密度梯度離心法課件

第三章離心技術(shù)

離心技術(shù)是根據(jù)顆粒在勻速圓周運動時受到一個外向的離心力的行為發(fā)展起來的一種分離分析技術(shù)。

第三章離心技術(shù)離心技術(shù)是根據(jù)顆粒在勻速1貝克曼庫爾特離心技術(shù)發(fā)展里程碑

1947

ModelE全球首臺分析型超速離心機。1947

ModelL全球首臺制備型超速離心機。1963

Type50Ti全球首個鈦金屬轉(zhuǎn)頭。1974

MicrofugeB全球首臺微量離心機。1976

TJ-6R全球首臺冷凍臺式超速離心機。貝克曼庫爾特離心技術(shù)發(fā)展里程碑1947

Model21979

L8Series全球首先采用微機控制及感應(yīng)電機驅(qū)動的超速離心機系列。1982

J21-M全球首臺采用感應(yīng)電機驅(qū)動的高速離心機。1984

TL-100全球首臺微量臺式超速離心機。1989

OptimaSeries首先采用半導(dǎo)體制冷的驅(qū)動系統(tǒng)的超速離心機系列。1989

NVT創(chuàng)新的近垂直轉(zhuǎn)頭,可快速提純DNA樣品。1991

OptimaXL-A重新設(shè)計的分析型超速離心機。1979

L8Series全球首先采用微機控制及感31994

AvantiJ全球獨有,利用可變磁阻驅(qū)動系統(tǒng)的高效離心。1996

OptimaXL-I擁有兩種檢測系統(tǒng)的分析型超速離心機。1998

OptimaMAX全球首臺超過一百萬離心力的臺式超速離心。1998

ARIES全球獨有可以自我修正平衡的轉(zhuǎn)頭。2002

OptiamL-XP全球首先采用觸幕式操作的超速離心機。2004

AllegraX-12全球唯一可處理細(xì)胞培臺式離心機。1994

AvantiJ全球獨有,利用可變磁阻驅(qū)動4離心技術(shù)的應(yīng)用：1、應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)：如化工、制藥、食品等工業(yè)大型制備。離心機轉(zhuǎn)速都在每分鐘5000轉(zhuǎn)以下。2、應(yīng)用于生物、醫(yī)學(xué)、化學(xué)等實驗室分析研究：分離和純化樣品，以及對純化樣品的有關(guān)性能進行研究。

離心技術(shù)的應(yīng)用：5第一節(jié)基本原理

一、離心力（centrifugalforce，F(xiàn)c）

離心作用是根據(jù)在一定角度速度下作圓周運動的任何物體都受到一個向外的離心力進行的。離心力（Fc）的大小等于離心加速度ω2X與顆粒質(zhì)量m的乘積，即：Fc=mω2X其中ω是旋轉(zhuǎn)角速度，以弧度/秒為單位；X是顆粒離開旋轉(zhuǎn)中心的距離，以cm為單位；m是質(zhì)量，以克為單位。第一節(jié)基本原理一、離心力（centrifugalf6

二、相對離心力（relativecentrifugalforce，RCF）由于各種離心機轉(zhuǎn)子的半徑或者離心管至旋轉(zhuǎn)軸中心的距離不同，離心力而受變化，因此在文獻中常用“相對離心力”或“數(shù)字×g”表示離心力，只要RCF值不變，一個樣品可以在不同的離心機上獲得相同的結(jié)果。一般情況下，低速離心時常以r／min來表示，高速離心時則以g(或數(shù)字Xg)表示。

二、相對離心力（relativecentrifugal7RCF就是實際離心場轉(zhuǎn)化為重力加速度的倍數(shù)。式中X為離心轉(zhuǎn)子的半徑距離，以cm為單位；g為地球重力加速度（980cm/sec2）；n為轉(zhuǎn)子每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)（rpm）。

RCF就是實際離心場轉(zhuǎn)化為重力加速度的倍數(shù)。8Dole和Cotzias制作了與轉(zhuǎn)子速度和半徑相對應(yīng)的離心力的轉(zhuǎn)換列線圖。見圖4-1。在用圖4-1將離心機轉(zhuǎn)數(shù)換成相對離心力時，先在離心機半徑標(biāo)尺上取已知的離心機半徑和在轉(zhuǎn)數(shù)標(biāo)尺上取已知的離心機轉(zhuǎn)數(shù)，然后將這兩點間劃一條直線，在圖中間RCF標(biāo)尺上的交叉點，即為相應(yīng)的離心力數(shù)值。Dole和Cotzias制作了與轉(zhuǎn)子速度和半徑相對應(yīng)的離心力925.4cm4200rpm25.4cm4200rpm10例已知離心機轉(zhuǎn)數(shù)為2500rpm，離心機的半徑為7.7cm，將兩點連接起來交于RCF標(biāo)尺，此交點500×g即是RCF值。

例已知離心機轉(zhuǎn)數(shù)為2500rpm，離心機的半徑為7.7cm，11

三、沉降系數(shù)（sedimentationcoefficient，S）1924年Svedberg對沉降系數(shù)下的定義：顆粒在單位離心力場中粒子移動的速度。三、沉降系數(shù)（sedimentationcoeffici12若ω用2πn/60表示，則式中X1為離心前粒子離旋轉(zhuǎn)軸的距離；X2為離心后粒子離旋轉(zhuǎn)軸的距離。若ω用2πn/60表示，則式中X1為離心前粒子離旋轉(zhuǎn)軸的距離13S實際上時常在10-13秒左右，故把沉降系數(shù)10-13秒稱為一個Svedberg單位，簡寫S，單位為秒。即：1S=10-13秒例：某物質(zhì)的沉降系數(shù)是10-12秒可寫成：10×10-13秒表示為：10S如：核蛋白體為70SS實際上時常在10-13秒左右，故把沉降系數(shù)10-13秒稱為14

細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)某些成分的沉降系數(shù)及其離心條件名稱沉降系數(shù)/SRCF/g轉(zhuǎn)速（rpm）細(xì)胞﹥107﹤200﹤1500細(xì)胞核4×106-7600~8003000線粒體2×104~

7×10470007000DNA10~1202×10540000RNA4~504×10560000Pr2~2574×105﹥60000細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)某些成分的沉降系數(shù)及其離心條件15四、沉降速度（sedimentationvelocity）

沉降速度是指在強大離心力作用下，單位時間內(nèi)物質(zhì)運動的距離。式中r為球形粒子半徑；d為球形粒子直徑；η為流體介質(zhì)的粘度；ρP為粒子的密度；ρm為介質(zhì)的密度。四、沉降速度（sedimentationvelocity）16

從上式可知，粒子的沉降速度與粒子直徑的平方、粒子的密度和介質(zhì)密度之差成正比；離心力場增大，粒子的沉降速度也增加，將此式代入上項沉降系數(shù)公式中，則S的表示式也可表示為：①當(dāng)ρP＞ρm，則S＞0，粒子順著離心方向沉降。②當(dāng)ρP＝ρm，則S＝0，粒子到達某一位置后達到平衡。③當(dāng)ρP＜ρm，則S＜0，粒子逆著離心方向上浮。從上式可知，粒子的沉降速度與粒子直徑的平方、粒子的密度和17五、沉降時間（sedimentationtime，Ts）在實際工作中，要將某種物質(zhì)從溶液中分離出來，必須知道所需轉(zhuǎn)速與時間。如果轉(zhuǎn)速已知，則需解決沉降時間來確定分離某粒子所需的時間。根據(jù)沉降系數(shù)（S）式可得：

五、沉降時間（sedimentationtime，Ts）18積分得：式中X2為離心轉(zhuǎn)軸中心至離心管底內(nèi)壁的距離；X1為離心轉(zhuǎn)軸至樣品溶液彎月面之間的距離，那么樣品粒子完全沉降到底管內(nèi)壁的時間（t2－t1）用Ts表示則式可改為：式中Ts以小時為單位，S以Svedberg為單位。積分得：19六、K系數(shù)（kfactor）

K系數(shù)是用來描述在一個轉(zhuǎn)子中，將粒子沉降下來的效率。也就是溶液恢復(fù)成澄清程度的一個指數(shù)，所以也叫“cleaningfactor”。原則上，K系數(shù)愈小的，愈容易，也愈快將粒子沉降。其中Rmax為轉(zhuǎn)子最大半徑；Rmin為轉(zhuǎn)子最小半徑。六、K系數(shù)（kfactor）20由其公式可知，K系數(shù)與離心轉(zhuǎn)速及粒子沉降的路徑有關(guān)。所以K系數(shù)是一個變數(shù)。當(dāng)轉(zhuǎn)速變，或者離心管的溶液量不同，即粒子沉降的路徑改變時，K系數(shù)就改變。通常，離心機的轉(zhuǎn)子說明書中提供的K系數(shù)，都是根據(jù)最大路徑及在最大轉(zhuǎn)速下所計算出來的數(shù)值。由其公式可知，K系數(shù)與離心轉(zhuǎn)速及粒子沉降的路徑有關(guān)。所以K系21如果已知粒子的沉降系數(shù)為80S的Polysome，采用的轉(zhuǎn)子的K系數(shù)是323，那么預(yù)計沉降到管底所需的離心時間是T＝k/S＝4h，利用此公式預(yù)估的離心時間，對水平式轉(zhuǎn)子最適合；對固定角式轉(zhuǎn)子而言，實際時間將比預(yù)估的時間來得快些。如果已知粒子的沉降系數(shù)為80S的Polysome，22

第二節(jié)離心機一、離心機的分類按轉(zhuǎn)速的大小(機頭的額定最高轉(zhuǎn)速)分為:①低速離心機：<10×103r／min②高速離心機：10×103~25×103r／min)③超速離心機：>30×103r／min第二節(jié)離心機一、離心機的分類23類型普通離心機高速離心機超速離心機最大轉(zhuǎn)速(r/min)600025000可達75000以上最大RCF（g）600089000可達510000以上分離形式固液沉淀固液沉淀分離密度梯度區(qū)帶分離或差速沉降分離轉(zhuǎn)子角式和外擺式角式、外擺式角式、外擺式、區(qū)帶儀器結(jié)構(gòu)速率不能嚴(yán)格控制，有消除空氣和轉(zhuǎn)子間備有消除轉(zhuǎn)子與空氣摩擦性能和特點多數(shù)室溫下操作摩擦熱的制冷裝置，熱的真空和冷卻系統(tǒng)，有速率和溫度控制較準(zhǔn)更為精確的溫度和速度控確、嚴(yán)格。制、監(jiān)測系統(tǒng)、有保證轉(zhuǎn)子正常運轉(zhuǎn)的傳動和制動裝置等。應(yīng)用收集易沉降的大顆粒收集微生物、細(xì)胞主要分離細(xì)胞器、病毒、（如RBC、酵母細(xì)胞等）碎片、大細(xì)胞器、核酸、蛋白質(zhì)、多糖等甚至硫酸銨沉淀物和免疫能分開分子大小相近的同位沉淀物等。但不能有素標(biāo)記物15N-DNA和未效沉淀病毒、小細(xì)胞器標(biāo)記的DNA。

（如核糖體）、蛋白質(zhì)等大分子。類型24二、離心機的結(jié)構(gòu)低速離心機：其主要部件是電機和轉(zhuǎn)軸。高速、超速離心機：驅(qū)動電機、制冷系統(tǒng)真空系統(tǒng)（超速離離心機有）顯示系統(tǒng)、自動保護系統(tǒng)控制系統(tǒng)組成二、離心機的結(jié)構(gòu)25三、離心轉(zhuǎn)子和離心管

（一）離心轉(zhuǎn)子離心轉(zhuǎn)子是超速、高速離心機的主要部件之一。由于超速、高速離心機工作時的轉(zhuǎn)速很高，相應(yīng)的離心力場則很大，離心轉(zhuǎn)頭均用高強度的鋁合金、鈦合金及超硬鋁、鍛鋁制成。三、離心轉(zhuǎn)子和離心管261、離心轉(zhuǎn)頭的分類（1）角轉(zhuǎn)子(nxedanglerotor)角轉(zhuǎn)子是各種類型離心機的基本轉(zhuǎn)子和最高速轉(zhuǎn)子。特點：角轉(zhuǎn)頭常用鋁或鈦合金制作，呈圓錐形。角轉(zhuǎn)頭中離心管的中心線與旋轉(zhuǎn)軸的夾角一般在15°~40°之間。優(yōu)點：具有強度高，重心低，運轉(zhuǎn)平穩(wěn)，離心時間短，壽命長，使用方便等。1、離心轉(zhuǎn)頭的分類27缺點：具有壁效應(yīng)，即靠近離心管外壁部形成強烈對流和渦旋，影響分離純度。應(yīng)用：常用于差速離心來分離s（沉降系數(shù)）值相差較大（1：10）的樣品。規(guī)格：角轉(zhuǎn)頭的規(guī)格較多，常見的有32×15ml，6×50ml等。缺點：具有壁效應(yīng)，即靠近離心管外壁部形成強烈對流和渦旋，影響28（2）水平轉(zhuǎn)頭(swing-outrotor)特點：鋁合金或鈦合金制成。離心管放人吊籃中，離心時，離心管中心線與旋轉(zhuǎn)中心線由平行而逐漸變?yōu)榇怪?。減少了由于對流和渦旋而引起的壁效應(yīng)，提高了分離純度。增加了沉降距離，所以離心時間也相應(yīng)增長。用途：速度區(qū)帶離心（2）水平轉(zhuǎn)頭(swing-outrotor)29（3）垂直轉(zhuǎn)頭(verticalrotor)特點：垂直轉(zhuǎn)頭是一種角度轉(zhuǎn)頭，離心管垂直放置。離心管與。應(yīng)用：等密度區(qū)帶離心sucrose速度區(qū)帶離心（3）垂直轉(zhuǎn)頭(verticalrotor)30

通常將離心管(加離心管帽或加可熱封的塑料管)密封后垂直插入轉(zhuǎn)頭內(nèi)。離心前，離心管中的樣品液受重力的作用液面呈水平分布。離心時，由于離心力作用使液面由水平分布轉(zhuǎn)為垂直分布，被分離顆粒沉降在后半管壁。這種由于離心作用使液面重新轉(zhuǎn)向分布稱為再定向。通常將離心管(加離心管帽或加可熱封的31圖（a）水平轉(zhuǎn)子；（b）固定轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)子；（c）垂直離心管轉(zhuǎn)子圖（a）水平轉(zhuǎn)子；（b）固定轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)子；（c）垂直離心管322、離心轉(zhuǎn)頭的常用標(biāo)記及轉(zhuǎn)頭參數(shù)

（1）轉(zhuǎn)頭標(biāo)記的意義

①符號：角度轉(zhuǎn)頭FA，垂直轉(zhuǎn)頭V；甩平轉(zhuǎn)頭Sw；連續(xù)轉(zhuǎn)頭CF；區(qū)帶轉(zhuǎn)頭Z。②英文字母后的數(shù)字表示該轉(zhuǎn)頭的最大額定轉(zhuǎn)速。③Ti表示由鈦或鈦合金為材料制成的轉(zhuǎn)頭，不標(biāo)則為鋁或鋁合金做成的轉(zhuǎn)頭。如：SW65Ti指該轉(zhuǎn)頭為甩平轉(zhuǎn)頭，最大額定轉(zhuǎn)速為65000r／min，轉(zhuǎn)頭由鈦金屬制成。2、離心轉(zhuǎn)頭的常用標(biāo)記及轉(zhuǎn)頭參數(shù)33(2)轉(zhuǎn)頭參數(shù)Rmax：從轉(zhuǎn)軸中心至離心管最外緣或離心管底的距離；Rmin：從轉(zhuǎn)軸中心至離心管最內(nèi)緣或離心管頂?shù)木嚯x；RPMmax：轉(zhuǎn)頭的最高安全轉(zhuǎn)速；FRCmax：轉(zhuǎn)頭以只fM，運轉(zhuǎn)時，在Rrna~處的相對離心力；

FRCmin：轉(zhuǎn)頭以RPMmax運轉(zhuǎn)時，在Rmin處的相對離心力；K：衡量轉(zhuǎn)頭相對效率的量，K值愈小，效率愈高，所需離心時間就愈短。(2)轉(zhuǎn)頭參數(shù)34（二）離心管常用的塑料離心管:聚乙烯管(PE)、纖維素管(CAB)、聚碳酸酯管(PC)和丙二醇酯管(PP)等。離心管有各種大小:1.5ml到1000ml。（二）離心管35選擇離心管時應(yīng)考慮下列的一些性能。1)

容量：由樣品的體積決定。注意在有些應(yīng)用中（如高速離心）離心管必須裝滿。2)

形狀：做收集沉淀時，用圓錐性管底的離心管較好；而進行密度梯度離心時圓底離心管更有用。3)

最大離心力：詳細(xì)信息由廠家提供。4)

耐腐蝕性：玻璃管是惰性物質(zhì)，但絕對不能在高、超速離心機上使用。聚碳酸酯管對有機溶劑（如乙醇、丙酮）敏感，而聚丙烯管具有更好的耐腐蝕性。詳細(xì)信息可參考廠家的說明書。選擇離心管時應(yīng)考慮下列的一些性能。365)

滅菌：一次性塑料離心管出廠時通常是消過毒的。玻璃管及聚丙烯管可重復(fù)滅菌使用。多次高壓滅菌可能會導(dǎo)致聚碳酸酯崩裂或變形。6)

透明度：玻璃管和聚碳酸酯是透明的，而聚丙烯管為半透明。7)

能否刺穿：若想用刺穿管壁的方法收集樣品，纖維素乙酸管和聚丙烯管易于用注射管針頭刺穿。8)

管帽：大多數(shù)角式及垂直管式轉(zhuǎn)子要求離心管有管帽，用以防止使用過程中樣品漏出并在離心過程中支撐離心管，防止其離心時變形。對于放射性樣品，即使是低速離心也一定要蓋管帽，并且要使用與所用離心管配套的管帽。5)

滅菌：一次性塑料離心管出廠時通常是消過毒的。玻璃管及聚37第三節(jié)離心技術(shù)一、離心技術(shù)的分類：根據(jù)離心原理，按照實際工作的需要，目前已設(shè)計出許多離心方法，綜合起來大致可分三類。

⒈平衡離心法根據(jù)粒子大小、形狀不同進行分離，包括差速離心法（differentialvelocitycentrifugation）和速率區(qū)帶離心法（ratezonalcentrifugation）。

⒉等密度離心法（jsopycniccentrifugation）又稱等比重離心法，依粒子密度差進行分離，等密度離心法和上述速率區(qū)帶離心法合稱為密度梯度離心法。⒊經(jīng)典式沉降平衡離心法用于對生物大分子分子量的測定、純度估計、構(gòu)象變化等。第三節(jié)離心技術(shù)一、離心技術(shù)的分類：38二、離心分離的方法

（一）差速離心法差速離心法是利用不同的粒子在離心力場中沉降的差別，在同一離心條件下，沉降速度不同，通過不斷增加相對離心力，使一個非均勻混合液內(nèi)的大小、形狀不同的粒子分部沉淀。操作過程中一般是在離心后用傾倒的辦法把上清液與沉淀分開，然后將上清液加高轉(zhuǎn)速離心，分離出第二部分沉淀，如此往復(fù)加高轉(zhuǎn)速，逐級分離出所需要的物質(zhì)。

差速離心法主要用于分離細(xì)胞器和病毒。二、離心分離的方法39優(yōu)點：操作簡單，離心后用傾倒法即可將上清液與沉淀分開，并可使用容量較大的角式轉(zhuǎn)子。缺點：①分離效果差，不能一次得到純顆粒；②分辨率不高，沉淀系數(shù)在同一個數(shù)量級內(nèi)的各種粒子不容易分開，常用于其他分離手段之前的粗制品提取。③壁效應(yīng)嚴(yán)重，特別是當(dāng)顆粒很大或濃度很高時，在離心管一側(cè)會出現(xiàn)沉淀。④顆粒被擠壓，離心力過大、離心時間過長會使顆粒變形、聚集而失活。例如用差速離心法分離細(xì)胞器沉降的順序依次為：核、線粒體、溶酶體與過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體、最后為核蛋白體。密度梯度離心法課件40（二）密度梯度離心法：密度梯度離心法是樣品在一定惰性梯度介質(zhì)中進行離心沉淀或沉降平衡，在一定離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶的分離方法。（二）密度梯度離心法：41優(yōu)點：①分離效果好，可一次獲得較純顆粒；②適應(yīng)范圍廣，既能分離具有沉淀系數(shù)差的顆粒，又能分離有一定浮力密度的顆粒；③顆粒不會積壓變形，能保持顆粒活性，并防止已形成的區(qū)帶由于對流而引起混合。缺點：①離心時間較長；②需要制備梯度；③操作嚴(yán)格，不宜掌握。優(yōu)點：①分離效果好，可一次獲得較純顆粒；421、速率區(qū)帶離心法速率區(qū)帶離心法是在離心前于離心管內(nèi)先裝入密度梯度介質(zhì)（如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等），待分離的樣品鋪在梯度液的頂部、離心管底部或梯度層中間，同梯度液一起離心。離心時，由于離心力的作用，顆粒離開原樣品層，按不同沉降速率沿管底沉降。離心一定時間后，沉降的顆粒逐漸分開，最后形成一系列界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶。沉降系數(shù)越大，往下沉降的越快，所呈現(xiàn)的區(qū)帶也越低。沉降系數(shù)較小的顆粒，則在較上部分依次出現(xiàn)。1、速率區(qū)帶離心法432、等密度離心法等密度離心法是在離心前預(yù)先配制介質(zhì)的密度梯度，此種密度梯度液包含了被分離樣品中所有顆粒的密度，待分離的樣品鋪在梯度液頂上或和梯度液先混合，離心開始后，梯度液由于離心力的作用逐漸形成管底濃而管頂稀的密度梯度，與此同時浮力密度不同的顆粒，在離心力場下，或向下沉降，或向上浮起，一直沿梯度移動到它們密度恰好相等的位置上（即等密度點）形成區(qū)帶。所形成的區(qū)帶，與樣品粒子的密度有關(guān)，而與顆粒的大小和其他參數(shù)無關(guān)。因此只要轉(zhuǎn)速、溫度不變，則延長離心時間也不能改變這些粒子的成帶位置。此法一般用于分離大小相近，而密度差異較大的物質(zhì)。2、等密度離心法44（三）梯度溶液的制備1、梯度材料的選擇原則

①與被分離的生物材料不發(fā)生反應(yīng)即完全惰性，且易與所分離的生物粒子分開。②可達到要求的密度范圍，且在所要求的密度范圍內(nèi)，粘度低，滲透壓低，離子強度和pH變化較小。③不會對離心設(shè)備發(fā)生腐蝕作用。④容易純化，價格便宜或容易回收。⑤濃度便于測定，如具有折光率。⑥對于超速離心分析工作來說，它的物理性質(zhì)、熱力學(xué)性質(zhì)應(yīng)該是已知的。這些條件是理想條件，完全符合每種性能的梯度材料幾乎是沒有的。（三）梯度溶液的制備45梯度材料：①糖類：蔗糖、甘油、聚蔗糖（Ficoll）、右旋糖酐、糖原。②無機鹽類：CsCl（氯化銫）、RbCl（氯化銣）、NaCl、KBr等。③有機碘化物：三碘苯甲酰葡萄糖胺（matrizamide）④硅溶膠：如Percoll。⑤蛋白質(zhì)：如牛血清白蛋白。⑥重水。⑦非水溶性有機物：如氟代碳等。梯度材料：46（四）分析性離心離心除了用于制備外，還可用于樣品的定性定量分析。在離心機上裝備光學(xué)系統(tǒng)，采用特殊的透光離心池，在離心過程中可以直接觀察樣品顆粒的沉降情況，以對樣品進行定性定量分析。（四）分析性離心47第四節(jié)離心機的使用及注意事項一、低速離心機的使用：1、開機：①將待離心溶液倒入大小適中的離心管中（溶液量不應(yīng)超過離心管總體積的2/3）。②離心管連同管套一起放在粗天平上平衡（管套底部應(yīng)放置橡皮墊）。③對稱放入離心機插孔中（不用的管套應(yīng)拿出），蓋緊上蓋。④開關(guān)置于“關(guān)”，調(diào)速旋鈕置于最小，接通電源，打開開關(guān)，緩慢啟動。⑤用調(diào)速旋鈕沿順時針方向緩慢調(diào)速，觀察轉(zhuǎn)速，達到轉(zhuǎn)速后開始計時。第四節(jié)離心機的使用及注意事項一、低速離心機的使用：482、關(guān)機：①停轉(zhuǎn)后打開上蓋，輕輕取樣。②關(guān)掉開關(guān)，切斷電源。③離心管套倒立放置，使其干燥。2、關(guān)機：49二、離心機使用注意事項1、精密地平衡離心管及其內(nèi)容物。

超速離心機轉(zhuǎn)頭是鑲置在一根很細(xì)的軸上，因此在兩支離心管平衡時重量之差不得超過各個離心機說明書上所規(guī)定的范圍。制備性超速離心機兩離心管平衡時重量之差不得超過0.1g。有的普通離心機帶有離心管套筒，平衡時應(yīng)帶上套筒。一臺離心機的套筒只能在該離心機上使用，不能在離心機之間(特別是不同型號的離心機之間)混用套筒。二、離心機使用注意事項502、平衡后的一對離心管及其內(nèi)容物(有時還可能包括離心管套筒)應(yīng)對稱放置，不能錯位，不能裝載單數(shù)的管子，以免因離心所產(chǎn)生的離心力不對稱而損壞離心軸。3、當(dāng)平衡的離心管及其內(nèi)容物(或包括套筒)對稱放置好后，蓋好離心機蓋子，打開電源，轉(zhuǎn)動速度調(diào)節(jié)旋鈕，逐步增加到所需要的離心速度，計算離心時間。

2、平衡后的一對離心管及其內(nèi)容物(有時還可能包括離心管套筒)514、當(dāng)離心到達所需要的時間后，再轉(zhuǎn)動速度調(diào)節(jié)旋鈕減速。待離心機自然停止轉(zhuǎn)動后取出離心管。關(guān)閉離心機電源，拔掉電源插，清潔整理離心機、離心管、套筒、天平等。4、當(dāng)離心到達所需要的時間后，再轉(zhuǎn)動速度調(diào)節(jié)旋鈕減速。待離心52

5、超速離心機帶自動控制的操作系統(tǒng)，待選定離心速度、時間等參數(shù)后，按啟動開關(guān)，離心機即自動開始轉(zhuǎn)動、記錄時間，并可自動停機(取決于輸入的控制信號)。在離心室被抽成真空前，離心機只作低速運轉(zhuǎn)。5、超速離心機帶自動控制的操作系統(tǒng)，待選定離心速度、時間等53

6、超速離心時，應(yīng)注意選擇合適的離心管和轉(zhuǎn)頭。根據(jù)待離心液體性質(zhì)及體積選擇合適的離心管，裝載液體時要按各種離心機具體操作說明進行。有的離心管無蓋，液體不能裝得過多，以防離心時甩出，造成轉(zhuǎn)頭生銹或被腐蝕。制備性超速離心機的離心管，常常要求必須將液體裝滿，以免離心時塑料離心管上部凹陷變形。6、超速離心時，應(yīng)注意選擇合適的離心管和轉(zhuǎn)頭。根據(jù)待離心液54根據(jù)轉(zhuǎn)速選擇合適的轉(zhuǎn)頭，當(dāng)轉(zhuǎn)速超過所用轉(zhuǎn)頭最大轉(zhuǎn)速的2.5％時，轉(zhuǎn)頭就會爆炸。離心完后，轉(zhuǎn)頭應(yīng)用溫水洗滌并干燥，一般水洗就足夠了，如必須使用去污劑時應(yīng)用中性去污劑，不可用堿性去污劑。用中性去污劑擦拭轉(zhuǎn)頭，用水除去全部去污劑再用蒸餾水沖凈。切勿將轉(zhuǎn)頭浸泡在去污劑中。洗凈的轉(zhuǎn)頭放在室溫中干燥，更好的辦法是將轉(zhuǎn)頭擦干，用理發(fā)吹風(fēng)機吹干，轉(zhuǎn)頭長期不用應(yīng)涂一層上光蠟保護。轉(zhuǎn)頭在使用中應(yīng)防止與其他物品碰撞，避免造成傷痕，如果發(fā)現(xiàn)有被腐蝕跡象，轉(zhuǎn)頭不應(yīng)再用。根據(jù)轉(zhuǎn)速選擇合適的轉(zhuǎn)頭，當(dāng)轉(zhuǎn)速超過所用轉(zhuǎn)頭最大轉(zhuǎn)速的2.555第三章離心技術(shù)

離心技術(shù)是根據(jù)顆粒在勻速圓周運動時受到一個外向的離心力的行為發(fā)展起來的一種分離分析技術(shù)。

第三章離心技術(shù)離心技術(shù)是根據(jù)顆粒在勻速56貝克曼庫爾特離心技術(shù)發(fā)展里程碑

1947

ModelE全球首臺分析型超速離心機。1947

ModelL全球首臺制備型超速離心機。1963

Type50Ti全球首個鈦金屬轉(zhuǎn)頭。1974

MicrofugeB全球首臺微量離心機。1976

TJ-6R全球首臺冷凍臺式超速離心機。貝克曼庫爾特離心技術(shù)發(fā)展里程碑1947

Model571979

L8Series全球首先采用微機控制及感應(yīng)電機驅(qū)動的超速離心機系列。1982

J21-M全球首臺采用感應(yīng)電機驅(qū)動的高速離心機。1984

TL-100全球首臺微量臺式超速離心機。1989

OptimaSeries首先采用半導(dǎo)體制冷的驅(qū)動系統(tǒng)的超速離心機系列。1989

NVT創(chuàng)新的近垂直轉(zhuǎn)頭,可快速提純DNA樣品。1991

OptimaXL-A重新設(shè)計的分析型超速離心機。1979

L8Series全球首先采用微機控制及感581994

AvantiJ全球獨有,利用可變磁阻驅(qū)動系統(tǒng)的高效離心。1996

OptimaXL-I擁有兩種檢測系統(tǒng)的分析型超速離心機。1998

OptimaMAX全球首臺超過一百萬離心力的臺式超速離心。1998

ARIES全球獨有可以自我修正平衡的轉(zhuǎn)頭。2002

OptiamL-XP全球首先采用觸幕式操作的超速離心機。2004

AllegraX-12全球唯一可處理細(xì)胞培臺式離心機。1994

AvantiJ全球獨有,利用可變磁阻驅(qū)動59離心技術(shù)的應(yīng)用：1、應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)：如化工、制藥、食品等工業(yè)大型制備。離心機轉(zhuǎn)速都在每分鐘5000轉(zhuǎn)以下。2、應(yīng)用于生物、醫(yī)學(xué)、化學(xué)等實驗室分析研究：分離和純化樣品，以及對純化樣品的有關(guān)性能進行研究。

離心技術(shù)的應(yīng)用：60第一節(jié)基本原理

一、離心力（centrifugalforce，F(xiàn)c）

離心作用是根據(jù)在一定角度速度下作圓周運動的任何物體都受到一個向外的離心力進行的。離心力（Fc）的大小等于離心加速度ω2X與顆粒質(zhì)量m的乘積，即：Fc=mω2X其中ω是旋轉(zhuǎn)角速度，以弧度/秒為單位；X是顆粒離開旋轉(zhuǎn)中心的距離，以cm為單位；m是質(zhì)量，以克為單位。第一節(jié)基本原理一、離心力（centrifugalf61

二、相對離心力（relativecentrifugalforce，RCF）由于各種離心機轉(zhuǎn)子的半徑或者離心管至旋轉(zhuǎn)軸中心的距離不同，離心力而受變化，因此在文獻中常用“相對離心力”或“數(shù)字×g”表示離心力，只要RCF值不變，一個樣品可以在不同的離心機上獲得相同的結(jié)果。一般情況下，低速離心時常以r／min來表示，高速離心時則以g(或數(shù)字Xg)表示。

二、相對離心力（relativecentrifugal62RCF就是實際離心場轉(zhuǎn)化為重力加速度的倍數(shù)。式中X為離心轉(zhuǎn)子的半徑距離，以cm為單位；g為地球重力加速度（980cm/sec2）；n為轉(zhuǎn)子每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)（rpm）。

RCF就是實際離心場轉(zhuǎn)化為重力加速度的倍數(shù)。63Dole和Cotzias制作了與轉(zhuǎn)子速度和半徑相對應(yīng)的離心力的轉(zhuǎn)換列線圖。見圖4-1。在用圖4-1將離心機轉(zhuǎn)數(shù)換成相對離心力時，先在離心機半徑標(biāo)尺上取已知的離心機半徑和在轉(zhuǎn)數(shù)標(biāo)尺上取已知的離心機轉(zhuǎn)數(shù)，然后將這兩點間劃一條直線，在圖中間RCF標(biāo)尺上的交叉點，即為相應(yīng)的離心力數(shù)值。Dole和Cotzias制作了與轉(zhuǎn)子速度和半徑相對應(yīng)的離心力6425.4cm4200rpm25.4cm4200rpm65例已知離心機轉(zhuǎn)數(shù)為2500rpm，離心機的半徑為7.7cm，將兩點連接起來交于RCF標(biāo)尺，此交點500×g即是RCF值。

例已知離心機轉(zhuǎn)數(shù)為2500rpm，離心機的半徑為7.7cm，66

三、沉降系數(shù)（sedimentationcoefficient，S）1924年Svedberg對沉降系數(shù)下的定義：顆粒在單位離心力場中粒子移動的速度。三、沉降系數(shù)（sedimentationcoeffici67若ω用2πn/60表示，則式中X1為離心前粒子離旋轉(zhuǎn)軸的距離；X2為離心后粒子離旋轉(zhuǎn)軸的距離。若ω用2πn/60表示，則式中X1為離心前粒子離旋轉(zhuǎn)軸的距離68S實際上時常在10-13秒左右，故把沉降系數(shù)10-13秒稱為一個Svedberg單位，簡寫S，單位為秒。即：1S=10-13秒例：某物質(zhì)的沉降系數(shù)是10-12秒可寫成：10×10-13秒表示為：10S如：核蛋白體為70SS實際上時常在10-13秒左右，故把沉降系數(shù)10-13秒稱為69

細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)某些成分的沉降系數(shù)及其離心條件名稱沉降系數(shù)/SRCF/g轉(zhuǎn)速（rpm）細(xì)胞﹥107﹤200﹤1500細(xì)胞核4×106-7600~8003000線粒體2×104~

7×10470007000DNA10~1202×10540000RNA4~504×10560000Pr2~2574×105﹥60000細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)某些成分的沉降系數(shù)及其離心條件70四、沉降速度（sedimentationvelocity）

沉降速度是指在強大離心力作用下，單位時間內(nèi)物質(zhì)運動的距離。式中r為球形粒子半徑；d為球形粒子直徑；η為流體介質(zhì)的粘度；ρP為粒子的密度；ρm為介質(zhì)的密度。四、沉降速度（sedimentationvelocity）71

從上式可知，粒子的沉降速度與粒子直徑的平方、粒子的密度和介質(zhì)密度之差成正比；離心力場增大，粒子的沉降速度也增加，將此式代入上項沉降系數(shù)公式中，則S的表示式也可表示為：①當(dāng)ρP＞ρm，則S＞0，粒子順著離心方向沉降。②當(dāng)ρP＝ρm，則S＝0，粒子到達某一位置后達到平衡。③當(dāng)ρP＜ρm，則S＜0，粒子逆著離心方向上浮。從上式可知，粒子的沉降速度與粒子直徑的平方、粒子的密度和72五、沉降時間（sedimentationtime，Ts）在實際工作中，要將某種物質(zhì)從溶液中分離出來，必須知道所需轉(zhuǎn)速與時間。如果轉(zhuǎn)速已知，則需解決沉降時間來確定分離某粒子所需的時間。根據(jù)沉降系數(shù)（S）式可得：

五、沉降時間（sedimentationtime，Ts）73積分得：式中X2為離心轉(zhuǎn)軸中心至離心管底內(nèi)壁的距離；X1為離心轉(zhuǎn)軸至樣品溶液彎月面之間的距離，那么樣品粒子完全沉降到底管內(nèi)壁的時間（t2－t1）用Ts表示則式可改為：式中Ts以小時為單位，S以Svedberg為單位。積分得：74六、K系數(shù)（kfactor）

K系數(shù)是用來描述在一個轉(zhuǎn)子中，將粒子沉降下來的效率。也就是溶液恢復(fù)成澄清程度的一個指數(shù)，所以也叫“cleaningfactor”。原則上，K系數(shù)愈小的，愈容易，也愈快將粒子沉降。其中Rmax為轉(zhuǎn)子最大半徑；Rmin為轉(zhuǎn)子最小半徑。六、K系數(shù)（kfactor）75由其公式可知，K系數(shù)與離心轉(zhuǎn)速及粒子沉降的路徑有關(guān)。所以K系數(shù)是一個變數(shù)。當(dāng)轉(zhuǎn)速變，或者離心管的溶液量不同，即粒子沉降的路徑改變時，K系數(shù)就改變。通常，離心機的轉(zhuǎn)子說明書中提供的K系數(shù)，都是根據(jù)最大路徑及在最大轉(zhuǎn)速下所計算出來的數(shù)值。由其公式可知，K系數(shù)與離心轉(zhuǎn)速及粒子沉降的路徑有關(guān)。所以K系76如果已知粒子的沉降系數(shù)為80S的Polysome，采用的轉(zhuǎn)子的K系數(shù)是323，那么預(yù)計沉降到管底所需的離心時間是T＝k/S＝4h，利用此公式預(yù)估的離心時間，對水平式轉(zhuǎn)子最適合；對固定角式轉(zhuǎn)子而言，實際時間將比預(yù)估的時間來得快些。如果已知粒子的沉降系數(shù)為80S的Polysome，77

第二節(jié)離心機一、離心機的分類按轉(zhuǎn)速的大小(機頭的額定最高轉(zhuǎn)速)分為:①低速離心機：<10×103r／min②高速離心機：10×103~25×103r／min)③超速離心機：>30×103r／min第二節(jié)離心機一、離心機的分類78類型普通離心機高速離心機超速離心機最大轉(zhuǎn)速(r/min)600025000可達75000以上最大RCF（g）600089000可達510000以上分離形式固液沉淀固液沉淀分離密度梯度區(qū)帶分離或差速沉降分離轉(zhuǎn)子角式和外擺式角式、外擺式角式、外擺式、區(qū)帶儀器結(jié)構(gòu)速率不能嚴(yán)格控制，有消除空氣和轉(zhuǎn)子間備有消除轉(zhuǎn)子與空氣摩擦性能和特點多數(shù)室溫下操作摩擦熱的制冷裝置，熱的真空和冷卻系統(tǒng)，有速率和溫度控制較準(zhǔn)更為精確的溫度和速度控確、嚴(yán)格。制、監(jiān)測系統(tǒng)、有保證轉(zhuǎn)子正常運轉(zhuǎn)的傳動和制動裝置等。應(yīng)用收集易沉降的大顆粒收集微生物、細(xì)胞主要分離細(xì)胞器、病毒、（如RBC、酵母細(xì)胞等）碎片、大細(xì)胞器、核酸、蛋白質(zhì)、多糖等甚至硫酸銨沉淀物和免疫能分開分子大小相近的同位沉淀物等。但不能有素標(biāo)記物15N-DNA和未效沉淀病毒、小細(xì)胞器標(biāo)記的DNA。

（如核糖體）、蛋白質(zhì)等大分子。類型79二、離心機的結(jié)構(gòu)低速離心機：其主要部件是電機和轉(zhuǎn)軸。高速、超速離心機：驅(qū)動電機、制冷系統(tǒng)真空系統(tǒng)（超速離離心機有）顯示系統(tǒng)、自動保護系統(tǒng)控制系統(tǒng)組成二、離心機的結(jié)構(gòu)80三、離心轉(zhuǎn)子和離心管

（一）離心轉(zhuǎn)子離心轉(zhuǎn)子是超速、高速離心機的主要部件之一。由于超速、高速離心機工作時的轉(zhuǎn)速很高，相應(yīng)的離心力場則很大，離心轉(zhuǎn)頭均用高強度的鋁合金、鈦合金及超硬鋁、鍛鋁制成。三、離心轉(zhuǎn)子和離心管811、離心轉(zhuǎn)頭的分類（1）角轉(zhuǎn)子(nxedanglerotor)角轉(zhuǎn)子是各種類型離心機的基本轉(zhuǎn)子和最高速轉(zhuǎn)子。特點：角轉(zhuǎn)頭常用鋁或鈦合金制作，呈圓錐形。角轉(zhuǎn)頭中離心管的中心線與旋轉(zhuǎn)軸的夾角一般在15°~40°之間。優(yōu)點：具有強度高，重心低，運轉(zhuǎn)平穩(wěn)，離心時間短，壽命長，使用方便等。1、離心轉(zhuǎn)頭的分類82缺點：具有壁效應(yīng)，即靠近離心管外壁部形成強烈對流和渦旋，影響分離純度。應(yīng)用：常用于差速離心來分離s（沉降系數(shù)）值相差較大（1：10）的樣品。規(guī)格：角轉(zhuǎn)頭的規(guī)格較多，常見的有32×15ml，6×50ml等。缺點：具有壁效應(yīng)，即靠近離心管外壁部形成強烈對流和渦旋，影響83（2）水平轉(zhuǎn)頭(swing-outrotor)特點：鋁合金或鈦合金制成。離心管放人吊籃中，離心時，離心管中心線與旋轉(zhuǎn)中心線由平行而逐漸變?yōu)榇怪?。減少了由于對流和渦旋而引起的壁效應(yīng)，提高了分離純度。增加了沉降距離，所以離心時間也相應(yīng)增長。用途：速度區(qū)帶離心（2）水平轉(zhuǎn)頭(swing-outrotor)84（3）垂直轉(zhuǎn)頭(verticalrotor)特點：垂直轉(zhuǎn)頭是一種角度轉(zhuǎn)頭，離心管垂直放置。離心管與。應(yīng)用：等密度區(qū)帶離心sucrose速度區(qū)帶離心（3）垂直轉(zhuǎn)頭(verticalrotor)85

通常將離心管(加離心管帽或加可熱封的塑料管)密封后垂直插入轉(zhuǎn)頭內(nèi)。離心前，離心管中的樣品液受重力的作用液面呈水平分布。離心時，由于離心力作用使液面由水平分布轉(zhuǎn)為垂直分布，被分離顆粒沉降在后半管壁。這種由于離心作用使液面重新轉(zhuǎn)向分布稱為再定向。通常將離心管(加離心管帽或加可熱封的86圖（a）水平轉(zhuǎn)子；（b）固定轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)子；（c）垂直離心管轉(zhuǎn)子圖（a）水平轉(zhuǎn)子；（b）固定轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)子；（c）垂直離心管872、離心轉(zhuǎn)頭的常用標(biāo)記及轉(zhuǎn)頭參數(shù)

（1）轉(zhuǎn)頭標(biāo)記的意義

①符號：角度轉(zhuǎn)頭FA，垂直轉(zhuǎn)頭V；甩平轉(zhuǎn)頭Sw；連續(xù)轉(zhuǎn)頭CF；區(qū)帶轉(zhuǎn)頭Z。②英文字母后的數(shù)字表示該轉(zhuǎn)頭的最大額定轉(zhuǎn)速。③Ti表示由鈦或鈦合金為材料制成的轉(zhuǎn)頭，不標(biāo)則為鋁或鋁合金做成的轉(zhuǎn)頭。如：SW65Ti指該轉(zhuǎn)頭為甩平轉(zhuǎn)頭，最大額定轉(zhuǎn)速為65000r／min，轉(zhuǎn)頭由鈦金屬制成。2、離心轉(zhuǎn)頭的常用標(biāo)記及轉(zhuǎn)頭參數(shù)88(2)轉(zhuǎn)頭參數(shù)Rmax：從轉(zhuǎn)軸中心至離心管最外緣或離心管底的距離；Rmin：從轉(zhuǎn)軸中心至離心管最內(nèi)緣或離心管頂?shù)木嚯x；RPMmax：轉(zhuǎn)頭的最高安全轉(zhuǎn)速；FRCmax：轉(zhuǎn)頭以只fM，運轉(zhuǎn)時，在Rrna~處的相對離心力；

FRCmin：轉(zhuǎn)頭以RPMmax運轉(zhuǎn)時，在Rmin處的相對離心力；K：衡量轉(zhuǎn)頭相對效率的量，K值愈小，效率愈高，所需離心時間就愈短。(2)轉(zhuǎn)頭參數(shù)89（二）離心管常用的塑料離心管:聚乙烯管(PE)、纖維素管(CAB)、聚碳酸酯管(PC)和丙二醇酯管(PP)等。離心管有各種大小:1.5ml到1000ml。（二）離心管90選擇離心管時應(yīng)考慮下列的一些性能。1)

容量：由樣品的體積決定。注意在有些應(yīng)用中（如高速離心）離心管必須裝滿。2)

形狀：做收集沉淀時，用圓錐性管底的離心管較好；而進行密度梯度離心時圓底離心管更有用。3)

最大離心力：詳細(xì)信息由廠家提供。4)

耐腐蝕性：玻璃管是惰性物質(zhì)，但絕對不能在高、超速離心機上使用。聚碳酸酯管對有機溶劑（如乙醇、丙酮）敏感，而聚丙烯管具有更好的耐腐蝕性。詳細(xì)信息可參考廠家的說明書。選擇離心管時應(yīng)考慮下列的一些性能。915)

滅菌：一次性塑料離心管出廠時通常是消過毒的。玻璃管及聚丙烯管可重復(fù)滅菌使用。多次高壓滅菌可能會導(dǎo)致聚碳酸酯崩裂或變形。6)

透明度：玻璃管和聚碳酸酯是透明的，而聚丙烯管為半透明。7)

能否刺穿：若想用刺穿管壁的方法收集樣品，纖維素乙酸管和聚丙烯管易于用注射管針頭刺穿。8)

管帽：大多數(shù)角式及垂直管式轉(zhuǎn)子要求離心管有管帽，用以防止使用過程中樣品漏出并在離心過程中支撐離心管，防止其離心時變形。對于放射性樣品，即使是低速離心也一定要蓋管帽，并且要使用與所用離心管配套的管帽。5)

滅菌：一次性塑料離心管出廠時通常是消過毒的。玻璃管及聚92第三節(jié)離心技術(shù)一、離心技術(shù)的分類：根據(jù)離心原理，按照實際工作的需要，目前已設(shè)計出許多離心方法，綜合起來大致可分三類。

⒈平衡離心法根據(jù)粒子大小、形狀不同進行分離，包括差速離心法（differentialvelocitycentrifugation）和速率區(qū)帶離心法（ratezonalcentrifugation）。

⒉等密度離心法（jsopycniccentrifugation）又稱等比重離心法，依粒子密度差進行分離，等密度離心法和上述速率區(qū)帶離心法合稱為密度梯度離心法。⒊經(jīng)典式沉降平衡離心法用于對生物大分子分子量的測定、純度估計、構(gòu)象變化等。第三節(jié)離心技術(shù)一、離心技術(shù)的分類：93二、離心分離的方法

（一）差速離心法差速離心法是利用不同的粒子在離心力場中沉降的差別，在同一離心條件下，沉降速度不同，通過不斷增加相對離心力，使一個非均勻混合液內(nèi)的大小、形狀不同的粒子分部沉淀。操作過程中一般是在離心后用傾倒的辦法把上清液與沉淀分開，然后將上清液加高轉(zhuǎn)速離心，分離出第二部分沉淀，如此往復(fù)加高轉(zhuǎn)速，逐級分離出所需要的物質(zhì)。

差速離心法主要用于分離細(xì)胞器和病毒。二、離心分離的方法94優(yōu)點：操作簡單，離心后用傾倒法即可將上清液與沉淀分開，并可使用容量較大的角式轉(zhuǎn)子。缺點：①分離效果差，不能一次得到純顆粒；②分辨率不高，沉淀系數(shù)在同一個數(shù)量級內(nèi)的各種粒子不容易分開，常用于其他分離手段之前的粗制品提取。③壁效應(yīng)嚴(yán)重，特別是當(dāng)顆粒很大或濃度很高時，在離心管一側(cè)會出現(xiàn)沉淀。④顆粒被擠壓，離心力過大、離心時間過長會使顆粒變形、聚集而失活。例如用差速離心法分離細(xì)胞器沉降的順序依次為：核、線粒體、溶酶體與過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體、最后為核蛋白體。密度梯度離心法課件95（二）密度梯度離心法：密度梯度離心法是樣品在一定惰性梯度介質(zhì)中進行離心沉淀或沉降平衡，在一定離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶的分離方法。（二）密度梯度離心法：96優(yōu)點：①分離效果好，可一次獲得較純顆粒；②適應(yīng)范圍廣，既能分離具有沉淀系數(shù)差的顆粒，又能分離有一定浮力密度的顆粒；③顆粒不會積壓變形，能保持顆粒活性，并防止已形成的區(qū)帶由于對流而引起混合。缺點：①離心時間較長；②需要制備梯度；③操作嚴(yán)格，不宜掌握。優(yōu)點：①分離效果好，可一次獲得較純顆粒；971、速率區(qū)帶離心法速率區(qū)帶離心法是在離心前于離心管內(nèi)先裝入密度梯度介質(zhì)（如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等），待分離的樣品鋪在梯度液的頂部、離心管底部或梯度層中間，同梯度液一起離心。離心時，由于離心力