化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)課件

第二十一章

化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)

第二十一章

化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)11.化學(xué)發(fā)光劑的概念及常用的化學(xué)發(fā)光劑。2.化學(xué)發(fā)光免疫分析的基本原理及其技術(shù)類型。3.化學(xué)發(fā)光酶免疫分析基本原理及其分離技術(shù)。4.電化學(xué)發(fā)光免疫分析基本原理。5.化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的臨床應(yīng)用。本章要點1.化學(xué)發(fā)光劑的概念及常用的化學(xué)發(fā)光劑。本章要點2目錄發(fā)光基本知識1化學(xué)發(fā)光免疫分析2化學(xué)發(fā)光酶免疫分析3電化學(xué)發(fā)光免疫分析4化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的臨床應(yīng)用5目錄發(fā)光基本知識1化學(xué)發(fā)光免疫分析2化學(xué)發(fā)光酶免疫分析3化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)是將具有高靈敏度的化學(xué)發(fā)光測定技術(shù)與高特異性的抗原抗體反應(yīng)技術(shù)相結(jié)合，用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、維生素和藥物等的檢測分析技術(shù)。該技術(shù)具有特異性高、靈敏度高、分離簡便、快速、試劑無毒、安全穩(wěn)定、可自動化分析等特點，在免疫學(xué)檢驗中應(yīng)用廣泛。前言化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)是將具有高靈敏度的化學(xué)發(fā)光測定技術(shù)與高特異性4放射免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)金免疫技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)標記免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)金免疫技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)5第一節(jié)基本知識一、發(fā)光發(fā)光是指分子或原子中的電子吸收能量后，由低能級的基態(tài)躍遷到高能級的激發(fā)態(tài)，然后再返回到基態(tài)，釋放出的能量表現(xiàn)為光的發(fā)射。根據(jù)形成激發(fā)態(tài)的激發(fā)能不同可將發(fā)光分為光照發(fā)光、生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光。第一節(jié)基本知識一、發(fā)光發(fā)光是指分子或原子中的電子吸收能61.光照發(fā)光（photoluminescence）發(fā)光劑（熒光素）經(jīng)短波長入射光照射后進入激發(fā)態(tài)，當回復(fù)至基態(tài)時發(fā)出較長波長的可見光。1.光照發(fā)光（photoluminescence）發(fā)光劑（熒72.生物發(fā)光（bioluminescence）發(fā)生在生物體內(nèi)的發(fā)光現(xiàn)象，如螢火蟲的發(fā)光，反應(yīng)底物為螢火蟲熒光素，在熒光素酶的催化下，利用ATP產(chǎn)能，生成激發(fā)態(tài)氧化型熒光素，它在回復(fù)基態(tài)時多余的能量以光子的形式釋放出來。2.生物發(fā)光（bioluminescence）發(fā)生在生物體內(nèi)83.化學(xué)發(fā)光某些物質(zhì)(發(fā)光劑)在化學(xué)反應(yīng)時，吸收了反應(yīng)過程中所產(chǎn)生的化學(xué)能，使反應(yīng)的產(chǎn)物分子或中間態(tài)分子中的電子躍遷到激發(fā)態(tài)，當電子從激發(fā)態(tài)回復(fù)到基態(tài)時，以發(fā)射光子的形式釋放出能量，這一現(xiàn)象稱為化學(xué)發(fā)光。3.化學(xué)發(fā)光某些物質(zhì)(發(fā)光劑)在化學(xué)反應(yīng)時，吸收了反應(yīng)過程中9一個化學(xué)反應(yīng)要產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象，必須滿足以下條件：①該反應(yīng)必須提供足夠的激發(fā)能,并由某一步驟單獨提供,因為前一步反應(yīng)釋放的能量將因振動弛豫消失在溶液中而不能發(fā)光②要有有利的反應(yīng)過程,使化學(xué)反應(yīng)的能量至少能被一種物質(zhì)所接受并生成激發(fā)態(tài)③激發(fā)態(tài)分子必須具有一定的化學(xué)發(fā)光量子效率釋放出光子,或者能夠轉(zhuǎn)移它的能量給另一個分子使之進入激發(fā)態(tài)并釋放出光子一個化學(xué)反應(yīng)要產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象，必須滿足以下條件：①該反應(yīng)必10在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物稱為化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物。二.化學(xué)發(fā)光劑在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的11作為化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的化學(xué)發(fā)光劑應(yīng)符合以下幾個條件：發(fā)光的量子產(chǎn)率高

物理-化學(xué)特性要與被標記或測定的物質(zhì)相匹配

能與抗原或抗體形成穩(wěn)定的偶聯(lián)結(jié)合物

其化學(xué)發(fā)光常是氧化反應(yīng)的結(jié)果

在所使用的濃度范圍內(nèi)對生物體沒有毒性

作為化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的化學(xué)發(fā)光劑應(yīng)符合以下幾個條件：發(fā)光的12常用的化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物有

1.直接化學(xué)發(fā)光劑

2.酶促反應(yīng)的發(fā)光底物

3.電化學(xué)發(fā)光劑

常用的化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物有131.直接化學(xué)發(fā)光劑在發(fā)光免疫分析過程中不需酶的催化作用，直接參與發(fā)光反應(yīng)，它們在化學(xué)結(jié)構(gòu)上有產(chǎn)生發(fā)光的特有基團，可直接標記抗原或抗體。如常用的吖啶酯（acridinium，AE）。1.直接化學(xué)發(fā)光劑在發(fā)光免疫分析過程中不需酶的催化作用，直接14吖啶酯在堿性條件下被H2O2氧化時,發(fā)出波長為470nm的光，具有很高的發(fā)光效率，其激發(fā)態(tài)產(chǎn)物N-甲基吖啶酮是該發(fā)光反應(yīng)體系的發(fā)光體。吖啶酯在堿性條件下被H2O2氧化時,發(fā)出波長152.酶促反應(yīng)的發(fā)光底物

是利用標記酶的催化作用，使發(fā)光劑（底物）發(fā)光。

目前化學(xué)發(fā)光酶免疫技術(shù)中常用的酶有辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（ALP）。HRP的常用的發(fā)光底物為魯米諾或其衍生物，ALP的發(fā)光底物為金剛烷（AMPPD）2.酶促反應(yīng)的發(fā)光底物是利用標記酶的催化作用，使發(fā)光劑（底16（1）魯米諾或其衍生物

魯米諾在堿性條件下可被一些氧化劑氧化，發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，輻射出最大發(fā)射波長為425nm的光。（1）魯米諾或其衍生物魯米諾在堿性條件下可被一些氧化劑氧化17魯米諾增強發(fā)光反應(yīng)原理魯米諾增強發(fā)光反應(yīng)原理18（2）AMPPD

〔3-(2‘-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧雜環(huán)丁烷〕〕（2）AMPPD〔3-(2‘-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4193．電化學(xué)發(fā)光劑

電化學(xué)發(fā)光劑是指通過在電極表面進行電化學(xué)反應(yīng)而發(fā)光的物質(zhì)。如化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]2+和電子供體三丙胺（TPA）在陽性電極表面可同時失去一個電子而發(fā)生氧化反應(yīng)。

3．電化學(xué)發(fā)光劑電化學(xué)發(fā)光劑是指通過在電極表面進行電化學(xué)反20用化學(xué)發(fā)光劑（如吖啶酯）直接標記抗體(抗原)，與待測標本中相應(yīng)的抗原(抗體)和磁顆粒性的抗體（抗原）發(fā)生免疫反應(yīng)后，通過磁場把結(jié)合狀態(tài)和游離狀態(tài)的化學(xué)發(fā)光劑標記物分離開來，這時只需加入氧化劑（H2O2）和NaOH使成堿性環(huán)境，吖啶酯在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光。由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時間內(nèi)所產(chǎn)生的光子能，可從標準曲線上計算出待測抗原(抗體)的含量

第二節(jié)化學(xué)發(fā)光免疫分析一、檢測原理用化學(xué)發(fā)光劑（如吖啶酯）直接標記抗體(抗原)，與待測標本中相21化學(xué)發(fā)光免疫分析雙抗體夾心法原理示意圖

化學(xué)發(fā)光免疫分析雙抗體夾心法原理示意圖221.分離方法

常用磁顆粒分離技術(shù)，即用抗原或抗體包被磁顆粒，與標本中相應(yīng)抗體或抗原及吖啶酯標記的抗體或抗原通過一定模式的免疫學(xué)反應(yīng)后,最終通過在磁場中沖洗將結(jié)合到免疫復(fù)合物中的標記物和游離標記物進行分離的技術(shù)。

二、方法類型1.分離方法二、方法類型232.常用的免疫學(xué)反應(yīng)模式

雙抗原夾心法固相抗原競爭法雙抗體夾心法2.常用的免疫學(xué)反應(yīng)模式雙抗原夾心法固相抗原競爭法雙抗體夾24三、技術(shù)要點抗原抗體結(jié)合反應(yīng)

結(jié)合物與游離物的分離(磁顆粒分離技術(shù))化學(xué)發(fā)光反應(yīng)

三、技術(shù)要點抗原抗體結(jié)合反應(yīng)結(jié)合物與游離物的分離化學(xué)發(fā)光25化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（CLEIA）是用參與催化某一化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的酶如辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶(ALP)來標記抗原或抗體，在與待測標本中相應(yīng)的抗體(抗原)發(fā)生免疫反應(yīng)后，經(jīng)洗滌將結(jié)合物與游離的酶標物分離后，加入底物(發(fā)光劑)，酶催化和分解底物發(fā)光，由光量子閱讀系統(tǒng)接收，光電倍增管將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柌⒓右苑糯螅侔阉鼈儌魉椭劣嬎銠C數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計算出測定物的濃度。第三節(jié)化學(xué)發(fā)光酶免疫分析一、檢測原理化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（CLEIA）是用參與催化某一化學(xué)發(fā)光反應(yīng)26堿性磷酸酶化學(xué)發(fā)光酶免疫分析雙抗體夾心法原理示意圖

堿性磷酸酶化學(xué)發(fā)光酶免疫分析雙抗體夾心法原理示意圖27

1.根據(jù)標記酶不同分類可分為辣根過氧化物酶標記的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析和堿性磷酸酶標記的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析。前者常以魯米諾或其衍生物作為發(fā)光底物，后者常以AMPPD作為發(fā)光底物。

2.根據(jù)免疫學(xué)反應(yīng)模式分類同化學(xué)發(fā)光免疫分析，主要有雙抗體夾心法、雙抗原夾心法和固相抗原競爭法等主要模式，所不同只是相應(yīng)抗原或抗體上標記的是酶而不是直接標記發(fā)光劑。

二、方法類型1.根據(jù)標記酶不同分類可分為辣根過氧化物酶標記的28三、技術(shù)要點抗原抗體結(jié)合反應(yīng)結(jié)合物與游離物的分離

（磁顆粒分離法、微粒子捕獲法、包被聚苯乙烯反應(yīng)珠或孔分離法）酶促發(fā)光反應(yīng)

三、技術(shù)要點抗原抗體結(jié)合反應(yīng)結(jié)合物與游離物的分離酶促發(fā)光29電化學(xué)發(fā)光免疫分析（ECLIA）是以電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標記抗體(抗原)，通過抗原抗體反應(yīng)和磁珠分離技術(shù)，根據(jù)三聯(lián)吡啶釕在電極上發(fā)出的光強度對待測的抗原或抗體進行定量分析，它包括電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個過程。第四節(jié)電化學(xué)發(fā)光免疫分析一、檢測原理電化學(xué)發(fā)光免疫分析（ECLIA）是以電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標30電化學(xué)發(fā)光免疫分析雙抗體夾心法原理示意圖電化學(xué)發(fā)光免疫分析雙抗體夾心法原理示意圖31電化學(xué)發(fā)光免疫測定示意圖電化學(xué)發(fā)光免疫測定示意圖321.分離方法常用磁顆粒分離技術(shù)2.免疫學(xué)反應(yīng)模式其反應(yīng)模式同發(fā)光免疫分析，主要有雙抗體夾心法、雙抗原夾心法和固相抗原競爭法三種主要模式，所不同只是相應(yīng)抗原或抗體上標記的是三聯(lián)吡啶釕。

二、方法類型1.分離方法常用磁顆粒分離技術(shù)二、方法類型33三、技術(shù)要點抗原抗體反應(yīng)

結(jié)合物與游離物的分離(磁顆粒分離技術(shù))電化學(xué)發(fā)光過程

三、技術(shù)要點抗原抗體反應(yīng)結(jié)合物與游離物的分離電化學(xué)發(fā)光過程34第五節(jié)化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的臨床應(yīng)用一、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的特點1.敏感度高，甚至超過RIA；2.精密度和準確性均可與RIA相比；3.試劑穩(wěn)定，無毒害；4.測定耗時短；5.測定項目多；6.已發(fā)展成自動化測定系統(tǒng)。第五節(jié)化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的臨床應(yīng)用一、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的特點351.甲狀腺激素

T3、T4、hTSH、FT4、FT3、抗TPO、甲狀腺球蛋白、抗甲狀腺球蛋白抗體等。2.生殖激素

β-HCG、催乳素、促卵泡激素、促黃體激素、孕酮、雌二醇、非結(jié)合雌三醇、甲胎蛋白、睪丸酮、硫酸脫氫異雄酮。3.腎上腺/垂體激素皮質(zhì)醇、尿皮質(zhì)醇、人生長激素、甲狀旁腺素、促腎上腺皮質(zhì)激素。二、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)常見的檢測項目1.甲狀腺激素T3、T4、hTSH、FT4、FT3、抗364.貧血因子維生素B12、葉酸、紅細胞葉酸、鐵蛋白等。5.腫瘤標記物

AFP、CEA、PSA、游離PSA、CAl9-9、CAl25、CAl5-3等。6．感染性疾病衣原體抗原、尿衣原體抗原、衣原體抗原確認、弓形體IgG抗體、弓形體IgM抗體、風疹病毒IgG抗體、風疹病毒IgM抗體、巨細胞病毒IgG抗體、巨細胞病毒IgM抗體等。二、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)常見的檢測項目4.貧血因子維生素B12、葉酸、紅細胞葉酸、鐵蛋二、化377．糖尿病胰島素、C肽等。8．心血管系統(tǒng)肌酸激酶MB同工酶、地高辛、肌紅蛋白、心肌肌鈣蛋白-I等。9．病毒標記物

HIVl/2Ab、HBsAg、HBsAg確認、HBsAb、HCVAb、HAVIgM、HAVAb、HBcAb、HBclgM、HBeAg、HBeAb等。二、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)常見的檢測項目7．糖尿病胰島素、C肽等。二、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)常見的檢3810．骨代謝骨膠原酶、脫氧吡啶啉等。11．過敏性疾病總IgE、特異性IgE等。12．治療藥物監(jiān)測茶堿、地高辛、環(huán)孢素、巴比妥等。二、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)常見的檢測項目10．骨代謝骨膠原酶、脫氧吡啶啉等。二、化學(xué)發(fā)光免疫技39化學(xué)發(fā)光是吸收了化學(xué)反應(yīng)過程中所產(chǎn)生的化學(xué)能使分子激發(fā)而發(fā)光?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析是將化學(xué)發(fā)光與免疫反應(yīng)相結(jié)合，用于檢測微量抗原或抗體的標記免疫分析技術(shù)，分為直接化學(xué)發(fā)光免疫分析，化學(xué)發(fā)光酶免疫分析和電化學(xué)發(fā)光免疫分析。小結(jié)化學(xué)發(fā)光是吸收了化學(xué)反應(yīng)過程中所產(chǎn)生的小結(jié)40化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)課件41第二十一章

化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)

第二十一章

化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)421.化學(xué)發(fā)光劑的概念及常用的化學(xué)發(fā)光劑。2.化學(xué)發(fā)光免疫分析的基本原理及其技術(shù)類型。3.化學(xué)發(fā)光酶免疫分析基本原理及其分離技術(shù)。4.電化學(xué)發(fā)光免疫分析基本原理。5.化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的臨床應(yīng)用。本章要點1.化學(xué)發(fā)光劑的概念及常用的化學(xué)發(fā)光劑。本章要點43目錄發(fā)光基本知識1化學(xué)發(fā)光免疫分析2化學(xué)發(fā)光酶免疫分析3電化學(xué)發(fā)光免疫分析4化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的臨床應(yīng)用5目錄發(fā)光基本知識1化學(xué)發(fā)光免疫分析2化學(xué)發(fā)光酶免疫分析44化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)是將具有高靈敏度的化學(xué)發(fā)光測定技術(shù)與高特異性的抗原抗體反應(yīng)技術(shù)相結(jié)合，用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、維生素和藥物等的檢測分析技術(shù)。該技術(shù)具有特異性高、靈敏度高、分離簡便、快速、試劑無毒、安全穩(wěn)定、可自動化分析等特點，在免疫學(xué)檢驗中應(yīng)用廣泛。前言化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)是將具有高靈敏度的化學(xué)發(fā)光測定技術(shù)與高特異性45放射免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)金免疫技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)標記免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)金免疫技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)46第一節(jié)基本知識一、發(fā)光發(fā)光是指分子或原子中的電子吸收能量后，由低能級的基態(tài)躍遷到高能級的激發(fā)態(tài)，然后再返回到基態(tài)，釋放出的能量表現(xiàn)為光的發(fā)射。根據(jù)形成激發(fā)態(tài)的激發(fā)能不同可將發(fā)光分為光照發(fā)光、生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光。第一節(jié)基本知識一、發(fā)光發(fā)光是指分子或原子中的電子吸收能471.光照發(fā)光（photoluminescence）發(fā)光劑（熒光素）經(jīng)短波長入射光照射后進入激發(fā)態(tài)，當回復(fù)至基態(tài)時發(fā)出較長波長的可見光。1.光照發(fā)光（photoluminescence）發(fā)光劑（熒482.生物發(fā)光（bioluminescence）發(fā)生在生物體內(nèi)的發(fā)光現(xiàn)象，如螢火蟲的發(fā)光，反應(yīng)底物為螢火蟲熒光素，在熒光素酶的催化下，利用ATP產(chǎn)能，生成激發(fā)態(tài)氧化型熒光素，它在回復(fù)基態(tài)時多余的能量以光子的形式釋放出來。2.生物發(fā)光（bioluminescence）發(fā)生在生物體內(nèi)493.化學(xué)發(fā)光某些物質(zhì)(發(fā)光劑)在化學(xué)反應(yīng)時，吸收了反應(yīng)過程中所產(chǎn)生的化學(xué)能，使反應(yīng)的產(chǎn)物分子或中間態(tài)分子中的電子躍遷到激發(fā)態(tài)，當電子從激發(fā)態(tài)回復(fù)到基態(tài)時，以發(fā)射光子的形式釋放出能量，這一現(xiàn)象稱為化學(xué)發(fā)光。3.化學(xué)發(fā)光某些物質(zhì)(發(fā)光劑)在化學(xué)反應(yīng)時，吸收了反應(yīng)過程中50一個化學(xué)反應(yīng)要產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象，必須滿足以下條件：①該反應(yīng)必須提供足夠的激發(fā)能,并由某一步驟單獨提供,因為前一步反應(yīng)釋放的能量將因振動弛豫消失在溶液中而不能發(fā)光②要有有利的反應(yīng)過程,使化學(xué)反應(yīng)的能量至少能被一種物質(zhì)所接受并生成激發(fā)態(tài)③激發(fā)態(tài)分子必須具有一定的化學(xué)發(fā)光量子效率釋放出光子,或者能夠轉(zhuǎn)移它的能量給另一個分子使之進入激發(fā)態(tài)并釋放出光子一個化學(xué)反應(yīng)要產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象，必須滿足以下條件：①該反應(yīng)必51在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物稱為化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物。二.化學(xué)發(fā)光劑在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的52作為化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的化學(xué)發(fā)光劑應(yīng)符合以下幾個條件：發(fā)光的量子產(chǎn)率高

物理-化學(xué)特性要與被標記或測定的物質(zhì)相匹配

能與抗原或抗體形成穩(wěn)定的偶聯(lián)結(jié)合物

其化學(xué)發(fā)光常是氧化反應(yīng)的結(jié)果

在所使用的濃度范圍內(nèi)對生物體沒有毒性

作為化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的化學(xué)發(fā)光劑應(yīng)符合以下幾個條件：發(fā)光的53常用的化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物有

1.直接化學(xué)發(fā)光劑

2.酶促反應(yīng)的發(fā)光底物

3.電化學(xué)發(fā)光劑

常用的化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物有541.直接化學(xué)發(fā)光劑在發(fā)光免疫分析過程中不需酶的催化作用，直接參與發(fā)光反應(yīng)，它們在化學(xué)結(jié)構(gòu)上有產(chǎn)生發(fā)光的特有基團，可直接標記抗原或抗體。如常用的吖啶酯（acridinium，AE）。1.直接化學(xué)發(fā)光劑在發(fā)光免疫分析過程中不需酶的催化作用，直接55吖啶酯在堿性條件下被H2O2氧化時,發(fā)出波長為470nm的光，具有很高的發(fā)光效率，其激發(fā)態(tài)產(chǎn)物N-甲基吖啶酮是該發(fā)光反應(yīng)體系的發(fā)光體。吖啶酯在堿性條件下被H2O2氧化時,發(fā)出波長562.酶促反應(yīng)的發(fā)光底物

是利用標記酶的催化作用，使發(fā)光劑（底物）發(fā)光。

目前化學(xué)發(fā)光酶免疫技術(shù)中常用的酶有辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（ALP）。HRP的常用的發(fā)光底物為魯米諾或其衍生物，ALP的發(fā)光底物為金剛烷（AMPPD）2.酶促反應(yīng)的發(fā)光底物是利用標記酶的催化作用，使發(fā)光劑（底57（1）魯米諾或其衍生物

魯米諾在堿性條件下可被一些氧化劑氧化，發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，輻射出最大發(fā)射波長為425nm的光。（1）魯米諾或其衍生物魯米諾在堿性條件下可被一些氧化劑氧化58魯米諾增強發(fā)光反應(yīng)原理魯米諾增強發(fā)光反應(yīng)原理59（2）AMPPD

〔3-(2‘-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧雜環(huán)丁烷〕〕（2）AMPPD〔3-(2‘-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4603．電化學(xué)發(fā)光劑

電化學(xué)發(fā)光劑是指通過在電極表面進行電化學(xué)反應(yīng)而發(fā)光的物質(zhì)。如化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]2+和電子供體三丙胺（TPA）在陽性電極表面可同時失去一個電子而發(fā)生氧化反應(yīng)。

3．電化學(xué)發(fā)光劑電化學(xué)發(fā)光劑是指通過在電極表面進行電化學(xué)反61用化學(xué)發(fā)光劑（如吖啶酯）直接標記抗體(抗原)，與待測標本中相應(yīng)的抗原(抗體)和磁顆粒性的抗體（抗原）發(fā)生免疫反應(yīng)后，通過磁場把結(jié)合狀態(tài)和游離狀態(tài)的化學(xué)發(fā)光劑標記物分離開來，這時只需加入氧化劑（H2O2）和NaOH使成堿性環(huán)境，吖啶酯在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光。由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時間內(nèi)所產(chǎn)生的光子能，可從標準曲線上計算出待測抗原(抗體)的含量

第二節(jié)化學(xué)發(fā)光免疫分析一、檢測原理用化學(xué)發(fā)光劑（如吖啶酯）直接標記抗體(抗原)，與待測標本中相62化學(xué)發(fā)光免疫分析雙抗體夾心法原理示意圖

化學(xué)發(fā)光免疫分析雙抗體夾心法原理示意圖631.分離方法

常用磁顆粒分離技術(shù)，即用抗原或抗體包被磁顆粒，與標本中相應(yīng)抗體或抗原及吖啶酯標記的抗體或抗原通過一定模式的免疫學(xué)反應(yīng)后,最終通過在磁場中沖洗將結(jié)合到免疫復(fù)合物中的標記物和游離標記物進行分離的技術(shù)。

二、方法類型1.分離方法二、方法類型642.常用的免疫學(xué)反應(yīng)模式

雙抗原夾心法固相抗原競爭法雙抗體夾心法2.常用的免疫學(xué)反應(yīng)模式雙抗原夾心法固相抗原競爭法雙抗體夾65三、技術(shù)要點抗原抗體結(jié)合反應(yīng)

結(jié)合物與游離物的分離(磁顆粒分離技術(shù))化學(xué)發(fā)光反應(yīng)

三、技術(shù)要點抗原抗體結(jié)合反應(yīng)結(jié)合物與游離物的分離化學(xué)發(fā)光66化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（CLEIA）是用參與催化某一化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的酶如辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶(ALP)來標記抗原或抗體，在與待測標本中相應(yīng)的抗體(抗原)發(fā)生免疫反應(yīng)后，經(jīng)洗滌將結(jié)合物與游離的酶標物分離后，加入底物(發(fā)光劑)，酶催化和分解底物發(fā)光，由光量子閱讀系統(tǒng)接收，光電倍增管將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柌⒓右苑糯?，再把它們傳送至計算機數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計算出測定物的濃度。第三節(jié)化學(xué)發(fā)光酶免疫分析一、檢測原理化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（CLEIA）是用參與催化某一化學(xué)發(fā)光反應(yīng)67堿性磷酸酶化學(xué)發(fā)光酶免疫分析雙抗體夾心法原理示意圖

堿性磷酸酶化學(xué)發(fā)光酶免疫分析雙抗體夾心法原理示意圖68

1.根據(jù)標記酶不同分類可分為辣根過氧化物酶標記的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析和堿性磷酸酶標記的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析。前者常以魯米諾或其衍生物作為發(fā)光底物，后者常以AMPPD作為發(fā)光底物。

2.根據(jù)免疫學(xué)反應(yīng)模式分類同化學(xué)發(fā)光免疫分析，主要有雙抗體夾心法、雙抗原夾心法和固相抗原競爭法等主要模式，所不同只是相應(yīng)抗原或抗體上標記的是酶而不是直接標記發(fā)光劑。

二、方法類型1.根據(jù)標記酶不同分類可分為辣根過氧化物酶標記的69三、技術(shù)要點抗原抗體結(jié)合反應(yīng)結(jié)合物與游離物的分離

（磁顆粒分離法、微粒子捕獲法、包被聚苯乙烯反應(yīng)珠或孔分離法）酶促發(fā)光反應(yīng)

三、技術(shù)要點抗原抗體結(jié)合反應(yīng)結(jié)合物與游離物的分離酶促發(fā)光70電化學(xué)發(fā)光免疫分析（ECLIA）是以電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標記抗體(抗原)，通過抗原抗體反應(yīng)和磁珠分離技術(shù)，根據(jù)三聯(lián)吡啶釕在電極上發(fā)出的光強度對待測的抗原或抗體進行定量分析，它包括電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個過程。第四節(jié)電化學(xué)發(fā)光免疫分析一、檢測原理電化學(xué)發(fā)光免疫分析（ECLIA）是以電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標71電化學(xué)發(fā)光免疫分析雙抗體夾心法原理示意圖電化學(xué)發(fā)光免疫分析雙抗體夾心法原理示意圖72電化學(xué)發(fā)光免疫測定示意圖電化學(xué)發(fā)光免疫測定示意圖731.分離方法常用磁顆粒分離技術(shù)2.免疫學(xué)反應(yīng)模式其反應(yīng)模式同發(fā)光免疫分析，主要有雙抗體夾心法、雙抗原夾心法和固相抗原競爭法三種主要模式，所不同只是相應(yīng)抗原或抗體上標記的是三聯(lián)吡啶釕。

二、方法類型1.分離方法常用磁顆粒分離技術(shù)二、方法類型74三、技術(shù)要點抗原抗體反應(yīng)

結(jié)合物與游離物的分離(磁顆粒分離技術(shù))電化學(xué)發(fā)光過程

三、技術(shù)要點抗原抗體反應(yīng)結(jié)合物與游離物的分離電化學(xué)發(fā)光過程75第五節(jié)化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的臨床應(yīng)用一、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的特點1.敏感度高，甚至超過RIA；2.精密度和準確性均可與RIA相比；3.試劑穩(wěn)定，無毒害；4.測定耗時短；5.測定項目多；6.已發(fā)展