實(shí)驗(yàn)三 細(xì)胞吞噬及ACP染色課件

實(shí)驗(yàn)三

細(xì)胞吞噬和酸性磷酸酶染色（Gomori氏法）

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?．通過觀察四膜蟲吞噬碳粒和豆奶的過程，加深對“細(xì)胞吞噬”的理解。2．明確酸性磷酸酶(Acidphosphatase

)與溶酶體的關(guān)系，理解溶酶體的生理意義。3.掌握酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)中Gomori法的原理和基本操作。二、實(shí)驗(yàn)原理

1.細(xì)胞的胞吞作用（endocytosis）2.溶酶體（lysosome

）3.酶細(xì)胞化學(xué)

胞吞作用（endocytosis）

通過質(zhì)膜內(nèi)陷形成囊泡，將外界物質(zhì)裹進(jìn)并輸入細(xì)胞的過程。

胞飲作用（pinocytosis）：溶液、小吞噬作用（phagocytosis）：顆粒、大根據(jù)形成的胞吞泡的大小和胞吞物質(zhì)，胞吞分為兩種類型：胞飲泡和吞噬泡形成的機(jī)制完全不同胞飲泡的形成吞噬泡的形成AdaptorproteincomplexClathrin網(wǎng)格蛋白Triskelion三腳蛋白復(fù)合體DynaminHSC70、auxilin微絲及其結(jié)合蛋白吞噬作用是生物體最古老的，也是最基本的防衛(wèi)機(jī)制之一。是很多原生動(dòng)物攝取營養(yǎng)的方式之一，原生動(dòng)物門是動(dòng)物界重最低等的一類真核單細(xì)胞動(dòng)物，個(gè)體由單個(gè)細(xì)胞組成。通過鞭毛、纖毛或者偽足進(jìn)行吞噬營養(yǎng)。多細(xì)胞動(dòng)物中，只有某些特化的細(xì)胞具有吞噬作用：中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的吞噬作用很強(qiáng)，嗜酸性粒細(xì)胞雖然游走性很強(qiáng)，但吞噬能力較弱。它們在防御微生物的侵染和清除衰老細(xì)胞或凋亡細(xì)胞方面具重要的意義。

四膜蟲的吞噬活動(dòng)活躍且吞噬泡易于分離，是一個(gè)研究吞噬作用的良好模型。四膜蟲又可以進(jìn)行大規(guī)模廉價(jià)的培養(yǎng)，是實(shí)驗(yàn)用很好的材料。溶酶體由單位膜包圍，直徑0.25~1μm不等。溶酶體含有核酸酶、蛋白酶、糖苷酶、酯酶、磷酸酶和硫酸酯酶六大類50多種水解酶，最適pH在5.0，故均為酸性水解酶。

其中，酸性磷酸酶是溶酶體的標(biāo)志性酶。酶是生物催化劑。酶有高度的特異性，它僅作用于一種或一類底物。因而，將酶催化其底物形成的最終產(chǎn)物顯示出來，也就間接地顯示了酶。酶細(xì)胞化學(xué)是利用酶催化反應(yīng)形成的產(chǎn)物能在光鏡或電鏡下被識別的原理，來研究酶在組織細(xì)胞內(nèi)的定位及其活性變化的技術(shù)。酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)★影響酶活性的因素1）溫度高于37℃時(shí)酶往往失去活性，通常合適的溫度是4-37℃。制作酶細(xì)胞化學(xué)的標(biāo)本時(shí)，要求既要使細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)保存良好，又要保持酶的活性。影響因素有：3）新鮮組織的制片或冰凍切片2）pH值酶的作用液通常采用恰當(dāng)pH值的一定緩沖液來配置。4）固定劑常采用甲醛、多聚甲醛或戊二醛固定，對酶的活性影響小。酸性磷酸酶的顯示原理溶酶體含多種酸性水解酶，酸性磷酸酶（acidphosphatase，ACP）是溶酶體的標(biāo)志性酶。利用酸性磷酸酶與底物反應(yīng)后形成的棕黑色沉淀，可以顯示溶酶體的分布。在溶酶體膜穩(wěn)定完整時(shí)，底物不易滲入，ACP活力微弱或無活性。經(jīng)固定，膜本身變?yōu)椴环€(wěn)定，逐漸改變其滲透性，底物可以滲入，在合適pH條件下，酶活力被顯示。反應(yīng)過程：酸性磷酸酶在pH4.5~5.5時(shí)起作用，分解β-甘油磷酸釋放出磷酸基團(tuán)，磷酸與鉛離子結(jié)合生成無色的磷酸鹽沉淀，磷酸鹽再與硫化銨作用，生成棕黑色的硫化鉛沉淀，從而顯示出酸性磷酸酶所在的位置。β-甘油磷酸鈉甘油+PO43-2PO43–+3Pb(NO3)2

Pb3(PO4)2

+6NO3-Pb3(PO4)2+3(NH4)2S3PbS

（棕黑色）+2(NH4)3PO4如何設(shè)計(jì)對照組？對照1：將標(biāo)本放入高溫，使酶失活。對照2：工作液中不加甘油磷酸鈉，以蒸餾水代替。對照3：氟化鈉是酸性磷酸酶的抑制劑，可在工作液中加入（終濃度10mmol/L）。1．四膜蟲呼吸需要氧氣，因而在培養(yǎng)液中聚集在液面上方?？梢詫χ饩€觀察。2.注意吸取四膜蟲時(shí)將溶液混勻（可以用移液器吸出100ul再吹入溶液中，反復(fù)3次，注意不要吹出氣泡?。?。3.吸取四膜蟲培養(yǎng)液100μl加入到含有2%豆奶液的離心管中，反復(fù)吹打3次混勻，蓋好管蓋，管蓋上做本組標(biāo)記，放置7分鐘。（此步是讓四膜蟲胞飲或吞噬豆奶，激活溶酶體）四、實(shí)驗(yàn)步驟4．3000rpm離心1分鐘，謹(jǐn)慎取出離心管，不要晃動(dòng)液體，迅速吸取上清100μl（沿離心管側(cè)壁從上往底部吸取，小心不要攪動(dòng)底部的沉淀物），將這100ul豆奶液棄入水槽。然后吸取余下100ul液體，對著底部沉淀緩慢吹打，如此反復(fù)幾次，將沉淀懸浮于所剩的100ul豆奶液中。（此步是通過低速離心濃縮四膜蟲，去除一半體積的豆奶后，四膜蟲在余下100ul的豆奶中有較大的濃度）

每人做兩片：①實(shí)驗(yàn)組；②對照組5．取以上懸浮液10μl，滴于一張干凈的載玻片的下方，涂布成直徑約1cm左右的圓。兩片標(biāo)本置32℃

溫箱中15分鐘，令其徹底干燥。6．將兩標(biāo)本于10%甲醛溶液中固定10分鐘，取出。放水中1分鐘。7.取一片標(biāo)本做記號，于100℃干烤10分鐘（使酶失活，對照組）。另一片（實(shí)驗(yàn)組）置于室溫。8．將標(biāo)本片放入酶作用液的染色缸中，將染色缸置于37℃水浴，20分鐘。（一組四片）9．水中浸泡，1分鐘。換水后重復(fù)一次操作。10．將標(biāo)本片放入0.2%(NH4)2S中，反應(yīng)1分鐘。11．自來水中浸泡，1分鐘。換水后重復(fù)一次操作。12．濾紙吸干玻片背面的水，待徹底干燥后用顯微鏡觀察。注意兩標(biāo)本間的差異。五、預(yù)期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見指導(dǎo)書彩圖19、20）細(xì)胞吞噬：在10倍鏡下可見四膜蟲在不停游動(dòng)，吞噬碳粒。過一段時(shí)間后整個(gè)細(xì)胞呈現(xiàn)黑色，經(jīng)亮綠處理后觀察細(xì)胞中可見大小不同的黑色碳粒。酸性磷酸酶染色中，樣本片中出現(xiàn)大小不同的小泡或斑塊，呈棕色或棕黑色，即酸性磷酸酶所在的位置。對照片中細(xì)胞呈淡黃褐色，無吞噬泡形成的跡象。標(biāo)本徹底干燥后，40倍鏡下觀察六、注意事項(xiàng)1、實(shí)驗(yàn)應(yīng)采用新鮮培養(yǎng)的四膜蟲，如果四膜蟲已培養(yǎng)一段時(shí)間，則制作的標(biāo)本片中會(huì)觀察到很多細(xì)胞碎片，效果不佳。2、如果固定后標(biāo)本上的固定液沒有洗凈，會(huì)導(dǎo)致酶反應(yīng)不足，造成結(jié)果不明顯。3、如果細(xì)胞長時(shí)間和酸性磷酸酶作用液孵育，會(huì)造成酶和產(chǎn)物擴(kuò)散，結(jié)果看到的棕黑色顆粒呈較大團(tuán)狀，影響觀察效果。4、實(shí)驗(yàn)應(yīng)設(shè)立對照，本實(shí)驗(yàn)采用高溫處理使酶失活；或者也可以蒸餾水代替β-甘油磷酸鈉。5、硫化銨中反應(yīng)時(shí)間過久會(huì)導(dǎo)致整個(gè)細(xì)胞棕黑色過深，影響觀察效果。Discussion

1.討論實(shí)驗(yàn)為何出現(xiàn)你得到的結(jié)果。若實(shí)驗(yàn)結(jié)果不理想，分析是何原因？如何改進(jìn)？

2.

對該實(shí)驗(yàn)有何意見或建議？Questions

1.如果標(biāo)本在工作液中孵育時(shí)間過久，可能會(huì)出現(xiàn)什么現(xiàn)象？

2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果中觀察到是深色物質(zhì)就一定是酸性磷酸酶嗎？

3.還有什么方法可以定位酸性磷酸酶？

References實(shí)驗(yàn)中有哪些方法和儀器用來計(jì)數(shù)細(xì)胞？討論細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的設(shè)計(jì)原理——庫爾特原理（Coulterprinciple

）。NextTopicRequirements：所有同學(xué)課余查找相關(guān)參考書和網(wǎng)頁，準(zhǔn)備以上問題。第