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文檔簡介

紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)/DNA濃度用戶指導(dǎo)書北京普析通用儀器有限責(zé)任公司應(yīng)用技術(shù)部2004年7月

目錄TOC\h\z\t"樣式1,1,樣式2,2"前言: 圖所示。圖2DNA蛋白質(zhì)參數(shù)設(shè)置WL(A1,A2):表示DNA蛋白質(zhì)的兩個(gè)測(cè)定波長。Df(A1,A2):表示DNA的兩個(gè)系數(shù)。Pf(A1,A2):表示蛋白質(zhì)的兩個(gè)系數(shù)。如果您要進(jìn)行320nm的背景校正,點(diǎn)擊【320nm背景校正】選擇框,然后輸入相應(yīng)的校正系數(shù)即可。DNA蛋白質(zhì)的計(jì)算方法如下:不進(jìn)行320nm校正DNA濃度=Df1×A1-Df2×A2蛋白質(zhì)濃度=Pf2×A2-Pf1×A1進(jìn)行320nm校正(A1=A1-A320,A2=A2-A320)DNA濃度=Df1×A1-Df2×A2蛋白質(zhì)濃度=Pf2×A2-Pf1×A1另外,在控制臺(tái)按鈕中,還有一個(gè)名為【儀器】的按鈕,點(diǎn)擊此按鈕即可打開儀器參數(shù)設(shè)置窗口,如光譜帶寬等。4.3.處理測(cè)量結(jié)果DNA蛋白質(zhì)的測(cè)量是非常簡單的,您只需要將樣品放入樣品池,然后點(diǎn)擊控制臺(tái)上的【測(cè)量】按鈕即可完成測(cè)量。如果您要對(duì)測(cè)量結(jié)果進(jìn)行打印輸出,點(diǎn)擊控制臺(tái)上的【打印】按鈕。如果您要導(dǎo)出測(cè)量結(jié)果,點(diǎn)擊【導(dǎo)出】按鈕。5.影響紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)/DNA濃度的因素紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)/DNA濃度的最大特點(diǎn)就是操作簡單、測(cè)量迅速,而且不需要引入試劑;但是它也面臨著很多問題,諸如測(cè)量準(zhǔn)確性的問題。本節(jié)將討論影響測(cè)定的一些主要因素。(1)蛋白質(zhì)的不同對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。由于蛋白質(zhì)是生物大分子,而紫外吸收往往是其分子內(nèi)的小基團(tuán)所引起的,例如酪氨酸、苯丙氨酸,色氨酸和肽鍵等等。因此當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)不同,其包含的上述小基團(tuán)含量發(fā)生變化時(shí),就會(huì)影響蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。然而蛋白質(zhì)種類繁多,結(jié)構(gòu)復(fù)雜,很難對(duì)其進(jìn)行有效的歸類。例如人體內(nèi)含蛋白質(zhì)的種類約有10萬種,整個(gè)生物界的蛋白質(zhì)種類估計(jì)有100億種。建議:測(cè)量過程中如果條件允許,應(yīng)盡量使用相近的蛋白質(zhì)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,修正測(cè)量參數(shù),以便得到更為準(zhǔn)確的數(shù)值。(2)溶液中干擾物質(zhì)的影響。由于蛋白質(zhì)所包括的具有紫外吸收的小基團(tuán)為常見基團(tuán),其產(chǎn)生紫外吸收的特異性并不強(qiáng),很多具有類似結(jié)構(gòu)的有機(jī)溶劑都會(huì)有類似的紫外吸收,如醇、酮、醛、醚、有機(jī)酸、酰胺類,這些混入蛋白質(zhì)溶液都會(huì)對(duì)測(cè)量產(chǎn)生干擾。另外,一些高濃度的無機(jī)化合物也會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的含量測(cè)定產(chǎn)生干擾,例如NaOH、NaCI等等。建議:測(cè)量時(shí)應(yīng)盡量排除干擾物質(zhì),同時(shí)選擇合適的參比溶液。(3)溶劑吸收的影響。如果以一些在紫外區(qū)有吸收的物質(zhì)做溶劑(例如醇、酮類),會(huì)對(duì)測(cè)量結(jié)果產(chǎn)生很大的影響。建議:測(cè)量時(shí)盡量不要使用此類溶劑,或者在測(cè)量時(shí)選擇合適的參比。(4)PH對(duì)測(cè)定的影響。PH變化時(shí)對(duì)蛋白質(zhì)含量測(cè)定的影響非常大,例如:下圖為Tyr的吸收譜線與PH的關(guān)系。由圖可以發(fā)現(xiàn),PH=6和PH=13時(shí),光吸收度已經(jīng)有了非常大的差異。maxmaxatpH6:274nmmaxatpH13:295nm建議:測(cè)定樣品時(shí)不要使溶液處于過酸或者過堿的狀態(tài),同時(shí)樣品的PH值要與標(biāo)準(zhǔn)品的PH值盡量保持一致。(5)環(huán)境極性、蛋白質(zhì)構(gòu)象、蛋白質(zhì)折疊與變性都會(huì)對(duì)蛋白含量的測(cè)定產(chǎn)生影響。6.測(cè)定蛋白質(zhì)/DNA濃度的其他應(yīng)用方法簡介紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)/DNA濃度的方法雖然因其操作簡單、快速的特點(diǎn)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用,但是因其準(zhǔn)確度較差,測(cè)量過程中干擾物質(zhì)較多,不能滿足用戶精確測(cè)量的需求。本節(jié)將介紹一些使用化學(xué)試劑來測(cè)定蛋白質(zhì)/DNA濃度的應(yīng)用方法。(1)考馬斯亮蘭法(Bradford法)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度這是目前最常用的使用化學(xué)試劑測(cè)量蛋白質(zhì)濃度的方法??捡R斯亮蘭G-250染料,在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合,溶液的顏色由棕黑色變?yōu)樘m色,同時(shí)使染料的最大吸收峰的位置由465nm變?yōu)?95nm。目前普遍認(rèn)為,G-250染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸(特別是精氨酸)和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合而變色。因此,在595nm下測(cè)定溶液的吸光度值A(chǔ)595,該吸光度值與蛋白質(zhì)濃度成正比。Bradford法的突出優(yōu)點(diǎn)是:①靈敏度高。本方法靈敏度可達(dá)1ug/mL。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大,蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物有非常高的消光系數(shù)。②測(cè)定快速、簡便。本方法只需加一種試劑考馬斯亮藍(lán)G-250,而且染料與蛋白質(zhì)結(jié)合非???,大約只要2分鐘即可完成,其顏色又可以在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定,其中在5分鐘至20分鐘之間,顏色的穩(wěn)定性最好。測(cè)量時(shí),將染料與樣品混合搖勻,測(cè)定其A595值即可,完成一個(gè)樣品的測(cè)定,只需要1分鐘左右。③干擾物質(zhì)相對(duì)較少。主要的干擾物質(zhì)有:去污劑、TritonX-100、十二烷基硫酸鈉(SDS)和0.1N的NaOH等。值得注意的是,該法也有一些缺陷:①由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,該法用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差,因此,在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用g-球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì),以減少這方面的偏差。②標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性,因而不能用Beer定律進(jìn)行計(jì)算,而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來測(cè)定未知蛋白質(zhì)的濃度。(2)微量凱氏(Kjeldahl)定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度這是一種經(jīng)典方法。蛋白質(zhì)樣品與濃硫酸共熱,含氮有機(jī)物即分解產(chǎn)生氨(消化),氨又與硫酸作用,變成硫酸氨;經(jīng)強(qiáng)堿堿化使之分解放出氨,借蒸汽將氨蒸至酸液中,根據(jù)此酸液被中和的程度可計(jì)算得樣品之含氮量。該方法靈敏度較低(0.2-1mg/mL),操作復(fù)雜,比較費(fèi)時(shí)(約8-10小時(shí)),不過干擾物質(zhì)非常少。該方法目前已經(jīng)很少使用。(3)雙縮脲法(Biuret法)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度雙縮脲(NH2-CO-NH-CO-NH2)是兩個(gè)分子脲(NH2-CO-NH2)經(jīng)180℃左右加熱,放出一個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中,雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物,稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵,或能過一個(gè)中間碳原子相連的肽鍵,這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)可以和CuSO4發(fā)生雙縮脲反應(yīng),形成的紫色絡(luò)合物的顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比,而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān),故可用來測(cè)定蛋白質(zhì)含量。此法的優(yōu)點(diǎn)是較快速,干擾物質(zhì)少(主要干擾物質(zhì)有硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等),不受蛋白質(zhì)差異的影響;主要的缺點(diǎn)是靈敏度差(1~10mg/mL)。因此雙縮脲法常用于需要快速,但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測(cè)定。(4)Folin-酚試劑法(Lowry法)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度Folin-酚試劑法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的,只是加入了第二種試劑,即Folin-酚試劑,以增加顯色量,從而提高了檢測(cè)蛋白質(zhì)的靈敏度。這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深藍(lán)色的原因都是:在堿性條件下,蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。Folin-酚試劑中的磷鉬酸鹽-磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原,產(chǎn)生深藍(lán)色(鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物)。在一定的條件下,藍(lán)色深度與蛋白的量成正比。

該法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高(5ug/mL),比雙縮脲法靈敏得多,缺點(diǎn)是時(shí)間較長(大約2小時(shí)),要精確控制操作時(shí)間,標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式,且專一性較差,干擾物質(zhì)較多。對(duì)雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子,也會(huì)干擾Lowry反應(yīng),而且對(duì)后者的影響還要大得多。例如酚類、檸檬酸、硫酸銨、Tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素(0.5%),硫酸納(1%),硝酸納(1%),三氯乙酸(0.5%),乙醇(5%),乙醚(5%),丙酮(0.5%)等溶液對(duì)顯色無影響,但這些物質(zhì)濃度高時(shí),必須作校正曲線。含硫酸銨的溶液,只須加濃碳酸鈉-氫氧化鈉溶液,即可顯色測(cè)定。若樣品酸度較高,顯色后會(huì)色淺,則必須提高碳酸鈉—?dú)溲趸c溶液的濃度1~2倍。依干擾物質(zhì)的不同,本方法常作為考馬斯亮藍(lán)法的備選方法,交替使用。(5)BCA(Bicinchonincacid)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度BCA法與Lowry法相似,主要差別在堿性溶液中,蛋白質(zhì)使銅離子由二價(jià)轉(zhuǎn)變成一價(jià)后,進(jìn)一步的以BCA取代Folin-酚與一價(jià)銅離子結(jié)合產(chǎn)生很深的紫色,在波長562nm有很強(qiáng)的吸光度,該吸光度值與蛋白質(zhì)濃度成正比。本法的優(yōu)點(diǎn)在于堿性溶液中BCA比Folin-酚穩(wěn)定,因此BCA與堿性銅離子溶液結(jié)合的呈色反應(yīng)只需一步驟即完成。本法的靈敏度與Lowry法相似,以微量分析(microassay)靈敏度可測(cè)至約0.5-10mg/ml。本方法對(duì)于陰離子、非離子性及二性離子的清潔劑、鹽酸胍和尿素較具容忍度,不易受干擾,但也會(huì)受原糖以及EDTA的干擾。BCA法和Folin-酚法一樣,通常作為考馬斯亮藍(lán)法的備選方法,交替使用。(6)瓊脂糖凝膠電泳法測(cè)定DNA濃度從生物體中提取的總DNA濃度一般是通過紫外吸收法(A260法)來測(cè)定,當(dāng)需要測(cè)定某些特定DNA濃度時(shí),通常先進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離DNA,然后用溴化乙錠進(jìn)行染色(溴化乙錠能夠插入到DNA的雙鏈上,而且在紫外燈的照射下又會(huì)產(chǎn)生熒光),再用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析,最后可以得出各個(gè)特定DNA的濃度。

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