調q激光與豚鼠表皮色素沉著與量效關系研究

目

錄英文縮略詞表中文摘要英文摘要研究內容

…………3…………4…………7………101.引言

……………102.對象與方法………122.1研究對象

……………………122.1.1動物的選擇……………………122.1.2實驗動物及方案………………132.1儀器與設備……………………132.3研究方法………142.3.1UVB照射………142.3.2激光治療………152.3.3皮膚顏色的測定………………162.3.4共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）觀察

……172.3.5組織學觀察……………………182.3.6療效觀察主要儀器……………202.4數據處理及統計學分析

………203.結果………………203.1皮膚反應…………203.2皮膚生理測試……………………223.2.1同一激光不同能量間比較（Q-694/Q-1064………………223.2.2兩種激光之間比較（Q-694和Q-1064）……243.2.32周、4周、8周后療效的比較……………25-1-3.3CLSM觀察…………253.4組織病理學觀察…………………284.討論…………………295.結論…………………356.參考文獻……………36附錄（個人簡歷及發(fā)表論文）…………40致謝………………………41課題綜述…………………42-2-英文縮略詞表-3-縮寫詞縮寫詞中文名稱英文名稱CLSM共聚焦激光掃描顯微鏡ConfocallaserscanningmicroscopeSPSS社會科學統計軟件包StatisticsPackageforSocialScienceMC黑素細胞MelanocyteKC角質形成細胞KeratinocytesUVB中波紫外線UltravioletBNd：YAG釔鋁石榴石Neodymium-dopedYttriumAluminiumGarnetMCI黑素指數MelanincontentindexPIH炎癥后色素沉著Post-inflammatoryhyperpigmentationCO2二氧化碳CarbondioxideIPL強脈沖光IntensepulsedlightPCNA增殖細胞核抗原ProliferatingCellNuclearAntigenDNA脫氧核糖核酸Deoxyribonucleicacid中文摘要調Q激光與豚鼠表皮色素沉著的量效關系研究研究生

胡玲玲導

師

宋為民（安徽醫(yī)科大學附屬杭州臨床學院，杭州，310009）背景較多損容性皮膚病與色素沉著密切相關，例如炎癥后色素沉著（PIH）、雀斑和黃褐斑等，臨床常見但治療困難，且療效不確定。傳統治療一直都是藥物治療為主，其主要目的是抑制黑素細胞活性及增生、抑制黑素顆粒形成及加速降解。外治藥物主要包括化學剝脫劑、單用或聯合皮膚脫色劑、類視黃醇類和皮質激素類、維生素C及其衍生物類和一些天然植物提取物等。這些藥物療法往往起效較慢，且療效欠佳，不良反應較多，例如皮膚刺激、過敏等，甚至有引起新的色素沉著風險。因此，如何研究皮膚色素沉著的規(guī)律，如何有效又快速地治療色素沉著，業(yè)已成為皮膚美容科醫(yī)生的難點和興趣點?，F代激光技術是以“選擇性光熱作用理論”為前提。利用“選擇性光熱作用”的調Q激光技術降低了對正常皮膚的熱損傷作用，提高了安全性，痛苦小且不留疤痕，國內外有成功治療雀斑、黃褐斑、炎癥后色素沉著的臨床病例報道。但是，調Q激光技術也是一把“雙刃劍”，一方面在可以治療色素沉著性皮膚病的同時，另一方面，在亞洲人種最常見的FitzpatrickⅢ～IV型人群中，調Q激光在常規(guī)能量參數或較高能量參數下又非常容易引發(fā)新的色素沉著（俗稱“激光的光斑反應”），因此，此類激光對色素沉著性皮膚病的治療利弊爭議一直不斷。近年來，有部分國外學者試用低能量參數的調Q激光治療色素沉著取得了一定的效果：但是對皮膚色素沉著的調Q激光治療缺乏相關的動物實驗支持和理論研究探討，更缺乏量效關系的研究。因此，對這方面的研究意義重大。-4-目的研究調Q激光對紫外線照射引起皮膚色素沉著的治療改善作用，研究調Q激光不同波長不同能量梯度對皮膚黑素顆粒和黑素細胞的形態(tài)和功能影響的量效關系，為進一步開發(fā)新的低能量治療模式提供實驗依據和參考。研究對象與方法

浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心10只棕黃色豚鼠，①采用中波紫外線（UVB）照射豚鼠背部皮膚誘導色素沉著實驗動物模型；②選擇了調QNd:YAG激光（波長1064nm，以下簡稱Q-1064）和調Q紅寶石激光(波長694nm，以下簡稱Q-694)2種激光各3個能量參數，觀察其對實驗動物皮膚色素沉著的不同治療作用；③皮膚生理功能測試和共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）全程活體的動態(tài)觀察，實驗前、中、后再取材組織病理觀察黑素細胞（MC）和黑素顆粒的變化等，分析色素沉著的不同治療反應與調Q激光能量能量的量效關系。④采用SPSS13.0統計軟件對實驗結果行多個樣本均數的方差分析和t檢驗，p<0.05為有統計學意義。結果①兩種激光治療療效相比：Q-694治療后的黑素指數均數為，Q-1064治療后的黑素指數均數為，兩組比較，療效差異顯著，說明Q-694療效優(yōu)于Q-1064；②同一種激光不同能量組治療療效相比：兩種激光的最佳效應組均為低能量組，肉眼觀察治療區(qū)色素沉著完全消退，且維持時間長于其他能量組；皮膚黑素指數(MCI)明顯下降，與其它組比較，差異有統計學意義（）；硫酸亞鐵染色和CLSM結果顯示色素沉積量、黑素顆粒和MC的數目、密度明顯減小。中高能量組皮膚色素沉著在治療結束后4～8周均有不同程度復發(fā)。結論調Q激光治療豚鼠皮膚色素沉著療效確切，皮膚組織效應程度與能量、治療頻率之間存在一定的關系，小能量多次治療療效較好。Q-694和Q-1064相比，-5-Q-694治療表皮色素沉著療效更好。應用CLSM可以直觀的觀察到調Q激光治療后的黑素變化。關鍵詞激光；量效關系；皮膚；色素沉著-6-AbstractDose-effectRelationshipofQ-switchLaseronskinpigmentationinGuineaPigsPost-graduate:Preceptor:

LingLingHuWeiminSong（AnhuiMedicalUniversityAffiliatedHangzhouHospital，Hangzhou，310009）Background:ManySkindiseasesthatbreakdownthecosmeticappearancearemorecloselyrelatedtoskinpigmentation,suchaspost-inflammatoryhyperpigmentation(post-inflammatoryhyperpigmentation,PIH),frecklesandmelasma,etc.Theyareverycommonclinicaldiseases,butthemethodstotreatthemwasdifficultandtheeffectisuncertainty.Drugtherapyisamainchoicefortraditionaltreatment,anditsbasicprinciplesaretoinhibittheactivityandproliferationofmelanocytes,blocktheformationofblackpigmentparticlesandacceleratetheirdegradation.Chemicalpeelagents,aloneorincombinationskinbleachingagents,retinoicalcoholandcorticosteroids,vitaminCanditsderivatives,andchineseherbaldrugsarethetopicalmedicationforexternalapplication.Theonsetofthesedrugtherapyisoftenslow,andtheirefficacyispoor,withmoreadversereactions,suchasskinirritation,allergies,andevencauseariskofnewpigmentation.Therefore,howtofindthedisciplineofskinpigmentation,andtreatthemeffectivelyandrapidly,hasbecomeadifficultyandainterestofdermatologists.Basedon"selectivephotothermolysistheory",Q-switchedlasertechniquereducesheatdamagetonormalskin,andimprovethesafety,withlesspainandscar.Manypatientswhohavefreckles,melasma,postinflammatoryhyperpigmentationorother-7-skinhyperpigmentationhavebeensuccessfullytreatedbyQ-switchedlaserathomeandabroad.However,Q-switchedlasertechniqueisan"doubleedgedsword".Ononehand,thetechniquecantreatskinpigmentationeffectively,ontheotherhand,intheAsianethnicgroup(theFitzpatrickⅢ-Ⅴtype),Q-switchedlaserintheregularorhigherenergyparameters,areveryeasytotriggeranewpigmentation(commonlyknownas"laserspotresponse"),sothatcontroversyhasragedamongprosandconsofsuchlasertreatmenttechnologyforskinpigmentation.Inrecentyears,someoftheforeignscholarstriedlowenergyofQ-switchedlasertotreatskinpigmentationandachievedsomeeffect.Butthistechniqueislackofrelevantanimalexperimentsandtheoreticalsupport,especiallydose-effectrelationshipresearch.Therefore,researchinthisareaisveryimportant.Objective:ToinvestigatetheeffectoffluenceonthetreatmentofUVB-inducedhyperpigmentationofthebrownguineapigskinusingdifferentenergyindifferentQ-switchedlaserandobservethechangeofmelaningranulesandmelanocytesofskin.Todevelopanew“l(fā)ow-energytreatment”modelthatcanbeusedasreferencestandardinlaserstudies,byanalyzingtherelationshipbetweentheeffectandthedose.Objectsandmethods:Tenbrownguineapigs(ZhejiangChineseMedicalUniversityExperimentalAnimalCenter,China),①inducedaanimalmodelofpigmentationusingultravioletB(UVB)radiation;②SelecttheQswitchedNd:YAGlaser(1064nm)andtheQswitchedrubylaser(694nm)indifferentparametersoftreatmentrespectivelytoirradiatetheguineapigs’pigmentedshin,andevaluatetheeffectoffluenceonthetreatmentofUVB-inducedhyperpigmentationofthebrownguineapigskin;③Visual,skinmulti-functionaldetector’s,confocallaserscanningmicroscopy(CLSM)’sandhistologicalanalyseswereaccomplishedbefore,duringandafterlasertreatmenttoevaluatetheefficacyinthetreatmentanddose-effectrelationshipofQ-switchLaseron-8-skinpigmentationinGuineaPigs.④DatafromthestudywereanalyzedwithanalysisofvarianceandttestbySPSS(13.0)todeterminetherelationshipbetweentherapeuticeffect.p<0.05wasconsideredstatisticallysignificant.Results:①Comparisonbetweentheefficacyofdifferentlaser:theamountofmelaninafterQ-694treatmentislessthanthatofQ-1064treatment,whichmeantQ-694moreeffectivethanQ-1064inthetreatmentofUVB-inducedhyperpigmentationofthebrownguineapigskin.②Comparisonbetweentheefficacyofdifferentdosesofthesamelaser:theoptimaleffectwasobtainedatlowestdosegroup:completeclearanceofhyperpigmentationwasachieved,withnorecurrenceinalonertimethanothergroups;melanincontentindex(MCI)decreasedsignificantlycomparedwithothergroups（F=4.2,P）;theCLSMimagesshowedadrasticdecreaseinthereflectionfromepidermal-basalkeratinocytes,dendriticmelanocytesbecameinvisible,andthestainingintensitysignificantlydecreasedinbasallayers.Onthecontrary,othergroupsalldevelopedreboundhyperpigmentation.Conclusions:ThehistologicaleffectofQ-switchedlaseronpigmentedskinofguineapigsiscloselyrelatedtothepulseenergyandthefrequency,lowerenergywhilerelativelymoretimesoftreatmentmaybeabetterwaytogetoptimaleffects.ComparedtoQ-1064,Q-694hasbetterefficacyfortreatingepidermalpigmentation.Theconfocallaserscanningmicroscopymightdirectlyobservethemelainofthemelanocyte.Keywords:laser/dose-effectrelationship/skin/hyperpigmentation-9-調Q激光與豚鼠表皮色素沉著的量效關系研究碩士研究生

胡玲玲導

師

宋為民副教授1.引言色素沉著性皮膚病，包括黃褐斑、老年斑、咖啡斑、雀斑和日光性黑子等，是皮膚科中常見的疾病之一。盡管色素沉著可以在任何膚色的人種發(fā)生，但是在FitzpatrickIV、V和VI型皮膚更常見[1]，主要包括亞洲人，且在紫外線照射后加重[2]?？赡苡捎趤喼奕吮砥群谒睾勘雀呒铀魅烁?，或者與人種、皮膚類型、全身狀況有關。色素沉著性皮膚病在病理上均表現有表皮和或真皮黑素顆粒數量的增加，但其合成黑素顆粒的黑素細胞（melanocyte,MC），其結構、功能和數量，在這些疾病間卻不盡相同。引起色素沉著的常見原因有遺傳、內分泌失調、紫外線輻射、內臟疾病和微生物失衡，有些還與皮膚感染、過敏反應、機械損傷、藥物反應、光毒性藥疹、炎癥性疾病、新陳代謝功能減弱、皮膚干燥、衰老、妊娠、口服避孕藥、睡眠不足、身體勞累等等有關

[3-4]

，導致MC功能亢進或活性增加，加速黑素形成。隨著年齡的增長，皮膚色素沉著增多，尤其當暴露部位如面部患病時，嚴重影響人們的面部美觀，帶來了衰老的心理壓力，甚至影響生活質量。由于發(fā)病原因不同，其臨床表現與治療也不一樣。目前治療的機制主要有：抑制黑素細胞活性，抑制黑素顆粒(melaningranule)的合成、分泌及轉運，破壞黑素顆粒、加速黑素顆粒的降解等[5]。治療方法非常多，包括藥物治療、物理治療、激光治療等。藥物治療上常采用維生素C、維生素E和還原型谷胱甘肽等系統用藥，以及中醫(yī)中藥辨證調理治療；外用氫醌、維A酸、壬二酸、曲酸、熊-10-果苷、皮質類固醇激素、類視黃醇類、煙酰胺、化瘀消斑的中藥外用制劑及中藥面膜等局部治療[6]；物理治療包括化學剝脫術、皮膚磨削術、電灼、液氮冷凍等方法。以上治療可單用或聯合治療，但總的來說療效不甚滿意，而且外用激素、脫色劑、化學剝脫劑和一些中藥或植物提取物等可引起刺激反應，如產生紅斑和鱗屑等，增加了炎癥后色素沉著(post-inflammatoryhyperpigmentation,PIH)的風險。物理治療因產生瘢痕和色素紊亂的風險較大，而限制了此方法的推廣。傳統的激光治療如CO2激光等也均有損傷面大，操作深度不好掌握，易留疤痕、PIH等副作用。現代激光技術運用“選擇性光熱作用原理”破壞黑素顆粒，近乎完美地治療了很多色素沉著性皮膚病。由于黑素對光的廣譜吸收性能，目前有很多激光能應用于色素性皮損的治療，包括紅色激光（紅寶石、翠綠寶石）、近紅外激光（Nd:YAG）和綠色激光（510nm脈沖染料激光，倍頻Nd:YAG532nm）等。色素團塊在受到特定波長的激光照射后，能夠選擇性地吸收激光能量，在瞬間產生爆破效應，變成色素粉塵，或者隨皮屑排除體外，或者隨淋巴循環(huán)/血液循環(huán)被逐漸運走，從而達到祛除色斑的療效。綠色激光可進一步分為脈沖激光和非脈沖激光，而紅色和近紅外激光，目前看來只有脈沖激光系統，即調Q（Q-switched）模式。這類激光的脈寬極短，幾-9黑素顆粒驟然受熱而發(fā)生瞬間爆破。由于其脈寬小于黑素顆粒的熱馳豫時間，因此治療中對周圍正常組織的損傷很小，是目前治療色素沉著性皮膚病的較有效方法[7]。臨床治療表皮層的色素斑，如雀斑、咖啡斑，日光性黑子等，多采用調Q激光，包括調Q694nm的紅寶石激光、調Q755nm的翠綠寶石激光和調Q532nm的倍頻Nd:YAG激光。對于真皮的色素沉著性疾病如太田痣、顴部褐青色痣等必須采用波長較長的激光，這樣才有足夠的穿透深度，如調Q1064nm的Nd:YAG激光。但是，在常規(guī)能量和較高能量參數下，調Q激光尤其是短波長的調Q激光在我們亞洲深膚色人種中極易產生PIH。因此，為了發(fā)揮調Q激光治療的優(yōu)勢，避-11-個納秒～幾百個納秒（ns,1ns=10s），峰值功率極高，可達10～100MW，可使個納秒～幾百個納秒（ns,1ns=10s），峰值功率極高，可達10～100MW，可使免和減輕副作用，選擇合適的治療參數在深膚色的色素沉著患者的治療中顯得非常重要。近年來，尤其在亞洲深膚色人種，調Q激光在低能量下（～2）對治療淺在的色素沉著性皮膚病如黃褐斑、PIH亦有一定的療效[8，9]。結合我們近期臨床使用低能量Flat-Top技術的調QNd:YAG（1064nm）激光治療黃褐斑的經驗，引起了我們對調Q激光治療皮膚色素沉著的療效與激光能量之間量效關系的興趣。Murphy[10]認為中國人膚色較深，治療的能量應與高加索白人不同，但是目前具體量效關系尚無相關研究報道，且國際上只有調Q激光治療實驗動物正常皮膚的觀察研究，對皮膚色素沉著使用調Q激光治療缺乏相關的動物實驗支持和理論探討。本研究采用中波紫外線（UVB）照射棕黃色豚鼠皮膚誘導色素沉著的實驗動物模型，以分析激光照射前后皮膚潛在的微觀結構的變化作為主要目標，對兩種激光治療皮膚色素沉著進行了一些基礎研究。本文首先通過總結不同波長激光與皮膚組織相互作用的特性，選擇調Q紅寶石激光(波長694nm，以下簡稱Q-694)和調QNd:YAG激光(波長1064nm，以下簡稱Q-1064)兩種對治療皮膚色素沉著有代表性的激光，分別進行不同能量密度的比較研究。在此基礎上，通過肉眼觀察、皮膚生理功能測試、皮膚共聚焦顯微鏡（confocallaserscanningmicroscope，CLSM）和組織學形態(tài)觀察等方法，進一步對這兩種激光照射后豚鼠皮膚物理特性、組織形態(tài)和MC、黑素顆粒的變化進行了比較研究。本文的研究為調Q激光有效用于臨床色素沉著性皮膚病的治療提供了實驗和理論依據，為進一步激光治療色素沉著性皮膚病的機理的研究奠定了基礎?，F將結果報告如下：2．對象與方法2.1研究對象2.1.1動物的選擇激光治療色素性疾病主要用于改善人皮膚顏色和美容需要。雖然這種技術已-12-經應用于臨床治療，但是人皮膚標本獲得相當困難，很難進行深入的科學研究。因此，需要建立一種動物模型，用來研究激光祛除色素的發(fā)生和發(fā)展過程。從前人的研究工作來看，我們發(fā)現目前用于皮膚研究的動物主要有豬、豚鼠、大鼠、裸鼠和無毛鼠。雖然豬的皮膚結構與人接近，但豬體形較大，實驗室飼養(yǎng)困難，而且價格昂貴。曾有學者將豚鼠作為光過敏性皮炎或色素研究的動物模型[11]，尤其棕黃色豚鼠，具有中等量的MC，其分布與人特別是黃種人皮膚相似，對UVB照射反應敏感，重復性較佳。此外，豚鼠還具有以下方面的優(yōu)點：首先，體型較小，利于進行大批量的系統研究；其次，易于飼養(yǎng)，價格便宜，大大節(jié)約了實驗成本；最后，實驗操作方便。因此，我們選擇棕黃色豚鼠作為本研究的實驗對象。2.1.2實驗動物及方案所有動物均為健康雄性豚鼠，浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，普通級。選擇背部、側腹部毛發(fā)為棕黃色且面積較大、體重在329～410g之間（約2～3月齡）的豚鼠10只。每只豚鼠側腹部選一處大小約2cm×2cm的棕黃色正常皮膚作為陰性對照組，背部取7個相離區(qū)域（顏色為棕黃色，大小約2cm×2cm），分成7組，經UVB照射后再分成1個陽性對照組和6個實驗組，實驗組分別采用Q-694和Q-1064治療，每種激光使用3種不同的能量密度和不同的治療頻率（治療的總能量相同），每次治療間隔一周，每組治療結束后隨訪2個月，進行療效判斷。2.2儀器與設備308nm單頻準分子光療儀（意大利DEKA公司,）調Q紅寶石激光儀（德國Asclepion公司）(波長：694nm；光斑：4mm，5mm；短脈沖：10ns；能量輸出：500～1000mJ/cm2)調QNd;YAG激光儀（MedLiteC6，美國HOYACONBIO公司）(波長：532nm，1064nm；光斑：3mm，4mm，6mm，8mm；短脈沖：10ns；能量輸出：500～-13-1000mJ/cm2)MPA9皮膚多功能測試儀（德國CourageKhazaka公司）（軟件為CK公司與儀器配套之MPA5軟件，版本：）皮膚共聚焦激光掃描顯微鏡（美國Lucid公司）（VIVASCOPE1500型，波長830nm，最大輸出）。DHG-9076A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備）自動脫水機（美國MICROM公司）全自動石蠟包埋機（美國萊卡公司）石蠟切片機（美國MICROM公司）FEICA烘干機（美國萊卡公司）移液器（德國Eppendorf公司）BX-PMDO光學顯微鏡（日本OLYMPUS公司）數碼相機（日本CANON公司）試劑醫(yī)用超聲耦合劑（上海申風醫(yī)療保健用品）黑素染色試劑盒KGMST-8015（南京凱基生物科技發(fā)展）。脫毛膏（法國美芝澳集團）戊巴比妥鈉（上?；瘜W試劑,進口分裝,含量≥95%）2.3研究方法2.3.1UVB照射豚鼠背部去毛，3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（能量40mg/kg）后，使用308nm單頻準分子光療儀對去毛區(qū)皮膚進行照射，燈管照射功率為50mw/cm2,波長峰值為308nm。燈管距豚鼠背部距離15cm，每次照射總量為600mJ/cm2，每周一次，共3次，總能量1800mJ/cm2。照射3次結束后1周開始使用調Q激光治療。-14-2.3.2激光治療兩種激光與皮膚組織的生物學效應(1)Q-694：可被皮膚組織的血紅蛋白和黑素吸收，但由于氧合血紅蛋白對該波長的激光吸收相對要少，所以激光能量主要作用于黑素。該激光穿透皮膚的深度大約至真皮乳頭層至網狀層上1/3[12]。黑素吸收激光能量后，產生的生物學效應包括將光熱效應、光機械作用和光化學變化等。(2)Q-1064：黑素、水分子和血紅蛋白對其有微弱的吸收，散射系數較小，所以穿透皮膚的深度較大，大約為3.7mm左右[13]。當該激光照射到皮膚組織時，熱來不及擴散，致使在極短的時間內加熱皮膚血紅蛋白和黑素顆粒，引起它們急劇受熱膨脹，產生沖擊波，所以它與皮膚組織相互作用屬于光機械效應。兩種激光參數設定、分組和方法(1)調Q紅寶石激光照射①打開調Q紅寶石激光，待機器預熱完成后，選擇頻率1Hz，能量密度選擇1.5J/cm2、3.0J/cm2和6.0J/cm2三組，按從上到下的順序分別在左邊三個方格進行照射；210%的重疊；③按步驟3依次完成3.0J/cm2和6.0J/cm2的激光照射，左邊最下方的方格對照組不進行激光照射；④激光連續(xù)照射4次（1.5J/cm2）、2次（3.0J/cm2）和1次（J/cm2），每次間隔一周，總能量密度均為2。(2)調QNd:YAG激光照射①打開調QNd：YAG激光，待機器預熱完成后，選擇頻率1Hz，能量密度選擇2.0J/cm2、4.0J/cm2和8.0J/cm2三組，按從上到下的順序分別在右邊三個方格進行照射；-15-②先把能量密度設置為1.5J/cm，帶好防護眼鏡，開始激光照射，光斑有②先把能量密度設置為1.5J/cm，帶好防護眼鏡，開始激光照射，光斑有②先把能量密度設置為2.0J/cm2，帶好防護眼鏡，開始激光照射，光斑有10%的重疊；③按步驟3依次完成4.0J/cm2和8.0J/cm2的激光照射，右邊最下方的方格對照組不進行激光照射；④激光連續(xù)照射4次（2.0J/cm2）、2次（4.0J/cm2）和1次（J/cm2），每次間隔一周，總能量密度均為2。(3)兩種波長激光比較①一共10只，每只豚鼠側腹部選一處大小約2cm×2cm的正常皮膚作為陰性對照組，背部取7個相同大?。s2cm×2cm）的相離區(qū)域，分成7組，經UVB照射后再分成1個陽性對照組和6個實驗組。分別在激光治療前和治療結束后2周、4周、8周拍攝照片，測量黑素指數（melanincontentindex，MCI）、CLSM采集圖像，測量完后取皮膚標本進行HE染色和硫酸亞鐵染色。②左邊三個方格使用調Q紅寶石激光照射，從上到下選擇的能量密度為J/cm2、3.0J/cm2和2，最下方的方格對照組不進行激光照射；右邊三個方格使用調QNd：YAG激光照射，從上到下選擇的能量密度為222③每次照射間隔一周。2.3.3皮膚顏色的測定(1)原理皮膚的黑素和紅斑共同決定了皮膚的顏色，德國CourageKhazaka電子公司MPA9皮膚多功能測試儀可以完成它們的測量。黑素和紅斑的測量是建立在光吸收的原則上，Mexameter

MX18的探針可以發(fā)射568nm、660nm和870nm三種不同波長的光，經皮膚反射后的光線由接收器獲得，并測得反射光的強度。由于發(fā)射光的光強一定，由此可計算出被皮膚吸收的光。兩種波長可以測量紅斑值，568nm是血紅蛋白的吸收峰值，660nm是紅光，對血紅蛋白強烈反-16-J/cm、4.0J/cm和，最下方的方格對照組不進行激光照射；J/cm、4.0J/cm和，最下方的方格對照組不進行激光照射；射。吸收的測量與血紅蛋白濃度的對數有關，黑素可由660nm和870nm兩種波長的光測量，這兩種波長的光對血紅蛋白幾乎不吸收，對黑素有不同的吸收率，它的測量與黑素濃度的對數有關。(2)測量方法

皮膚的黑素和紅斑測量按照儀器使用說明書（軟件版本為）進行操作，本次實驗主要觀察激光治療后豚鼠色素沉著的變化，僅提供MCI變化的相關數據。MCI反映皮膚黑素含量，值越高皮膚黑素含量越多。具體步驟如下：①豚鼠置于室溫20℃和相對濕度35-40%的房間半小時后開始進行測量②打開電腦中的MPA軟件，選擇Mexameter；③提起探針，垂直放在皮膚上，輕輕壓一下，紅斑和黑素值自動顯示在電腦上；同一部位重復測量三次，取其平均值；④分別在激光治療前和治療結束后2周、4周、8周進行黑素和紅斑的測量豚鼠背部固定部位（UVB誘導的色素沉著區(qū)域，激光治療前后的治療區(qū)域，正常皮膚），每次測量在一天的相同時間由同一個人完成；2.3.4共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）觀察(1)原理

CLSM以激光作為點光源,通過物鏡聚焦于組織內,組織內焦點處反射或反向散射回來的光由同一物鏡接收,然后通過探測光路系統的針孔傳輸至探測器而成像,從而構成一薄層組織“光學切片”，焦點以外的反射光則被針孔濾除。它以一個微動馬達控制載物臺的升降，可以逐層獲得高反差、高分辨率、高靈敏度的二維光學橫斷面圖像，從而對獲得或固定的細胞和組織以及較厚的組織切片進行無損傷的系列光學切片。應用于皮膚科的反射光共聚焦顯微鏡的探測器連接在專門的計算機上,并在計算機輔助下成像,故稱作“皮膚CT”。采用皮膚CT對病變部位掃描時無需進行組織活檢及其他處理，對組織不造成傷害。(2)測量方法分別在激光治療前和治療結束后2周、4周、8周，采用CLSM掃描觀察豚鼠背部固定部位（UVB誘導的色素沉著區(qū)域，激光治療前后的治療區(qū)域，正常皮膚）。-17-CLSM檢查步驟：①患者于平臥位或坐位，靜息狀態(tài)下，充分暴露面部;②除去CLSM粘合窗背面的棕色紙，把粘合窗固定在組織環(huán)的孔徑上，除去粘合窗背面的白紙，在成像區(qū)域滴一滴浸液，將組織環(huán)置于成像區(qū)域，在組織環(huán)內擠入耦合劑;③將組織環(huán)通過組織固定器與受檢皮膚相連，根據成像部位，旋轉探頭，得到最佳的成像角度，使患者在成像過程中感覺舒適和放松;④輸入患者信息;⑤定位好粘合窗和組織表面，開始對組織進行成像;⑥成像時，選擇Z軸控制選項，然后調整Z值，直至看到粘合窗的圖像，根據具體情況，調整激光功率;⑦進行VivaBlock(XY序列)掃描a調整Z深度和激光功率直至在屏幕上獲得最佳圖像;b選擇“VivaBlock”按鈕，開始執(zhí)行序列掃描;⑧進行VivaStack(Z序列)掃描a調整Z深度和激光功率直至在屏幕上獲得最佳圖像;b選擇“VivaStack”按鈕，開始執(zhí)行序列掃描;⑨選擇最佳圖像，進行保存;⑩清潔物鏡、組織環(huán)、組織固定器和VivaScope成像模塊組件。2.3.5組織學觀察組織取材激光治療前和治療結束后2周、4周、8周，豚鼠背部固定部位（UVB誘導的色素沉著區(qū)域，激光治療前后的治療區(qū)域，正常皮膚）取材，分別做好記號，放入10%的中性福爾馬林進行固定。標本處理

固定48小時后，進入系列乙醇進行脫水、透明和浸蠟、石蠟包埋和切片、脫蠟和復水、染色。(1)常規(guī)HE染色：-18-①蘇木精染液染色5分鐘，自來水洗3分鐘；②0.5%鹽酸酒精溶液分化數秒，鏡檢著色的程度；③自來水洗2分鐘；④飽和碳酸鋰溶液顯藍30秒；⑤自來水充分水洗20分鐘，蒸餾水洗2次；⑥伊紅染液染色2分鐘；⑦系列乙醇脫水；⑧透明：

80％乙醇95%乙醇無水乙醇I無水乙醇II石碳酸二甲苯（1:3）二甲苯I二甲苯II

30s30s2m2m5m2m2m⑨中性樹膠封片；⑩Olympus顯微鏡觀察攝影。鏡下觀察結果：細胞核深藍色，胞漿及纖維組織呈深淺不等的紅色。(2)硫酸亞鐵染色：①甲醇固定的石蠟切片脫蠟到水，蒸餾水洗1次；②滴加一滴（100ul）鐵硫酸亞鐵1小時；③蒸餾水洗3次，每次5分鐘；④滴加一滴（100ul）鐵氰化鉀液處理30分鐘；⑤滴加一滴（100ul）分化液稍洗；⑥用酸性品紅葉和飽和苦味酸也（1:9）混合（在現配、試管中進行）后滴加一滴（100ul）于切片上染1～2分鐘；-19-⑦自來水速洗；⑧95%酒精、無水酒精脫水；⑨透明，封固；⑩Olympus顯微鏡觀察攝影。鏡下觀察結果：黑素顆粒被染成綠色或墨綠色。2.3.6療效觀察主要儀器數碼相機CANONEOS-400D2.4數據處理及統計學分析所有數據采用SPSS13.0軟件進行統計分析。對實驗結果行多個樣本均數的方差分析和t檢驗，以P<0.05為有統計學意義。3．結果3.1皮膚反應豚鼠首次照射UVB（總量1800mJ/cm2，每周一次，每次600mJ/cm2）當日即見皮膚發(fā)紅，次日紅斑明顯，3～5天皮膚脫屑，5～7天色素沉著，3周后色素沉著達頂峰且色素均勻穩(wěn)定。激光治療時色素沉著區(qū)可見光斑大小的白色痂膜，有輕中度水腫，高能量組可見表皮飛濺，Q-1064甚至可見皮下出血點或紫癜，3天后有稀疏的毛發(fā)生長，皮膚顏色加深，4天后見脫痂，7～10天痂皮脫落，10天后可見新生的白色毛發(fā)，4周后毛發(fā)變黑。同一激光不同能量間比較（Q-694/Q-1064）：激光治療2周皮膚色素沉著均完全消退，各組間無明顯差異，顏色比正常皮膚略淺；4周時低能量組皮膚顏色和正常皮膚大致相同，中高能量組色素沉著出現輕度恢復，并隨時間增加逐漸增多，8周時僅Q-694低能量下未見色素復發(fā)，其余各組均見不同程度復發(fā)，高能量組色素恢復甚至達90%以上，與UVB照射后水平相當。陽性對照組皮膚顏色隨時間增加無明顯改變（見圖1）。-20-兩種激光之間比較（Q-694和Q-1064）：兩種調Q激光差別在低能量組，Q-694治療后色素沉著完全消退，且維持8周未見復發(fā)；而Q-1064各能量組治療后色素沉著隨時間增加均逐漸增多，雖然低能量組色素恢復稍遲于中高能量組，但8周后亦可見散在色素沉著恢復區(qū)（見圖1）。圖1豚鼠皮膚各期的照片-21-Fig1

Photographsofthedorsalskinofguinea-pigA：UVB照射3次后；B：激光治療2周；C：激光治療4周；D：激光治療8周（分區(qū)：左側為Q-694激光治療區(qū)，右側為Q-1064激光治療區(qū)，從上到下能量依次增加，最下方區(qū)域為陽性對照區(qū)）注：圖中豚鼠背部標出的2塊區(qū)域的皮膚作其他課題研究所用，在本研究中不作統計。3.2皮膚生理測試3.2.1同一激光不同能量間比較（Q-694/Q-1064）⑴Q-694：隨著能量的增加，激光治療結束后2周MCI值有遞減趨勢，均低于對照組（P）；而4周和8周有遞增趨勢，亦均低于對照組；3個能量組組間，低能量組MCI值明顯下降，與其它組比較，差異有統計學意義（，P）；結果見表1、圖2。表1

Q-694激光治療前和治療后2周、4周、8周皮膚MCI變化表（+S）Tab1

MCIbeforeandafter2weeks,4weeks,8weeksofQ-694treatment能量（J/cm2）0(對照)1.5*43.0*26.0*1F值

治療前

2周15.31*

4周48.83*

8周24.40*注：F值為陽性對照組與不同能量組方差分析，*P-22-圖2Q-694激光治療前后黑素指數變化Fig2MCIbeforeandafterQ-694treatment⑵Q-1064：結論同Q-694，低能量組治療結束后的MCI值低于其他能量組的MCI值，差異有統計學意義（，P）。結果見表2和圖3。表2

Q-1064激光治療前和治療后2周、4周、8周皮膚MCI變化表（+S）Tab2

MCIbeforeandafter2weeks,4weeks,8weeksofQ-1064treatment能量（J/cm2）0(對照)2.0*44.0*28.0*1F值

治療前

2周65.45*

4周23694.56*

8周65.68*注：F值為陽性對照組與不同能量組方差分析，*P-23-圖3

Q-1064激光治療前后黑素指數變化Fig3MCIbeforeandafterQ-1064treatment3.2.2兩種激光之間比較（Q-694和Q-1064）采用t檢驗，，P，說明2種激光療效不同。Q-694治療后的MCI均數為，標準差為；Q1064治療后的MCI均數為125.20，標準差為；即Q-694治療后的黑素量<Q-1064治療后的黑素量，說明Q-694療效比Q-1064好。兩種激光治療前后相比，差異亦有統計學意義(P<0.05)。-24-表3

兩種激光治療前后MCI的比較（±s）Tab3

ThecompareofMCIbeforeandafterQ-694andQ-1064treatment激光治療前

激光治療后Q-694Q-1064

63.82+45.45*125.20+58.99*注：兩種激光治療前后差值的比較，*P

激光治療結束后2周、4周、8周療效的比較采用方差分析，，P，說明激光治療結束后2周、4周和8周療效有差別。兩兩比較：2周、4周、8周MCI均數分別為、、，較治療前MCI均數有顯著性差異（P）；2周、4周MCI值無顯著性差異，但與8周比較，差異均有統計學意義（P）。具體見表4。表4激光治療前后黑素指數值變化（±s）Tab4

MCIbeforeandafterQ-switchedlasertreatment部位

治療前

2周

4周

8周治療區(qū)

*

*&

*&

*&未治療區(qū)

*

*

334.80+31.88

*

*正常皮膚區(qū)

注：*表示同正常皮膚相比，皮損處黑素指數顯著增加，P&表示同色素沉著區(qū)治療前相比，治療后黑素指數顯著減少，P3.3CLSM觀察在CLSM下，MC及其樹突可表現為高折光的線狀樹突影，角質形成細胞（keratinocytes，KC）中色素顆?？杀憩F為散在分布于棘層、基底層的點狀高亮折光影。-25-UVB照射前：正常皮膚基底層致密，MC樹突影可見，色素顆粒較少；UVB照射后：可見表皮明顯增厚，棘層可見大量高折光色素顆粒，顆粒直徑較前明顯增大，顆粒深部出現大量MC，樹突數量和密度較前顯著增加；激光治療結束后2周：各組無明顯差別，毛囊周圍及棘層色素沉積較UVB照后均顯著減少，可見少許黑素顆粒和MC；激光治療結束后4周：中高能量組色素沉積和色素顆粒較2周前稍增加，較低能量組也更明顯；激光治療結束后8周：除Q-694低能量組，各組色素沉積量、黑素顆粒和MC的數目、密度隨能量的增大逐漸增多。陽性對照組隨時間增加棘層色素顆粒逐漸減少，基底層MC樹突稍減少，但仍明顯多于正常皮膚，表皮結構、厚度未見明顯變化。結果見圖4。C

CE

-26-

DDF圖4

CLSM的表現Fig4CLSMvisualizationofthedevelopmentofpigmentinUVB-exposedguinea-pigskinA：正常皮膚表現；B：UVB照后表現；C、D、E、F為激光治療結束后8周的表現（C、D為Q-694治療后，E、F為Q-1064治療后）：C：Q-694（低能量組）：毛囊周圍棘細胞、顆粒細胞內未見色素沉積，偶可見細胞間明亮色素顆粒形成，未見MC影；顆粒層有少許色素沉-27-積，色素顆粒少，未見MC樹突影；D：Q-694（高能量組）：毛囊周圍見大量MC，生長活躍，樹突豐富，可見少量色素沉積，毛囊周圍的正常皮膚棘層見大量明顯色素顆粒，折光強，可見樹突豐富的MC浸潤。E：Q-1064（低能量組）：棘層及基底層見中等量色素沉積和色素顆粒，毛囊周圍見少量色素沉積和MC樹突影；F：Q-1064（高能量組）：毛囊周圍及棘層色素沉積明顯增多，色素顆粒折光強，MC數量多，且生長活躍、樹突豐富。3.4組織病理學觀察UVB照射后黑素顆粒明顯增加；激光治療結束后2周，鏡下見低、中、高能量組無明顯差別，黑素顆粒少甚至沒有，膠原增生在低能量更明顯；激光治療結束后4周、8周，低、中、高能量組豚鼠表皮及毛囊中黑素顆粒數量依次遞增，膠原增生也在低能量更明顯。對照組隨時間增加基底層黑素顆粒逐漸減少，但仍明顯多于正常皮膚（見圖5）。圖5

硫酸亞鐵染色的結果（×100）Fig5

Histologicalanalysisofskinfromguinea-pigA：正常皮膚表現；B：UVB照后表現；C、D、E、F為激光治療結束后8周的表現（C、D為-28-Q-694治療后，E、F為Q-1064治療后）：C：Q-694（低能量組）：表皮基底層黑素顆粒較UVB照后明顯減少，僅少量散在分布，膠原均一化明顯；D：Q-694（高能量組）：表皮基底層見大量黑素顆粒；E：Q-1064（低能量組）：表皮基底層見少量至中等量的黑素顆粒；F：Q-1064（高能量組）：表皮基底層見大量黑素顆粒。4.討論色素沉著性皮膚病，包括PIH、日曬斑和黃褐斑等，是皮膚科常見的一類損容性疾病，在亞洲人群中發(fā)病率高，因此治療也受到廣泛關注，尤其當暴露部位如面部患病時，還可以引起心理的巨大傷害。臨床許多皮膚科治療方法如液氮冷凍、CO2激光等也有引起PIH的高風險，治療過程中也容易引發(fā)醫(yī)療糾紛，特別是在我國醫(yī)療事故處理條例中，把治療過程中導致的PIH定為四級醫(yī)療事故，引起臨床醫(yī)生的日益關注。由于目前對皮膚色素沉著的發(fā)生機理尚未完全清楚，預防和治療均感棘手。同時，臨床也一直缺乏起效較快、有效率高、副作用小、復發(fā)率低的治療方法。根據發(fā)病原因，人類色素沉著性疾病可以分為：色素痣與皮膚腫瘤、先天性疾病、物理化學性疾病、皮膚炎癥性疾病、內分泌紊亂及其他內部疾患、異物性色素性沉著和淺部真菌病引起的色素沉著。由于發(fā)病原因不同，其臨床表現與治療也不一樣。色素沉著性疾病在病理上均表現有表皮和或真皮黑素顆粒數量的增加，但其合成黑素顆粒的MC，其結構、功能和數量，在這些疾病間卻不盡相同。色素沉著性疾病的發(fā)病機制至今仍未完全清楚，在黑素合成、轉移及其代謝過程過程中任何環(huán)節(jié)的改變都能夠導致其發(fā)生。黑素合成是一個多步驟的酶促生化反應，并受到復雜而精細的調控，在這一過程中，酪氨酸酶相關蛋白1是將酪氨酸運輸給黑素小體的關鍵酶，其合成速率與黑素合成呈正相關-29-

[14]

。而多巴色素互變異構酶在黑素聚合的過程中扮演了非常重要的角色[15]。此外，黑素皮質素受體-1、紫外線輻射、皮膚中角質形成細胞和成纖維細胞分泌的一些細胞因子、膜相關轉運蛋白都能影響黑素的合成[16-18]。黑素小體在細胞內傳遞的分子動力主要來源于絲狀肌動蛋白（F-actin）和（或）肌球蛋白(myosin)。Taruho等[19]發(fā)現，一種ashen鼠基因編碼的產物（Rab27a）結合蛋白（Slp2-a）不僅可以調控黑素小體在黑素細胞外周的分布，還可以影響黑素細胞的形態(tài)。Fukuda等[20]研究發(fā)現Melanophilin，一種leaden鼠的突變基因產物也具有調節(jié)黑素小體向樹突遠端運動的作用，它和Rab27a都可以與myosin-Ⅴa結合。Seiberg等[21]通過實驗證實，角質形成細胞在黑素轉運過程中，蛋白酶活性受體-2（PAR-2）在胞外活化后，能增強培養(yǎng)的角質形成細胞對孤立的黑素小體的吞噬作用，介導黑素小體的傳遞。Lee等[22]發(fā)現在磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)信號轉導通路中，PI3K抑制劑LY294002在色素沉著發(fā)生過程中也起一定的作用。色素沉著性皮膚病的傳統治療一直都是藥物治療，其主要目的是抑制黑素細胞活性及增生、抑制黑素顆粒形成及加速降解。外治藥物主要包括化學剝脫劑、單用或聯合皮膚脫色劑、類視黃醇類和皮質激素類、維生素C及其衍生物和一些天然植物提取物等。這些藥物療法往往起效較慢，且療效欠佳，不良反應較多，例如皮膚刺激、過敏等，甚至有引起新的色素沉著的風險。隨著“選擇性光熱作用理論”的提出，現代激光技術降低了對周圍皮膚的熱損傷作用，提高了治療安全性，痛苦少且不留疤痕，國內外有成功治療雀斑、黃褐斑、PIH的臨床病例報道。但是在亞洲人種中，激光在常規(guī)能量或較高能量參數下又非常容易引發(fā)新的色素沉著（俗稱“激光光斑反應”）[23]，因此，此類激光對皮膚色素沉著的治療利弊爭議一直不斷。近年來，有部分國外學者試用低能量調Q激光治療皮膚色素沉著取得了一定的效果：Cho等[24]用低能量的調QNd：YAG激光（能量在～2）治療3例PIH患者，臨床癥狀均得到明顯改善，隨訪2個月沒有復發(fā)；Ee等[25]認為盡管表皮色素或黑素顆粒對波長532nm的調Q激光（Q-532）更敏感，但Q-532治療后引起皮膚異色癥的風險比Q-1064大，所以建議用低能量Q-1064治療PIH。結合我們近期臨床使用低能量Flat--30-Top技術的調QNd:YAG（1064nm）治療黃褐斑的經驗，引起了我們對調Q激光治療皮膚色素沉著的療效與激光能量之間量效關系的興趣。但是，目前國際上只有調Q激光治療實驗動物正常皮膚的觀察研究，對皮膚色素沉著的激光治療缺乏相關的動物實驗支持和理論探討。且在臨床應用中醫(yī)生一般依據自己的主觀經驗來選擇激光參數，并根據主觀判斷來確定療效，缺乏客觀的評估方法和進行科學治療的理論依據。因此，本文利用棕黃色豚鼠作為動物模型，選擇調Q紅寶石激光（694nm）和調QNd:YAG（1064nm）兩種治療色素沉著性皮膚病有代表性的激光分別進行實驗研究，采用多種方法比較不同能量密度的激光照射對皮膚組織形態(tài)、MC、黑素顆粒的影響差異，以期從客觀上揭示這兩種激光吸收規(guī)律與生物作用機制，以及激光能量密度和治療效果之間的關系，為下一步進行兩種波長的調Q激光的比較研究提供了條件。UVB照射棕黃色的豚鼠皮膚作為皮膚色素沉著實驗動物模型已被國內外成功應用[26]。棕黃色豚鼠，具有中等量的MC，其分布與人特別是黃種人皮膚相似，對UVB照射反應敏感，重復性較佳。該模型在國內外常用于研究UVB照射后色素沉著以及不同化學制劑和藥物對皮膚色素沉著的作用。根據文獻資料[27]，豚鼠皮膚的UVB最小紅斑量為200～300mJ/cm2，有研究采用局部雙倍最小紅斑量的紫外2皰的發(fā)生，又可形成穩(wěn)定均勻的色素沉著,便于實驗中觀察和數據記錄。雖然這種模型未并不能完全模擬色素沉著性皮膚病，但是由于色素沉著性皮膚病種類繁多，且病因復雜，目前國內外對該類疾病尚無公認的造模方法，且在本研究中我們發(fā)現UVB照射后，豚鼠皮膚可見表皮明顯增厚，棘層可見大量高折光色素顆粒，顆粒直徑較前明顯增大，顆粒深部出現大量MC，樹突數量和密度較前顯著增加。CLSM表現同表皮色素沉著性疾病無明顯差異，此與Gambichler[28]等用紫外線照射皮膚觀察到表皮黑素含量比照射前顯著增高的結果一致。因此我們認為該模型可以做為表皮色素沉著性疾病的動物模型。根據Parrish和Anderson在1983年提出的“選擇性光熱分解作用理論”[29]

，色素團塊在受到特定波長的激光照射后，能夠選擇性地吸收激光能量，在瞬-31-線能量（500～600mJ/cm）分次間歇照射棕黃色豚鼠皮膚的方法,既減少紅斑水線能量（500～600mJ/cm）分次間歇照射棕黃色豚鼠皮膚的方法,既減少紅斑水間產生爆破效應，變成色素粉塵，或者隨皮屑排除體外，或者隨淋巴循環(huán)/血液循環(huán)被逐漸運走，從而達到祛除色斑的療效。調Q意義為獲得的激光脈寬極短，短至幾個納秒～幾百個納秒（ns,1ns=10-9s），而峰值功率極高，可達10～100MW，可使色素顆粒驟然受熱而發(fā)生瞬間爆破。由于其脈寬小于黑素顆粒的熱馳豫時間，因此治療中不會損傷周圍正常組織。與剝脫性激光相比，調Q激光不僅能去色素，亦可減少瘢痕產生。目前調Q激光主要有調Q紅寶石激光和調QNd:YAG激光等。調Q紅寶石激光的波長為694nm，可以穿透到真皮乳頭層至網狀層上1/3，常用于表皮色素沉著性疾??；而調QNd:YAG激光波長較長，為1064nm，雖然它的穿透深度更深，但是文獻報道其有效光學穿透深度達[30]，臨床上常用于治療真皮色素沉著性疾病，由于對表皮的色素吸收較少，治療反應和副作用較輕，尤其在亞洲深膚色人種，低能量下（～3.0J/cm2）對淺在的色素沉著性皮膚病如黃褐斑、PIH亦有一定的療效[8-9]。Murphy[10]認為中國人膚色較深，治療的能量應與高加索白人不同，但具體量效關系尚無相關研究報道。因此我們采用兩種調Q激光（Q-694和Q-1064）不同能量梯度相對比，來研究不同能量密度下調Q紅寶石激光和調QNd:YAG激光對內源性黑素增加的作用，以及對功能活躍的MC結構和功能的影響。我們在評估療效中采取了皮膚多功能測試儀、CLSM、組織切片染色等多種評價方法。其中皮膚黑素的測量是MEXAMETERMX18探頭，屬于窄譜反射分光光度計，根據黑素吸收光譜的不同而測定。儀器探頭的發(fā)射器發(fā)出波長分別為568nm、660nm、870nm三種波長的光照射在皮膚表面，接受器測得皮膚反射的光，通過測定反射量來確定皮膚中黑素的含量，得到了MCI。測定數值越高，說明皮膚中黑素含量越高。MCI是個客觀的指標，但是CLSM臨床應用存在一定的問題，其掃描深度400μm，由于表皮角質層、真皮乳頭層的散射，難以達到真皮網狀層和皮下組織；圖像質量尚不能與組織切片相比較；且CLSM的主觀性較強，需要醫(yī)生具有一定經驗。因此，我們還采用了HE染色和硫酸亞鐵染色，分別觀察細胞大致形態(tài)和黑素顆粒的變化，以更全面的評價實驗結果。-32-我們發(fā)現，不論哪種調Q激光，在總能量相同的前提下，低能量多次照射治療短期內療效肯定，無論是肉眼觀察還是皮膚客觀的MCI值、CLSM、組織病理學觀察，與高能量激光治療組療效間無明顯差別。近來國內外有大量研究表明，大光斑、低能量密度多次治療與高能量、小光斑少次治療療效一致，但減少了不良反應的發(fā)生[31-33]，本研究結果與之相符。臨床上對于亞洲黃種人或深色人種，過高的能量參數會出現長時間的炎癥后紅斑，可能引發(fā)PIH或者色素脫失斑，甚至引起瘢痕形成。Watanabe[31]認為激光在高能量下可能誘發(fā)了更嚴重的損傷，這種表皮炎癥反應可導致花生四烯酸的釋放和氧化后形成前列腺素和白三烯，這些炎癥介質通過刺激表皮層的MC改變了MC和一些免疫細胞的活性[32]，甚至可以導致黑素合成增加，形成炎癥后色素沉著，即臨床上所謂的“激光光斑反應”；而大光斑、低能量、多次反復的方法可只針對黑素顆粒進行選擇性光爆破，從而盡量避免或減少對MC的激活，使MC功能失活或抑制，這種理論即稱為“亞細胞選擇性光熱解作用”，Mun等[8]通過一種立體表面成像新技術觀察MC的三維結構也證實了這一點，激光治療后僅黑素顆粒被破壞，MC樹突減少，但是MC結構完整；同時黑素顆粒的多次光爆破，可以使黑素顆粒更微小化，更有利于被吞噬排出[8，33]，這種“亞細胞選擇性光熱解作用”也可以最大程度減少激光對正常皮膚組織和基底膜的損害，避免PIH的發(fā)生，這種新的治療方法近年來在國內外已逐漸被應用于臨床，且取得了較滿意的療效。調Q激光引起的副反應多與其對黑素的高選擇性吸收有關

[34]

，除了黑素，血紅蛋白和水分子也是激光作用的靶，因此激光還會導致一些非特異性損傷，且損傷程度和照射能量相關。能量越高對表皮黑素的破壞越為徹底，造成的表皮損傷越嚴重。實驗中我們發(fā)現豚鼠皮膚在激光治療過程中都有輕至中度發(fā)紅、脫屑，高能量下甚至見到表皮飛濺、出血點、紫癜，但均未見瘢痕。此外無論照射能量高低，調Q激光均引起豚鼠毛發(fā)變白，但這種副反應多為暫時性，激光治療結束后4～8周毛發(fā)顏色均可恢復正常；而皮膚色素沉著在激光治療結束后4～8周僅Q-694低能量組無復發(fā)，在其他能量較高、治療次數較少的實驗組隨時間增加均有不同程度的復發(fā)，8周時兩種調Q激光的高能量組色素沉著全部復發(fā)，復發(fā)水-33-平同UVB照射后的色素沉著水平相當，且激光治療后所有患者及所有豚鼠，CLSM均可見樹突狀細胞，且樹突較長。研究表明雖然MC、KC和真皮一些噬黑素細胞中和毛囊中的黑素顆粒是調Q激光作用的靶[35]，但實驗中皮膚和毛囊中色素消退后又恢復，說明了激光對MC的損傷并不是持續(xù)性的，其活性會在某一時間點恢復正常甚至反跳性增強，王玲等[36]通過體外實驗也證實了這一點。由此可以解釋臨床上黃褐斑、雀斑和咖啡斑等疾病為什么會在激光治療后復發(fā)[35，37]。Lu等[38]認為恢復的MC可能來自于周圍正常MC或毛囊中的MC儲庫，實驗中CLSM發(fā)現在激光治療結束后8周Q-694高能量組毛囊周圍見大量生長活躍、樹突豐富的MC，而毛囊周圍的正常皮膚棘層見大量明顯色素顆粒和樹突豐富的MC浸潤（見圖4-D），該結果也證實了Lu等人的觀點。然而皮膚顏色為何恢復到UVB照射后色素沉著的水平，而不是正常皮膚顏色的水平，具體機制目前尚不清楚，Wattanakrai等[35]認為激光引起的黑素代謝的紊亂可能是復發(fā)和色素反跳性加深的主要原因，我們推測可能是高能量調Q激光對MC活性的激惹性增強或屬于激光引起的PIH，但是具體機制有待于進一步研究。盡管近年來低能量密度的調QNd:YAG激光多次照射治療黃褐斑、PIH等倍受推崇，但是從本研究中我們發(fā)現，早期治療雖然獲得了一定療效，避免了高能量下大的副作用；但是，從長期療效來看，這種低能量多次照射的治療方法仍無法避免復發(fā)問題，而且雖然單次照射的能量密度較小，但是多次照射能量的累積可能超過了激光標準的安全能量，長期的安全性尚不清楚

[35]

。Chan等[39]通過動物實驗已經證實重復高能量激光照射可以使P16基因和增殖細胞核抗原（PCNA）表達升高，這都提示DNA受到損傷。因此，我們認為，盲目的增加治療次數或治療頻率可能是不可取的，單一的激光治療可能也是不夠的，聯合局部外用藥治療或其他方法可能是未來的趨勢，值得期待和探討。本課題也存在不足之處。由于我們實驗在激光治療結束后只觀察了8周，雖然Q-694低能量治療組色素沒有復發(fā)，但是否在更長的時間里會恢復尚需要繼續(xù)再觀察。此外，由于是動物實驗，豚鼠皮膚并不能完全模擬人類的皮膚，且色素沉著性皮膚病種類繁多，發(fā)病機制各不一樣，影響因素也較復雜，本研究尚需在-34-臨床進一步研究?？傊?，低能量密度多次調Q激光治療是治療色素沉著性皮膚病較為有效的手段之一，利用皮膚生理功能測試儀、CLSM、組織病理等方法也證實了該方法的有效性及安全性，同時本研究還為臨床進一步開發(fā)和應用新的低能量調Q激光治療色素沉著性皮膚病提供了實驗依據和參考。5．結論

驗證了調Q治療表皮色素沉著療效確切。獲得了皮膚色素沉著的動物模型，該模型可模擬表皮色素沉著。CLSM易于對皮膚黑素顆粒和黑素細胞變化觀測，可以動態(tài)觀察色素沉著皮損的預后，監(jiān)測治療效果。調Q激光對豚鼠皮膚色素沉著的組織效應程度與能量、治療頻率之間存在一定的關系，低能量多次治療短期療效肯定，且副作用較小。兩種激光治療表皮色素沉著的療效相比，Q-694療效優(yōu)于Q-1064；調Q激光治療豚鼠皮膚色素沉著有復發(fā)的高風險。-35-6．參考文獻1.HalderRM,NoothetiPK.Ethnicskindisordersoverview.JAmAcadDermatol,2003,48(6Suppl):S143-148.2.StratigosAJ,katsambasAD.Optimalmanagementofrecalcitrantdisordersofhyperpigmentationindark-skinnedpatients.AmJClinDermatol,2004,5(3):161-168.3.GuptaAK,GoverMD,NouriK,etal.Thetreatmentofmelasma:areviewofclinicaltrials.JAmAcadDermatol,2006,55(6):1048-1065.4.LaczNL,VafaieJ,KihiczakNI,etal.Postinflammatoryhyperpigmentation:acommonbuttroublingcondition.IntJDermatol,2004,43(5):362–365.5.PandyaA,BerneburgM,OrtonneJP,etal.Guidelinesforclinicaltrialsinmelasma.PigmentationDisordersAcademy,2007,156(1):21-28.6.GrimesPE.ManagementofhyperpigmentationinDarkerRacialEthnicGroups.SeminCutanMedSurg,2009,28(2):77-85.7.GruberMJ,WackernagelA,RichtigE,etal.Digitalimageenhancementforinvivolaserscanningmicroscopy.SkinResTechnol,2005,11(4):248-253.8.MunJY,JeongSY,KimJH,etal.AlowfluenceQ-switchedNd:YAGlasermodifiesthe3Dstructureofmelanocyteandultrastructureofmelanosomebysubcellular-selectivephotothermolysis.JElectronMicrosc,2011,60(1):11-18.9.ChanNP,HoSG,ShekSY,etal.AcaseseriesoffacialdepigmentationassociatedwithlowfluenceQ-switched1,064nmNd:YAGlaserforskinrejuvenationandmelasm