乙肝表面抗原定量測定的方法學驗證

乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法學驗證姓名ZP學號0925400072班級09級醫(yī)學檢驗本科二班指導老師沈富兵二〇一三年四月

乙肝表面抗原定量測定的方法學驗證作者：ZP（成都醫(yī)學院檢驗醫(yī)學院09級醫(yī)學檢驗本科二班，610500）【摘要】

目的用福州藍圖生物工程有限公司出品的乙肝表面抗原ELISA法定量分析試劑盒對乙肝表面抗原定量測定的方法進行驗證，以判斷是否能用于教學以及臨床分析。方法運用ELLISA法定量測定乙肝表面抗原，應用試劑盒HBsAg標準從濃度為8ng/ml的2倍稀釋的6個濃度梯度，根據(jù)OD值繪制標準曲線再計算相對回收率和板內(nèi)和板間精密度，通過資料數(shù)據(jù)綜合分析。結(jié)果HBsAg線性較好，其準確度、精密度、LOD值均在正常范內(nèi)。結(jié)論ELISA法定量檢測HBsAg能較準確、快速地反映體內(nèi)乙肝病毒復制情況，可以用于教學以及臨床分析。【關(guān)鍵詞】

乙肝表面抗原方法學驗證標準曲線精密度ELLISA病毒性肝炎中乙型肝炎的危害較大，我國是病毒性乙型肝炎的高發(fā)流行區(qū)，普通人群的乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)感染率接近60％，約占世界HBV攜帶者的1/3。乙型肝炎病毒的病原體不僅具有傳染性，還可能導致發(fā)展成肝硬化，甚至肝癌，所以乙型肝炎病毒的早期、準確、定量檢測對乙型肝炎臨床診斷、療效觀察及預防具有重要的意義。酶免分析法HBV—EIA是HBV抗原和抗體最常用的檢測技術(shù)，其方法簡便、價廉，適合一般實驗室推廣，其中酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)目前應用最為廣泛，它常用聚苯乙烯為固相載體，使其與待測標本中的相應抗體或抗原結(jié)合，然后加酶標記的抗原或抗體，再加底物顯色，最后根據(jù)色澤深淺來推算待測抗原或抗體的含量。此方法特異性高，有效測定范圍可達到20500ng/ml，且酶免疫法有標記的試劑比較穩(wěn)定并且無放射線危害等優(yōu)點。我們采用對已知抗體濃度的樣品進行ELISA的定量檢測，通過對其數(shù)據(jù)的分析來驗證ELISA法最乙肝表面抗原定量檢測的準確性和可靠性，以衡量其實用性。1材料與方法1.1材料1.1.1試劑盒乙肝表面抗原ELISA法定量分析試劑盒，福州藍圖生物工程有限公司出品。1.1.2儀器及酶標板酶標儀：Bio-Rad680；洗板機：Bio-Rad1575；超純水系統(tǒng)：MilliporeElix；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9052):上海精宏實驗設(shè)備有限公司。1.1.3溶液配制=1\*GB2⑴0.01MpH7.4的PBS緩沖液：稱取8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4,溶于800ml蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，最后加蒸餾水定容至1L即可。=2\*GB2⑵質(zhì)控品：用PBS緩沖液將標準品配制成6、3、1.5ng/ml三個質(zhì)控品，每質(zhì)控品1ml。首先取450μl的8ng/ml的標準品到C1號EP管中再向其中加入150μl的PBS緩沖液，即配制成了6ng/ml的質(zhì)控品，再取300μlC1號EP管內(nèi)的溶液到C2號EP管內(nèi)，再向C2號管內(nèi)加入300μl的緩沖液混勻。即配制成了3ng/ml的質(zhì)控品。接著取300μlC2號管內(nèi)的液體到C3號EP管內(nèi)，再加入300μl的緩沖液混勻，即配制成了1.5ng/ml的質(zhì)控品。具體方法如下圖1C23C23ng/mlC1C16ng/mlC31.5ng/ml圖11.2檢測方法1.2.1標準曲線各濃度的配制=1\*GB2⑴用PBS緩沖液將標準品配制成8、4、2、1、0.5、0.25ng/ml。=2\*GB2⑵先取6個EP管分別標記為對應的濃度。=3\*GB2⑶取400μl標準品于標記為的EP管中，再取200μl號管內(nèi)液體于號管內(nèi)再向號管中加入200μl的緩沖液混勻，即配制成了濃度為4ng/ml的標準品。=4\*GB2⑷再從號管內(nèi)取200μl的液體到號管內(nèi)，接著取200μl的緩沖液到號管內(nèi)混勻，即配制成了2ng/ml的標準品。=5\*GB2⑸從號管內(nèi)取200μl的標準品到④號管內(nèi)，再向④號管內(nèi)加入200μl的緩沖液混勻，即配制成了1ng/ml的標準品。=6\*GB2⑹用同樣的方法，配制好濃度分別為0.5ng/ml、0.25ng/ml.的標準品體積分別為200μl、200μl、400μl備用。具體方法如下圖2S60.25ng/mlS50.5ng/mlSS60.25ng/mlS50.5ng/mlS41ng/mlS32ng/mlS24ng/mlS18ng/ml圖21.2.2測定方法=1\*GB2⑴取出試劑盒中已包被酶標板，取出板條，在相應孔中加入已配制好的系列標準品、質(zhì)控品及空白對照；88631.5EQ\o\ac(○,-)44631.5EQ\o\ac(○,-)22631.5EQ\o\ac(○,-)11631.5EQ\o\ac(○,-)0.50.5631.5EQ\o\ac(○,-)0.250.25EQ\o\ac(○,-)EQ\o\ac(○,-)EQ\o\ac(○,-)EQ\o\ac(○,-)EQ\o\ac(○,-)EQ\o\ac(○,-)EQ\o\ac(○,-)EQ\o\ac(○,-)EQ\o\ac(○,-)圖3注：雙線框區(qū)域為標準品,濃度依次為8、4、2、1、0.5、0.25ng/ml，三線框區(qū)域為質(zhì)控品，濃度依次為6、3、1.5ng/ml，粗框區(qū)域為空白對照加入的是PBS緩沖液，每個孔內(nèi)加入的均是50μl。=2\*GB2⑵37℃溫育30min，洗板4次；=3\*GB2⑶加入酶標抗體，生物素二抗，50μl/孔；=4\*GB2⑷37℃溫育30min，洗板4次；=5\*GB2⑸加入A、B液，50μl/孔，37℃溫育15分鐘；=6\*GB2⑹加入終止液，50μl/孔。1.3標準曲線制作及結(jié)果計算=1\*GB2⑴酶標板放入酶標儀，蓋上蓋子；=2\*GB2⑵在電腦上打開MicroplateManager5.2軟件；=3\*GB2⑶選擇450nm波長（參照波長630nm），設(shè)置LAYOUT和報告模式，測定各孔吸收值；=4\*GB2⑷輸入標準品各濃度值，以雙對數(shù)法制備標準曲線，獲取各孔的濃度值，打印標準曲線圖和計算結(jié)果。1.4統(tǒng)計學方法用MicrosoftExcel處理實驗數(shù)據(jù)。2結(jié)果2.1測得的OD值如下表1.73901.63801.08500.69200.33800.01500.88400.88801.21700.67400.35300.00900.53600.50901.21800.65600.33800.01000.27200.26001.23300.67400.34700.00900.14900.13801.24800.69600.34300.01200.06200.07100.00900.01200.00200.00900.00900.01100.00900.01100.0100圖4注：圖4與圖3相對應2.2標準曲線圖5由上圖可得出如下結(jié)論：標準曲線以濃度為橫坐標，以測得的OD值為縱坐標。由對應濃度和OD值得出的散點連成一條直線后，散點基本都在直線上，說明散點的線性非常好。在以后檢測乙肝表面抗原濃度的時候可以根據(jù)測出的OD值在標準曲線上找出對應的濃度。2.3準確度（回收率）計算各質(zhì)控品高中低三個濃度平均回收率分別為92.59%、100.887%、93.68%都在正常范圍內(nèi)如表1所示。ELISA法檢測VEGFR2-Fc的回收率準確度（回收率）計算VEGFR2-Fc(ng/ml)測定值(ng/ml)回收率(%)平均回收率RR(%)SD(%)64.99883.392.595.3065.63793.9565.64294.03365.71595.2565.78796.4533.093103.1100.8872.6033.005100.16732.91897.26733.005100.16733.112103.7331.51.37791.893.682.071.51.45096.6671.51.3772194.7331.51.40193.4表12.4精密度計算2.4.1板內(nèi)精密度板內(nèi)精密度質(zhì)控品各濃度組的RSD都小于15%，精密度良好，如表2所示。板內(nèi)精密度VEGFR2-Fc（ng/ml）測定值1測定值2測定值3測定值4測定值5RSD(%)64.9985.6375.6425.7155.7875.694±0.3185.58533.0933.0052.9183.0053.1123.027±0.0782.5771.51.3771.4501.3771.4211.4011.405±0.0312.210表22.4.2板間精密度板間各組濃度質(zhì)控品RSD都小于15%，說明板間精密度達到標準。如表3所示。板間精密度VEGFR2-Fc（ng/ml）測定值測定值測定值測定值測定值RSD(%)64.9985.6375.6425.7155.7875.694±0.3185.58565.4715.4235.6745.3235.7465.5274±0.1773.20265.7735.6745.7825.5475.6675.689±0.0961.68733.0933.0052.9183.0053.1123.027±0.0782.57732.8153.3353.1873.2212.9333.098±0.2166.97232.8863.3443.1183.2342.9973.116±0.1825.8411.51.3771.4501.3771.4211.4011.405±0.0312.2101.51.2261.2571.2271.5641.3341.322±0.14210.7411.51.6651.2431.2361.5411.3201.401±0.19213.704表32.5檢測限（LOD）計算：取空白孔的OD值的均數(shù)加2倍標準差。空白孔的OD值的均數(shù)=0.0098空白孔的OD值的標準差=0.0028LOD=0.0098+2*0.0028=0.01543討論通過圖4、圖5和表1、表2、表3可知本次實驗的準確度、板內(nèi)精密度、板間精密度、LOD值都復合實際，且各數(shù)據(jù)都趨于理想，對此我們做出分析：HBsAg是乙肝病毒感染后最早出現(xiàn)的血清標志物之一，因此HBsAg的檢測是診斷肝炎病毒感染的重要依據(jù)。而針對這項檢測的檢測方法的靈敏度與高特異性的高低以及二者的結(jié)合程度是影響檢驗結(jié)果的重要因素，直接關(guān)系到臨床診斷和用藥，所以對HBsAg的檢測方法的建立和方法的驗證是實驗成敗的關(guān)鍵所在。本實驗以HBsAg測定為例，為了對乙肝表面抗原ELISA法定量進行分析的方法學建立與驗證，以確認ELISA法定量檢測HBsAg能否較準確、快速地反映體內(nèi)乙肝病毒復制情況。按試劑說明書嚴格操作的同時做標準曲線。本實驗用的試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被人乙肝病毒表面抗原（HBsAg）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過溫浴并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人乙肝病毒表面抗原（HBsAg）呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。本實驗嚴格按試劑說明書操作的同時運用計算機軟件和酶標儀，測得了OD值且繪制出了標準曲線。本實驗采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA），通過倍比稀釋來完成其定量檢測。其中，標準品的濃度依次為：8、4、2、1、0.5、0.25ng/ml，每個濃度設(shè)置兩個孔，共十二個孔；質(zhì)控品的濃度依次為:6、3、1.5ng/ml，每個濃度設(shè)置五個孔，共十五個孔。往標準品、質(zhì)控品依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，而陰性對照加入等量PBS,經(jīng)過溫浴并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算質(zhì)控品的準確度、板內(nèi)精密度、板間精密度、LOD值。本實驗是設(shè)計精密，操作簡便、快捷。主要是通過對質(zhì)控品的準確度、板內(nèi)精密度、板間精密度、LOD值的計算和根據(jù)標準品的OD值得出的標準曲線，以確認ELISA法定量檢測HBsAg能否較準確、快速地反映體內(nèi)乙肝病毒復制情況。如圖5所示，標準曲線相關(guān)系數(shù)為0.9985，接近于1，即相關(guān)性良好。方法準確度(accuracy)，一般用相對回收率表示，表明用該方法測得的生物樣品中待測藥物的濃度與其真實濃度的接近程度，由表1可得出相對回收率符合參考值85%～115%，所以該測定方法比較準確。方法精密度(precision)，一般用RSD表示，對于ng／ml級水平的RSD一般應≤15％。由表2板內(nèi)精密度和表3板間精密度可知，板內(nèi)精密度完全符合要求，板間精密度基本符合要求。檢測限LOD，又稱方法的靈敏度，由計算得LOD=0.0154，說明本分析方法對于低濃度樣品的檢測靈敏度高。根據(jù)流行病學調(diào)查,我國人群乙型病毒肝炎感染率達10%左右,乙肝的實驗診斷對于其治療及預防有重要參考意義。ELLISA適用于乙肝表面抗原的定量測定,其優(yōu)點是快速、方便、操作簡單,且靈敏度相對于其他方法較高,自20世紀70年代以來,許多高靈敏度的測定方法應用于臨床免疫學檢測,特別是酶聯(lián)免疫法(ELLISA法)應用最廣，其解決了低濃度HBsAg的定量檢測問題,能夠及時有效的測定出乙肝表面抗原含量，對臨床診