21種種等等多多種種輸輸液液類類型型，，氨氨基基酸酸濃濃度度分分別別有有3％％、、5％％、、9％％、、10％％及及12％％等等多多種種規(guī)規(guī)格格。。有些些氨氨基基酸酸輸輸液液還還加加入入山梨梨醇醇、、木木糖糖、、維維生生素素、、Na＋、K＋、Ca2+或Mg2+等成成分分，以以補補充充能能量量，，提提高高氨氨基基酸酸的的利利用用率率及及其其營營養(yǎng)養(yǎng)價價值值，，也也有有些些氨氨基基酸酸輸輸液液與與右旋旋糖糖酐酐配伍伍制制成成較較理理想想的的代血血漿漿。（一一））氨氨基基酸酸輸輸液液的的組組成成與與要要求求輸入入人人體體的的氨氨基基酸酸種類類、、數(shù)數(shù)量量及及比比例例需符符合合機機體體要要求求，，否否則則利用用度度將將下下降降，還會引起起代謝失調(diào)、、拮抗及中中毒等代謝并發(fā)發(fā)癥。1、組方原原理與模式式體內(nèi)蛋白質(zhì)質(zhì)處于連續(xù)分解與與合成的動動態(tài)平衡狀狀態(tài)，故氨基酸酸輸液以被被患者的有有效利用為為度。目前前國內(nèi)外生生產(chǎn)氨基酸酸輸液組方方多采用人乳、、全蛋白、、FAO、、FA○-WHO或或血漿游離離氨基酸模模式。組方中必須含8種種必需氨基基酸和2種種半必需氨氨基酸，所有氨基基酸均為L-型。另另外，組方方中尚需含含5％山梨梨醇或木糖糖醇，以補補充能量、、促進氨基基酸的吸收收和利用，，同時加半胱氨酸作作為穩(wěn)定劑劑，由此方能能構(gòu)成優(yōu)良良的氨基酸酸輸液。2、處方中中氨基酸的的組成與比比例（1）氨氨基酸的構(gòu)構(gòu)型最理想的情情況是全部部使用L-氨基酸酸配制輸液。。（2）必需需氨基酸與與非必需氨氨基酸的比比例非必需氨基基酸可由必必需氨基酸酸或碳水化化合物轉(zhuǎn)化化而來，補補充非必需需氨基酸可可減少體內(nèi)內(nèi)必需氨基基酸的消耗耗。輸液中中必需氨基酸酸（E）與與非必需氨氨基酸（N）之比（（E／N））依具體情情況而定。。一般在1：1～1：3之間間；必需氨基酸酸（E）占占總氨基酸酸的50％％～75％％；必需氨氨基酸（E）與總氮氮量（T））之比以3為宜。國內(nèi)氨基酸酸輸液的總含氮量為為0.6％％～0.8％。（二）氨基基酸輸液配配制復(fù)方方氨氨基基酸酸配配方方種種類類較較多多，，配配制制方方法法亦亦不不盡盡相相同同。。但但其其過過程程均需需活活性性炭炭脫脫色色，且且需需維維持持一一定定pH范范圍圍。。活活性性炭炭對對芳芳香香族族氨氨基基酸酸吸吸附附力力強強，，引引起起損損失失，，使使其其含含量量下下降降，，故故配配料料時時需需將芳芳香香族族氨氨基基酸酸用用量量增增加加20%以以彌彌補補損損失失，或?qū)⒒罨钚孕蕴刻肯认扔糜?％％苯苯丙丙氨氨酸酸吸吸附附飽飽和和后后再再應(yīng)應(yīng)用用。輸輸液液的的pH值值一一般般在在4.0～～6.0為適適宜宜，，pH5.5最最佳佳，，酸酸度度過過大大或或接接近近中中性性皆皆影影響響色色澤澤和和產(chǎn)產(chǎn)品品質(zhì)質(zhì)量量。。復(fù)方方氨氨基基酸酸輸輸液液配配制制工工藝藝1、、穩(wěn)穩(wěn)定定及及難難溶溶氨氨基基酸酸的的溶溶解解：取新鮮鮮注射用用水（約約全量的的2／3）于容容器中，，加溫至至90℃℃，將亮亮氨酸、、異亮氨氨酸、蛋蛋氨酸、、苯丙氨氨酸、纈纈氨酸、、天冬氨氨酸及谷谷氨酸依依次投入入，充分分攪拌溶溶解，停停止加熱熱，加入入色氨酸酸攪拌溶溶解。2、加易易溶氨基基酸及穩(wěn)穩(wěn)定劑：：投入其它它易溶氨氨基酸及及穩(wěn)定劑劑（亞硫酸酸氫鈉及及半胱氨氨酸各加加至全量量濃