(二)目的基因與載體的連接課件

基因重組和基因工程

GeneticRecombinationandGeneticEngineering張景萍生物化學(xué)教研室基因重組和基因工程張景萍一、教學(xué)目的：在掌握重組DNA技術(shù)的基本過程的基礎(chǔ)上，學(xué)習(xí)工具酶、載體等內(nèi)容。二、教學(xué)要求：1．掌握重組DNA技術(shù)的基本過程；2．掌握工具酶和載體的概念；3．熟悉常用的克隆載體；4．熟悉目的基因的制備。

目的要求一、教學(xué)目的：在掌握重組DNA技術(shù)的基本過程的基礎(chǔ)上，學(xué)習(xí)工教學(xué)內(nèi)容1．工具酶①限制性核酸內(nèi)切酶；②修飾酶（DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、T4DNA聚合酶、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶。）2．載體①常用的克隆載體（質(zhì)粒、噬菌體、病毒）；②表達(dá)載體3．重組DNA技術(shù)的基本過程①目的基因的制備②載體的選擇和制備③DNA的體外連接④將外源DNA導(dǎo)入宿生細(xì)胞⑤目的基因的篩選和鑒定4．克隆基因的表達(dá)①克隆基因在大腸桿菌中的表達(dá)②克隆基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)教學(xué)內(nèi)容1．工具酶

基因工程分子雜交聚合酶鏈反應(yīng)

DNA序列測定轉(zhuǎn)基因動(dòng)物克隆動(dòng)物基因剔除技術(shù)基因診斷和基因治療基因有關(guān)的操作技術(shù)基因工程基因有關(guān)的操作技術(shù)

第一節(jié)基因工程第一節(jié)重組DNA技術(shù)的發(fā)展史年G.J.Mendel的豌豆雜交試驗(yàn)1944年O.T.Avery的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)1973年美國斯坦福大學(xué)的科學(xué)家構(gòu)建第一個(gè)重組DNA分子1977年美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的藥物。1980年開始建造第一家應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠1997年英國羅林研究所成功的克隆了多莉重組DNA技術(shù)的發(fā)展史年G.J.Mendel的豌豆雜交試

（一）重組DNA技術(shù)（recombinantDNAtechnology）

是在體外按人們的意愿將不同的DNA

分子重組的技術(shù)。一、基因工程相關(guān)概念（一）重組DNA技術(shù)一、基因工程相關(guān)概念

是指利用重組DNA技術(shù)將目的基因和載體重組，再導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的過程。（二）基因工程(geneticengineering)是指利用重組DNA技術(shù)將目的基因（二）基因工程(ge

是指通過無性繁殖過程所產(chǎn)生的與親代完全相同的子代群體?；蚬こ滔喈?dāng)于目的基因的無性繁殖過程，也稱其為基因克隆(genecloning)。

（三）克?。╟lone）是指通過無性繁殖過程所產(chǎn)生的（三）克隆（clone）二、基因工程操作中常用的工具二、基因工程操作中常用的工具

在這個(gè)過程中：

1.“基因剪刀”

剪取DNA的酶就像一把“基因剪刀”

2.“縫紉針”

連接不同來源DNA分子的酶就像一根“縫紉針”，使二者連在一起

3.“交通工具”使用載體好比一輛車子

4.“乘客”

有用基因如IL2好比使乘客，車子把乘客送進(jìn)理想天堂（宿主細(xì)胞）去繁衍生息，春華秋實(shí)，生產(chǎn)我們需要的產(chǎn)品或開展基因治療（IL2/LAK→抗癌）。在這個(gè)過程中：常用的工具酶（toolenzymes）有：

1.限制性核酸內(nèi)切酶（resrictionenzymes,restrictionendonadease)2.DNA連接酶（DNAligase,ligase)3.逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)4.DNA聚合酶(DNApolymerase,DNApol)5.核酸酶(nuclease)6.末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)7.堿性磷酸酶(BAP或CIP)以1.和2.最為常用，最為重要。工具酶現(xiàn)已商品化。（一）工具酶常用的工具酶（toolenzymes）有：（一）工具酶

1．限制性內(nèi)切酶(restrictionendonuclease)

定義:是一類能識別和切割雙鏈DNA分子中特定堿基序列的核酸水解酶分類:Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ所謂限制（restriction）=切割（clearage）=水解（hydrolysis）該部位的核苷鍵（磷酸二酯鍵）1．限制性內(nèi)切酶(restrictionendonucl作用：與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護(hù)自身DNA。

命名：第一個(gè)字母代表細(xì)菌的屬名，用大寫；第二、三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。作用：與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，命名：第一個(gè)字

Ⅱ型限制酶識別序列特點(diǎn)—回文結(jié)構(gòu)······GAATTC············CTTAAG······切口：黏性切口和平端切口Ⅱ型限制酶識別序列特點(diǎn)—回文結(jié)構(gòu)······GAATTC

EcoRⅠHpaⅡ

—GAATTC—

—GTTAAC—

—CTTAAG—

—CAATTG—

—G

—CTTAA

黏端切口平端切口

+AATTC—G——GTT—CAA+AAC—TTG—EcoRⅠBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口BamHⅠGTCGGATCC+GGATCCHindⅡGTC三種切割方式

EcoRI5`----NGAATTCN----3`

5`----NGAATTGN----3`3`----NCTTAAGN----5`3`----NCTTAACN----5`5`粘性末端在對稱軸5`側(cè)切割產(chǎn)生5`粘端三種切割方式3`----NCTTAAGN-在對稱軸的3`側(cè)切割產(chǎn)生3`粘端，PstI5`----NCTGCAGN----3`3`----NGACGTCN----5`CTGCAGGACGTC5`----NCTGCA3`----NGCTGCAGGN----3`ACGTCN----5`GACGTC3`-粘性末端在對稱軸的3`側(cè)切割產(chǎn)生3`粘端，PstI5`----N同功異源酶來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點(diǎn)，這些酶稱同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同功異源酶GGATCCGGATCC+BamHⅠGGATCC同尾酶有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個(gè)相同的粘性末端稱為配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA同尾酶BamHⅠBglⅡGGATCCAGATCTGDNA連接酶是基因工程第二位重要的工具酶，常用T4DNAligase.

（一）功能：催化有互補(bǔ)順序的兩個(gè)dsDNA分子的粘性末端或平頭末端3′－OH和5′－P連接作用。（二）來源－噬菌體T4感染Ecoli分離的一種單鏈多肽酶、MW6.0KD。

2．DNA連接酶DNA連接酶是基因工程第二位重要的工具酶，常用T4DNAlOH5`5`3`3`P連接酶5`5`3`3`OH5`5`3`3`P連接酶5`5`3`3`（一）概述

逆轉(zhuǎn)錄酶也稱反轉(zhuǎn)錄酶或RNA依賴的DNA聚合酶（RNAdependentDNApolymerase,RDDP）。是由Baltimove從鼠白血病病毒（murineleukemiavirus,MLV）和Mizutan從勞氏肉瘤病毒(Roussarcomavirus,RSV)中，于1970年分別各自發(fā)現(xiàn)的，這兩個(gè)小組論文同時(shí)在同一期Nature上，可見其意義。該酶在逆轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus）生產(chǎn)循環(huán)中起主宰作用。（二）功能基因工程中主要用于逆轉(zhuǎn)錄mRNA→cDNA（complementoryDNA）。（三）商品化逆轉(zhuǎn)錄酶有兩種

①AMV（禽成髓細(xì)胞瘤）②Mc-MLV(鼠白血病病毒)。3、逆轉(zhuǎn)錄酶（一）概述逆轉(zhuǎn)錄酶也稱反轉(zhuǎn)錄酶或RNA依賴的DNA聚合酶逆轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象RNA模板逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RNA雜化雙鏈RNA酶單鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶雙鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象RNA模板逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RN逆轉(zhuǎn)錄酶

AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT分子生物學(xué)研究可應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶，作為獲取基因工程目的基因的重要方法之一，此法稱為cDNA法。

以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成的與mRNA堿基序列互補(bǔ)的DNA鏈。試管內(nèi)合成cDNAcDNAcomplementaryDNA逆轉(zhuǎn)錄酶AAAATTTTAAAASI核酸酶D4.DNA聚合酶I主要有：大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段Taq酶T4噬菌體DNA聚合酶結(jié)束放映返回目錄4.DNA聚合酶I主要有：結(jié)束放映返回目錄

1956年，A.kornberg首先從E.coli中分離得到。是由1條多肽鏈組成的球蛋白，MW109KD，

（1）5′→3′DNA聚合酶活性以ssDNA為模板，沿引物3′－OH方向，按模板順序從5′→3′延伸。

（2）3′→5′外切酶活性即從游離的3′－OH末端降解ssDNA或dsDNA，其意義在于識別和消除不配對的核酸，保證DNA復(fù)制的忠實(shí)性。

（3）5′→3′外切酶活性從游離的5’端降解dsDNA成單核苷酸或寡核苷酸，也降解DNA:RNA雜交體RNA成分（具有RnaseH活性）大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ（E.coliDNApolⅠ）1956年，A.kornberg首先從E.c

基因工程很多情況下，E.coliDNApolⅠ可用它的1個(gè)大片段Klenow片段酶代替。該酶是枯草桿菌蛋白酶或胰蛋白酶降解E.coliDNApolⅠ所得到的。

1.Klenow大片段是一條多肽鏈，MW76KD，保留了E.colipolⅠ的5′→3′DNA聚合酶，3′→5′外切酶活性。

2.Klenow在基因工程用于：

(1)補(bǔ)平用限制酶消化dsDNA得到的5’粘性末端（即3’延伸末端）

(2)同（1），填平過程中，用32pdNTP標(biāo)記DNA片段3’末端。

(3)cDNA克隆了中，用于合成cDNA的第二條鏈。

(4)在Sanger雙脫氧法ddNTP系統(tǒng)進(jìn)行序列分析。

大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的大片段－Klenow片段酶基因工程很多情況下，E.coliDNA

該酶是一種耐熱的依賴于DNA的DNA聚合酶，具有5’－3’聚合活性以及依賴5’－3’聚合酶作用的外切酶活性，聚合酶的最適反應(yīng)溫度是75℃－80℃,37℃活性有10％。該酶的主要用途是進(jìn)行PCR反應(yīng)（詳參聚合酶鏈，polymerasechainreaction）

TaqDNA聚合酶(TaqDNApol，Taqpol）該酶是一種耐熱的依賴于DNA的DNA聚合1.來源

源于T4噬菌體感染的E.coli。

2.酶的活性，相似于Klenow片段，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于Klenow片段（1）5ˊ→3ˊ

聚合活性（2）3ˊ→5ˊ

外切酶活性（T4pol/Klenow）

3.基因工程中用途與Klenow片段一致（參前，標(biāo)記末端，填平5’末端），不同的是可對3’突出端的DNA分子進(jìn)行標(biāo)記。這是用其強(qiáng)勁的3ˊ→5ˊ外切酶活性切除3’突出端，產(chǎn)生3’凹端。

5’－CTGCCTGCA—3’T4DNApol5’－CTG5’-CTACC

3’-GACGG32P-dCtp,dNtp3’－GACGG3’-GACGGT4噬菌體DNA聚合酶（T4DNApol）1.來源源于T4噬菌體感染的E.coli。T5.末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶能催化dNTP依次聚合到DNA的3`末端。主要應(yīng)用：給目的DNA、cDNA和載體加上互補(bǔ)的多聚脫氧核苷酸尾巴(人工粘性末端)。5.末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶能催化dNTP依次聚合到DNA的3`（二）載體定義：是攜帶目的DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的工具。常用載體：細(xì)菌質(zhì)粒噬菌體黏粒病毒人工染色體（二）載體定義：是攜帶目的DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增1、載體必須是復(fù)制子，在宿主細(xì)胞中能大量復(fù)制。2、同一限制性核酸內(nèi)切酶在載體上只有單一酶切位點(diǎn)。3、具有選擇性遺傳標(biāo)志。4、具有較多的拷貝數(shù)5、分子量相對較小，有足夠的接納目的基因的容量6、具有較高的遺傳穩(wěn)定性載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)1、載體必須是復(fù)制子，在宿主細(xì)胞中能大量復(fù)制。2、同一限制性1.質(zhì)粒

(plasmid)特點(diǎn)能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息,會賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。1.質(zhì)粒(plasmid)特點(diǎn)

質(zhì)粒：是存在于細(xì)菌染色體外小型雙鏈環(huán)狀DNA，能在宿主細(xì)胞中獨(dú)立地復(fù)制，并在細(xì)胞分裂時(shí)傳遞給子代細(xì)胞，其DNA分子上的基因?qū)λ拗骷?xì)胞的代謝活動(dòng)和抗藥性的表型均有一定的作用?？少x予細(xì)菌特定的表型，如抗生素抗性，是篩選轉(zhuǎn)化子細(xì)菌的遺傳標(biāo)志。質(zhì)粒：是存在于細(xì)菌染色體外小型雙鏈環(huán)狀DNA，能在宿主細(xì)(二)目的基因與載體的連接課件(二)目的基因與載體的連接課件質(zhì)粒應(yīng)具備的特點(diǎn)1、在細(xì)菌內(nèi)穩(wěn)定存在，有較高的拷貝數(shù)2、具有一個(gè)以上的遺傳標(biāo)志3、有多克隆位點(diǎn)質(zhì)粒應(yīng)具備的特點(diǎn)1、在細(xì)菌內(nèi)穩(wěn)定存在，有較高的拷貝數(shù)2、具有λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)λgt系列（插入型，適用cDNA克?。〦MBL系列（置換型，適用基因組克?。?.噬菌體(phage)

M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)2.噬菌體(phage)M13噬λ噬菌體DNA溶菌性生長溶源性生長容納23Kb的DNA片斷，其基因組除在5'端有12個(gè)可互補(bǔ)的堿基(cos區(qū)）外均為線性雙鏈DNA，感染時(shí)DNA形成環(huán)狀。λ噬菌體DNA溶菌性生長容納23Kb的DNA片斷，其基因組除目錄目錄M13噬菌體克隆單鏈DNAM13噬菌體是一種絲狀噬菌體，內(nèi)有一個(gè)環(huán)狀單鏈DNA分子，長6407個(gè)核苷酸。單鏈DNA的酶切和連接是比較困難的，因此M13噬菌體在用作載體時(shí)是利用其雙鏈RFDNA。RFDNA很容易從感染細(xì)胞中純化出來，可以象質(zhì)粒一樣進(jìn)行操作，并可通過轉(zhuǎn)化方法再次導(dǎo)入細(xì)胞

M13噬菌體克隆單鏈DNAM13噬菌體是一種絲狀噬菌體，內(nèi)有3.粘性質(zhì)粒(cosmid)3.粘性質(zhì)粒(cosmid)粘性質(zhì)粒特點(diǎn)1、具有質(zhì)粒的抗藥性標(biāo)記2、具有cos區(qū)3、一個(gè)或多個(gè)酶切位點(diǎn)4、不能在體外包裝，本身不大，有利于篩選容納40-50Kb的DNA片斷粘性質(zhì)粒特點(diǎn)容納40-50Kb的DNA片斷人工染色體YAC(酵母人工染色體,yeastartificialchromosome)100-2000kbBAC(細(xì)菌人工染色體,bacterialartificialchromosome)300kb人工染色體YAC(酵母人工染色體,yeastartific載體的分類分類依據(jù)

類別克隆擴(kuò)增或表達(dá)舉例1.按功能分成（1）克隆載體（2）表達(dá)載體√√PBR322PCDN32.按進(jìn)入受體細(xì)胞類型分（1）原核載體（2）真核載體（3）穿梭載體PUC8PBUDCE41YE3.按載體來源分病毒載體＋4.按克隆片段得大?。寺∧芰Γ┓?1)<1kb(2)<10kb(3)<22kb(4)<50kb(5)0.1-0.4Mb(6)0.5-2Mb(1)M13(2)plasmid(3)λphage(4)casmid(5)BAC(6)YAC√載體的分類分類依據(jù)類別克隆擴(kuò)增或表三、基因工程的操作過程基本過程目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體菌外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選克隆基因的表達(dá)

三、基因工程的操作過程基本過程目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體(二)目的基因與載體的連接課件

為基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究的需要而分離獲得的某一感興趣的基因（DNA序列），或者是為得到某一感興趣的蛋白質(zhì)或RNA所對應(yīng)的DNA序列。有兩種類型，既cDNA和基因組DNA。

目的基因

cDNA(complementaryDNA)基因組DNA(genomicDNA)為基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究的需要而分離獲得的某一感興趣（一）目的基因的獲得·

化學(xué)合成法

要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列·基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)··將基因組DNA經(jīng)內(nèi)切酶消化后插入載體，得到含有不同插入片段載體，這種克隆載體混合物應(yīng)該含有不同基因組片段，此即基因文庫。

cDNA文庫(cDNAlibrary)將細(xì)胞所有mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA片段，克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中，構(gòu)建成含有不同cDNA片段的克隆載體混合物，此即cDNA文庫。

聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)（一）目的基因的獲得·化學(xué)合成法·基因組DNA文庫(gen*化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列*化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合*從基因組DNA文庫獲取目的基因目錄組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分mRNAcDNA雙鏈cDNA重組DNA分子cDNA文庫反轉(zhuǎn)錄酶載體受體菌復(fù)制*從cDNA文庫獲取目的基因逆轉(zhuǎn)錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT目錄mRNAcDNA雙鏈cDNA重組DNA分子（二）目的基因與載體的連接

1．同源黏性末端連接

方式：同一限制酶切割位點(diǎn)連接配伍末端連接2、平端連接

適用于：限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的平端切割黏性末端或切平形成的平端3、定向連接

適用于：兩種不同的黏性末端一個(gè)黏端，一個(gè)平端

（二）目的基因與載體的連接1．同源黏性末端連接目的基因與載體的各種連接方式目的基因與載體的各種連接方式粘性末端連接

1.利用相同的酶切位點(diǎn)——單酶單切點(diǎn)

用同一種酶分別切割目的基因/載體，然后進(jìn)行連接。優(yōu)點(diǎn)：二者產(chǎn)生相同的粘性末端，彼此很易按堿基配對退火，在ligase作用下生成DNA分子重組體。geneEcoRⅠvectorEcoRⅠ

問題與解決辦法：

（1）自身環(huán)化

粘性末端自發(fā)形成雙鏈，連接產(chǎn)物含大量的目的基因和載體自身環(huán)化的假重組體－>若轉(zhuǎn)化則出現(xiàn)假陽性克隆。

解決辦法是

用高濃度的DNA（目的基因：載體為3：1）和堿性磷酸酶（AP：BIP/CIP）處理載體，去除5‘－P使之不能自身環(huán)化，缺口在宿主內(nèi)可得到修復(fù)。

（2）不能定向克隆/插入

由于是單一位點(diǎn)，目的基因可以以不同方向插入載體。對于克隆擴(kuò)增問題不大，因?yàn)榭寺∩先サ幕蛟僦亟M時(shí)又要切下來；對于表達(dá)載體目的基因必須按5‘－3’方向克隆在啟動(dòng)子下游而不能反之。此時(shí)只能靠運(yùn)氣了。粘性末端連接BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點(diǎn)連接目錄BamHⅠ切割反應(yīng)GGATCCT4DNA連接酶GATC2.利用不同的酶切位點(diǎn)——雙酶雙切點(diǎn)（定向克?。﹥?yōu)點(diǎn)（1）避免載體/目的基因的自身環(huán)化，提高連接效率；（2）可控制外源基因插入方向。構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)最好使用雙酶雙切點(diǎn)，這樣方式也稱定向克隆。如：目的基因和載體都有EcoRⅠ，PstⅠ酶切位點(diǎn)，產(chǎn)生各自互補(bǔ)粘端，分別配對連接。E.coRⅠgenePstⅠEcoRⅠvectorPstⅠ

3.利用同裂酶，分別切割目的基因/載體，產(chǎn)生相同粘端，因而可以連在一起，如：

5’——GGATCC——3’Saw3AIgeneBamHIvector3’——CCTAGG——5’

構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，同裂酶也很有用。ligase2.利用不同的酶切位點(diǎn)——雙酶雙切點(diǎn)（定向克?。﹍igase不同限制酶切位點(diǎn)（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點(diǎn)Bg

lⅡ切割位點(diǎn)+EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點(diǎn)連接相似。目錄不同限制酶切位點(diǎn)（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點(diǎn)Bg平端連接

沒有合適的產(chǎn)生粘端的限制酶切位點(diǎn)，可采用平端連接，但連接效率<粘端。并且連接反應(yīng)中更偏向于載體自身環(huán)化，擬用下述措施可提高連接效率。措施：平端連接沒有合適的產(chǎn)生粘端的限制酶切位點(diǎn)，可采用平端目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連目錄目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶重組體同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。同聚物加尾連接5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體目錄5′3′載體DNA5′3′目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶人工接頭(linker)連接由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。

人工接頭(linker)連接人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ目錄人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCG5′-EcoRⅠEco（三）重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞受體菌的條件：安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)導(dǎo)入方式：轉(zhuǎn)化(transformation)

轉(zhuǎn)染(transfection)

轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)（三）重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞受體菌的條件：安全宿主菌導(dǎo)入方式：轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化CaCl2法電穿孔轉(zhuǎn)染

磷酸鈣共沉淀法病毒感染法脂質(zhì)體融合法轉(zhuǎn)化CaCl2法轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)化子不一定就是重組子。

轉(zhuǎn)化菌中有一部分是重組子，質(zhì)粒載體就是粘端基因的重組體，含有載體抗生素抗性基因，可在含抗生素平板上存活。

而酶切不完全或酶切后載體未與目的基因重組而自身環(huán)化導(dǎo)入host中去的另一部分就可能不是的，但因含抗生素抗性基因也可在抗生素平板上生長，所需要rDNA篩選。確定外源DNA片段是否插入并與載體連接。（四）DNA重組體的篩選轉(zhuǎn)化子不一定就是重組子。（四）DNA重組體直接選擇法：

抗藥性標(biāo)記選擇標(biāo)志補(bǔ)救

α互補(bǔ)

分子雜交法

原位雜交

Southern印跡

非直接選擇法：

免疫學(xué)方法

如免疫化學(xué)方法酶免檢測法篩選方法直接選擇法：非直接選擇法：篩選方法(插入失活法)抗藥性標(biāo)記選擇目錄(插入失活法)目錄組氨酸缺陷型大腸桿菌無組氨酸的培養(yǎng)基酵母咪唑甘油磷酸脫水酶基因促進(jìn)組氨酸合成λDNA重組體標(biāo)志補(bǔ)救目錄組氨酸缺陷無組氨酸酵母咪唑甘油磷促進(jìn)組氨酸合成λDNA重組體α互補(bǔ)的檢測目錄α互補(bǔ)的檢測目錄藍(lán)白斑篩選重組質(zhì)粒與PCR鑒定重組質(zhì)粒結(jié)束放映返回目錄藍(lán)白斑篩選重組質(zhì)粒與PCR鑒定重組質(zhì)粒結(jié)束放映返回目錄（五）

DNA重組體的鑒定

外源DNA片斷是否插入載體構(gòu)成重組DNA分子.而插入片斷大小,是否突變及插入位置,順序及方向則關(guān)系到構(gòu)建載體是否擴(kuò)增,我們所需要的基因或表達(dá),表達(dá)相應(yīng)的產(chǎn)品.所以需要進(jìn)一步鑒定DNA重組體,方法有酶切鑒定,測序和表達(dá)產(chǎn)物鑒定.（一）酶切鑒定是必需的,基于下述:1.限制性圖譜個(gè)體特異性,

不同的載體或DNA分子物理圖譜不同,酶切后片段大小不一樣,電泳圖譜不一樣。

2.同一載體連接不同的DNA片斷,不同的載體連接同一片段(片段上也有位點(diǎn)）酶切圖譜是不同的。

3.插入法(單酶單切點(diǎn))或替代法(雙酶雙位點(diǎn))酶切一般來說用3種限制酶切：①可鑒定載體及②插入片段的大小,方向,切后并電泳分析,以確定是否得到預(yù)期的rDNA。（二）若構(gòu)建DNA重組體是為了克隆某個(gè)基因,可進(jìn)行在序列測定。（三）若構(gòu)建表達(dá)載體,可進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物鑒定。（五）DNA重組體的鑒定重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為小結(jié)分分離目的基因切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌篩篩選重組體鑒鑒定陽性克隆重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為小結(jié)分分離目的基重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNAcDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交目錄重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源（六）外源基因的表達(dá)原核表達(dá)體系

大腸桿菌

標(biāo)準(zhǔn)：

選擇標(biāo)志強(qiáng)啟動(dòng)子

SD序列多接頭克隆位點(diǎn)不足：

不宜表達(dá)真核基因組DNA

不能加工表達(dá)的真核蛋白質(zhì)表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體很難表達(dá)大量可溶性蛋白（六）外源基因的表達(dá)原核表達(dá)體系大腸桿菌不足：不優(yōu)點(diǎn)：可表達(dá)克隆的cDNA及真核基因組DNA可適當(dāng)修飾表達(dá)的蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物分區(qū)域積累缺點(diǎn)：操作技術(shù)難、費(fèi)時(shí)、費(fèi)錢轉(zhuǎn)染

——將表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程方法：磷酸鈣轉(zhuǎn)染DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染電穿孔脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染顯微注射

2.真核表達(dá)體系

酵母、昆蟲、乳類動(dòng)物細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)：可表達(dá)克隆的cDNA及真核基因組DNA轉(zhuǎn)染——將表優(yōu)點(diǎn)：

■重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞具有遺傳的穩(wěn)定性和可重復(fù)性

■哺乳動(dòng)物細(xì)胞能對外源基因轉(zhuǎn)錄的hnRNA剪切加工成成熟的mRNA

■對表達(dá)的蛋白質(zhì)能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后的加工如糖基化

■可將表達(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中方便下游的提純?nèi)秉c(diǎn)：操作技術(shù)難費(fèi)時(shí)不經(jīng)濟(jì)真核表達(dá)體系（酵母、昆蟲、乳類動(dòng)物細(xì)胞）優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：操作技術(shù)難真核表達(dá)體系（酵母、昆蟲、乳類動(dòng)物細(xì)胞（一）疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆根據(jù)基因定位克隆之并研究其性質(zhì)，而認(rèn)識疾病的分子機(jī)制。四、重組技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系（二）生物制藥（一）疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆四、重組技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系（二）生物

重組DNA醫(yī)藥產(chǎn)品產(chǎn)品功能組織胞漿素原激活劑抗凝血液因子VIII促進(jìn)凝血顆粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落剌激因子剌激白細(xì)胞生成促紅細(xì)胞生成素剌激白細(xì)胞生成生長因子(bFGF,EGF)刺激細(xì)胞生長與分化生長素治療侏儒癥胰島素治療糖尿病干擾素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些腫瘤白細(xì)胞介素激活、剌激各類白細(xì)胞超氧化物歧化酶抗組織損傷單克隆抗體利用其結(jié)合特異性進(jìn)行診斷試驗(yàn)、腫瘤導(dǎo)向治療乙肝疫苗(CHO,酵母)預(yù)防乙肝口服重組B亞單位菌體霍亂菌苗預(yù)防霍亂目錄重組DNA醫(yī)藥產(chǎn)品產(chǎn)品功能組織胞漿素原激基因診斷(geneticdiagnosis)是利用分子生物學(xué)及分子遺傳的技術(shù)和原理，在DNA水平分析、鑒定遺傳疾病所涉及基因的置換、缺失或插入等突變。（三）基因診斷基本過程區(qū)分或鑒定DNA的異常分離、擴(kuò)增待測的DNA片斷基因診斷(geneticdiagnosis)是利用分子生物標(biāo)準(zhǔn).能正確擴(kuò)增靶基因；.能準(zhǔn)確區(qū)分單個(gè)堿基的差別；.本底或噪聲低，不干擾DNA的鑒定;.便于完全自動(dòng)化操作，適合大面積、大人群普查。標(biāo)準(zhǔn)（四）基因治療定義基因治療(genetherapy)是向有功能缺陷的細(xì)胞補(bǔ)充相應(yīng)功能的基因，以糾正或補(bǔ)償其基因的缺陷，從而達(dá)到治療的目的。方式體細(xì)胞基因治療(somaticcellgenetherapy)性細(xì)胞基因治療(germlinegenetherapy)（四）基因治療定義方式1.產(chǎn)前診斷2.攜帶者測試3.癥候前診斷4.遺傳病易感性（五）遺傳疾病的預(yù)防1.產(chǎn)前診斷（五）遺傳疾病的預(yù)防目的基因化學(xué)合成文庫篩選PCRRT-PCR酶切片段載體原核克隆表達(dá)真核表達(dá)

連接重組DNA載體體外基因轉(zhuǎn)錄翻譯制備探針基因表達(dá)產(chǎn)物的功能研究基因工程技術(shù)流程及用途示意圖原核細(xì)胞表達(dá)生物活性蛋白構(gòu)建基因文庫序列分析體外基因突變真核細(xì)胞酵母，哺乳動(dòng)物，昆蟲等建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系遺傳修飾動(dòng)物基因表達(dá)產(chǎn)物的定位及功能分析生物活性蛋白的生產(chǎn)瞬時(shí)表達(dá)產(chǎn)物的定位及功能的研究轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)化目的基因化學(xué)合成文庫篩選PCRRT-PCR酶切片段載體原核克生化故事生化故事

杜爾貝科和特明從1958年起，對當(dāng)時(shí)勞斯分離的雞肉瘤病毒（RSV）的同類病毒----多瘤病毒進(jìn)行分子生物學(xué)的研究，幾年后又分離到一種猿猴病毒SV40。這些發(fā)現(xiàn)促使他們認(rèn)識到癌與病毒的關(guān)系。他們的第一項(xiàng)發(fā)現(xiàn)是，SV40病毒的DNA是一種原病毒，它和宿主細(xì)胞的DNA形成永久性雙鏈結(jié)合。第二項(xiàng)發(fā)現(xiàn)是，病毒在細(xì)胞里的增殖激發(fā)了細(xì)胞染色體DNA的復(fù)制。第三項(xiàng)發(fā)現(xiàn)是，激發(fā)染色體DNA復(fù)制的早熟型病毒基因也控制著伴隨癌變而發(fā)生的細(xì)胞表面的變化。杜爾貝科、特明與逆轉(zhuǎn)錄酶杜爾貝科和特明從1958年起，對當(dāng)時(shí)勞斯分離的杜

特明于1960年在研究RSV并提出轉(zhuǎn)化假說的基礎(chǔ)上，正式創(chuàng)立原病毒假說：有感染力的RSV的RNA的作用是病毒DNA(即原病毒)合成的模板，而原病毒則是子代RSV的RNA合成的信息。他的假說很久未被注意，亦未被實(shí)驗(yàn)證實(shí)。1969年他用實(shí)驗(yàn)證實(shí)RSV含有一種DNA的聚合酶，這種酶的活性是“內(nèi)源性RNA引導(dǎo)的DNA聚合酶活性”，該酶以后被稱為“RNA依賴性的DNA聚合酶”或“逆轉(zhuǎn)錄酶”。這個(gè)發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充了原來人們無懷疑的“中心法則”。杜爾貝科、特明與逆轉(zhuǎn)錄酶特明于1960年在研究RSV并提出轉(zhuǎn)化假說的基礎(chǔ)杜

TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1975

"fortheirdiscoveriesconcerningtheinteractionbetweentumourvirusesandthegeneticmaterialofthecell"

DavidBaltimore1/3oftheprizeUSA

MassachusettsInstituteofTechnology(MIT)

Cambridge,MA,USAb.1938

TheNobelP

TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1975

"fortheirdiscoveriesconcerningtheinteractionbetweentumourvirusesandthegeneticmaterialofthecell"

HowardMartinTemin

1/3oftheprizeUniversityofWisconsin

Madison,WI,USAb.1934d.1994TheNobelPrizeinPhy

TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1975

"fortheirdiscoveriesconcerningtheinteractionbetweentumourvirusesandthegeneticmaterialofthecell"

RenatoDulbecco

1/3oftheprizeUSA

ImperialCancerResearchFundLaboratory

London,UnitedKingdomb.1914

(inCatanzaro,Italy)TheNobelPrizeinPhysi內(nèi)森斯發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶

1969年從事猿猴病毒SV40研究時(shí)，收到科學(xué)家史密斯的一封信，通報(bào)他分離內(nèi)切酶成功。內(nèi)森斯將史密斯的成果與其研究進(jìn)行比較，他觀察到，當(dāng)λ噬菌體從細(xì)菌染色體上切割下來時(shí)，有時(shí)會發(fā)生錯(cuò)誤，使異常的λ基因組從宿主基因組那得到一個(gè)片斷；并且λ基因組也丟失一個(gè)片斷，這個(gè)片斷有噬菌體增殖所必不可少的基因。他運(yùn)用演繹推理,提出一種推測，認(rèn)為修飾的機(jī)理可能在于DNA限制性內(nèi)切酶的存在。內(nèi)森斯發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶1969年從事猿猴病毒SV4以后通過若干試驗(yàn)，進(jìn)一步做出判斷：限制作用與噬菌體DNA降解相關(guān)聯(lián)。1965年他完整的提出一個(gè)假說：可能存在一種位點(diǎn)專一的限制性內(nèi)切酶。但1968年他分離到的卻是位點(diǎn)并不專一的限制酶。

1968年初正在研究流感嗜血桿菌Rb株遺傳重組的史密斯，在實(shí)驗(yàn)中偶然選用了噬菌體P22標(biāo)記DNA,又偶然地遇到了無法從細(xì)菌細(xì)胞中回收外源DNA這樣一個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。當(dāng)時(shí)他得到阿爾伯已經(jīng)內(nèi)森斯發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶以后通過若干試驗(yàn)，進(jìn)一步做出判斷：限制作用內(nèi)森斯發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)分離到內(nèi)切酶的消息，便聯(lián)想到自己的工作，意識到手中的噬菌體DNA可能受到了限制作用。于是他立刻放下這一研究課題，應(yīng)用自己設(shè)計(jì)的黏度計(jì)，全力以赴分離和研究預(yù)想中的限制酶。1970年終于分離到真正位點(diǎn)專一的限制性內(nèi)切酶，從而使阿爾伯的假說變?yōu)橐环N科學(xué)學(xué)說。內(nèi)森斯發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶分離到內(nèi)切酶的消息，便聯(lián)想到自己的工作，意識到內(nèi)森斯發(fā)現(xiàn)限制

TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1978

"forthediscoveryofrestrictionenzymesandtheirapplicationtoproblemsofmoleculargenetics"

WernerArber

1/3oftheprizeSwitzerland

BiozentrumderUniversit

Basel,Switzerlandb.1929TheNobelPrizein

TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1978

"forthediscoveryofrestrictionenzymesandtheirapplicationtoproblemsofmoleculargenetics"

DanielNathans1/3oftheprize

JohnsHopkinsUniversitySchoolofMedicine

Baltimore,MD,USAb.1928d.1999TheNobelPrizeinPhysi

TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1978

"forthediscoveryofrestrictionenzymesandtheirapplicationtoproblemsofmoleculargenetics"

HamiltonO.Smith1/3oftheprize

JohnsHopkinsUniversitySchoolofMedicine

Baltimore,MD,USAb.1931TheNobelPrizeinPhysi桑格測定胰島素一級結(jié)構(gòu)并發(fā)明DNA測序法

1943年人們已知胰島素是由51個(gè)氨基酸構(gòu)成的,桑格用特殊的化學(xué)試劑以及電泳、色譜等方法，逐段對其分解測定，經(jīng)過十年努力,終于在1953年精確測定了胰島素的一級結(jié)構(gòu)。它是由分別含有21個(gè)30個(gè)氨基酸殘基的兩條鏈通過其中兩個(gè)半胱氨酸的兩個(gè)—SH,氧化后以-S-S-聯(lián)結(jié)起來的。這是人們第一次精確測定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),為以后測定更復(fù)雜的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)打下了良好的基礎(chǔ)。桑格為此榮獲了1958年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。桑格測定胰島素一級結(jié)構(gòu)并發(fā)明DNA測序法1943年

20世紀(jì)60年代以后，桑格的研究方向轉(zhuǎn)向了測定核酸中核苷酸的連接順序，又獲得了1980年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。至目前為止，桑格是惟一一位兩次獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的科學(xué)家。20世紀(jì)60年代以后，桑格的研究方向轉(zhuǎn)向了測伯格與基因工程技術(shù)

1971年伯格研究小組用限制性內(nèi)切酶打開了腫瘤病毒SV40的DNA,然后把噬菌體λ的一段DNA切割下來，裝到被打開的SV40的DNA上，成功獲得了SV40-λ新的雜種,也就是產(chǎn)生了新的生命。由于政府和科學(xué)家耽心引起不良后果，進(jìn)一步的工作在1975年才開展。他們把許多基因接到SV40上，并把雜種SV40引入細(xì)胞或細(xì)菌中。伯格與基因工程技術(shù)1971年伯格研究小組用限

這就導(dǎo)致了現(xiàn)代“基因工程”的誕生。人們可以把一段能產(chǎn)生某種蛋白質(zhì)的基因植入某種細(xì)菌的DNA中，當(dāng)細(xì)菌繁殖時(shí)，這段基因就不斷產(chǎn)生這種蛋白質(zhì)。例如，γ干擾素、腫瘤壞死因子就是這樣產(chǎn)生出來的。伯格作為“基因工程”的開拓者榮獲了1980年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的一半。

伯格與基因工程技術(shù)這就導(dǎo)致了現(xiàn)代“基因工程”的誕生。人們可以伯格與

本年度化學(xué)獎(jiǎng)的另一半為基爾伯特和桑格獲得。作為物理學(xué)家的基爾伯特受科學(xué)交流的啟發(fā)，使用硫酸二甲酯處理DNA，使DNA中有腺嘌呤和鳥嘌呤的地方斷開，從而獲得到一系列不同長度的脫氧核苷酸片斷。分別測定各個(gè)片斷，最后就能確定整個(gè)DNA中全部脫氧核苷酸的排列順序。伯格與基因工程技術(shù)本年度化學(xué)獎(jiǎng)的另一半為基爾伯特和桑格獲得。伯格與基因

如果說物理學(xué)家基爾伯特是用化學(xué)方法測定DNA中脫氧核苷酸的順序，那么化學(xué)家桑格則是用生物學(xué)中酶的切割作用把RNA切割成小的片段，來測定核苷酸的排列順序。他又把DNA雙螺旋用酶切割成互補(bǔ)的許多小片段，在進(jìn)行特殊的電泳分離測定，從而得知DNA中脫氧核苷酸的排列順序。

伯格與基因工程技術(shù)如果說物理學(xué)家基爾伯特是用化學(xué)方法測定DNA中伯格

穆利斯發(fā)明PCR技術(shù)

生物體中的DNA會不斷進(jìn)行自我復(fù)制。但在生物體外,怎樣使少量的DNA片段擴(kuò)增至原來的成千上萬倍，甚至幾百萬倍呢？作為化學(xué)家的穆利斯在1983年深夜駕車開過繞山的螺旋形公路時(shí)，冒出了一個(gè)極妙的想法，并在1985年成功的付諸實(shí)踐,這就是“多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”，即PCR技術(shù)。

穆利斯發(fā)明PCR技術(shù)生物體中的DNA會不斷進(jìn)

這個(gè)技術(shù)首先根據(jù)待擴(kuò)增的DNA片段兩端的脫氧核苷酸序列?；瘜W(xué)合成出兩條互補(bǔ)的寡聚脫氧核苷酸引物，引物的作用是使DNA片段擴(kuò)增。然后將過量的合成引物、四種脫氧核苷酸、DNA合成酶和待擴(kuò)增的DNA片段混合，先高溫變性（使DNA片段雙螺旋解開），再進(jìn)行低溫退火（使兩種引物各與一條DNA鏈相連接），和中溫延伸（引物加DNA的兩條鏈分別都1變2,2變4,

以2n倍速擴(kuò)增，每一循環(huán)才幾分鐘，幾十分鐘后就可以使原來的DNA片段擴(kuò)大幾萬、幾十萬甚至一百多萬倍，為人類進(jìn)行微量遺傳物質(zhì)的分析研究提供了極為有效的方法。穆利斯發(fā)明PCR技術(shù)

這個(gè)技術(shù)首先根據(jù)待擴(kuò)增的DNA片段兩端的脫氧核穆利斯史密斯建立定點(diǎn)誘變技術(shù)

史密斯是在喝咖啡時(shí)，與同事的討論中想到了一個(gè)進(jìn)行定點(diǎn)誘變的好主意。這個(gè)主意付諸實(shí)踐就是：先把有待突變的DNA克隆到M13噬菌體上。使之感染細(xì)菌，在細(xì)菌體內(nèi)感染繁殖復(fù)制，提取出單鏈的DNA，加入突變的引物（合成的寡聚脫氧核糖核苷酸），使之與帶有目的DNA單鏈的M13噬菌體雜交，在加入DNA聚合酶和四種脫氧核苷酸，使雜交后的突變引物延伸，經(jīng)處理后去感染細(xì)菌，從中篩選出帶突變DNA序列的突變體。這就是聚核苷酸定點(diǎn)誘變技術(shù),可以用來對任意已知的DNA序列進(jìn)行改變。這項(xiàng)技術(shù)改變了過去盲目誘導(dǎo)突變的方法（如用X射線照射）。史密斯建立定點(diǎn)誘變技術(shù)史密斯是在喝咖啡時(shí)，與同事復(fù)習(xí)思考題1、重組DNA技術(shù)（基因工程）的基本過程。2、作為載體必須具備的條件。3、目的基因獲取的方法復(fù)習(xí)思考題1、重組DNA技術(shù)（基因工程）的基本過程。

基因重組和基因工程

GeneticRecombinationandGeneticEngineering張景萍生物化學(xué)教研室基因重組和基因工程張景萍一、教學(xué)目的：在掌握重組DNA技術(shù)的基本過程的基礎(chǔ)上，學(xué)習(xí)工具酶、載體等內(nèi)容。二、教學(xué)要求：1．掌握重組DNA技術(shù)的基本過程；2．掌握工具酶和載體的概念；3．熟悉常用的克隆載體；4．熟悉目的基因的制備。

目的要求一、教學(xué)目的：在掌握重組DNA技術(shù)的基本過程的基礎(chǔ)上，學(xué)習(xí)工教學(xué)內(nèi)容1．工具酶①限制性核酸內(nèi)切酶；②修飾酶（DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、T4DNA聚合酶、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶。）2．載體①常用的克隆載體（質(zhì)粒、噬菌體、病毒）；②表達(dá)載體3．重組DNA技術(shù)的基本過程①目的基因的制備②載體的選擇和制備③DNA的體外連接④將外源DNA導(dǎo)入宿生細(xì)胞⑤目的基因的篩選和鑒定4．克隆基因的表達(dá)①克隆基因在大腸桿菌中的表達(dá)②克隆基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)教學(xué)內(nèi)容1．工具酶

基因工程分子雜交聚合酶鏈反應(yīng)

DNA序列測定轉(zhuǎn)基因動(dòng)物克隆動(dòng)物基因剔除技術(shù)基因診斷和基因治療基因有關(guān)的操作技術(shù)基因工程基因有關(guān)的操作技術(shù)

第一節(jié)基因工程第一節(jié)重組DNA技術(shù)的發(fā)展史年G.J.Mendel的豌豆雜交試驗(yàn)1944年O.T.Avery的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)1973年美國斯坦福大學(xué)的科學(xué)家構(gòu)建第一個(gè)重組DNA分子1977年美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的藥物。1980年開始建造第一家應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠1997年英國羅林研究所成功的克隆了多莉重組DNA技術(shù)的發(fā)展史年G.J.Mendel的豌豆雜交試

（一）重組DNA技術(shù)（recombinantDNAtechnology）

是在體外按人們的意愿將不同的DNA

分子重組的技術(shù)。一、基因工程相關(guān)概念（一）重組DNA技術(shù)一、基因工程相關(guān)概念

是指利用重組DNA技術(shù)將目的基因和載體重組，再導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的過程。（二）基因工程(geneticengineering)是指利用重組DNA技術(shù)將目的基因（二）基因工程(ge

是指通過無性繁殖過程所產(chǎn)生的與親代完全相同的子代群體。基因工程相當(dāng)于目的基因的無性繁殖過程，也稱其為基因克隆(genecloning)。

（三）克?。╟lone）是指通過無性繁殖過程所產(chǎn)生的（三）克隆（clone）二、基因工程操作中常用的工具二、基因工程操作中常用的工具

在這個(gè)過程中：

1.“基因剪刀”

剪取DNA的酶就像一把“基因剪刀”

2.“縫紉針”

連接不同來源DNA分子的酶就像一根“縫紉針”，使二者連在一起

3.“交通工具”使用載體好比一輛車子

4.“乘客”

有用基因如IL2好比使乘客，車子把乘客送進(jìn)理想天堂（宿主細(xì)胞）去繁衍生息，春華秋實(shí)，生產(chǎn)我們需要的產(chǎn)品或開展基因治療（IL2/LAK→抗癌）。在這個(gè)過程中：常用的工具酶（toolenzymes）有：

1.限制性核酸內(nèi)切酶（resrictionenzymes,restrictionendonadease)2.DNA連接酶（DNAligase,ligase)3.逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)4.DNA聚合酶(DNApolymerase,DNApol)5.核酸酶(nuclease)6.末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)7.堿性磷酸酶(BAP或CIP)以1.和2.最為常用，最為重要。工具酶現(xiàn)已商品化。（一）工具酶常用的工具酶（toolenzymes）有：（一）工具酶

1．限制性內(nèi)切酶(restrictionendonuclease)

定義:是一類能識別和切割雙鏈DNA分子中特定堿基序列的核酸水解酶分類:Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ所謂限制（restriction）=切割（clearage）=水解（hydrolysis）該部位的核苷鍵（磷酸二酯鍵）1．限制性內(nèi)切酶(restrictionendonucl作用：與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護(hù)自身DNA。

命名：第一個(gè)字母代表細(xì)菌的屬名，用大寫；第二、三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。作用：與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，命名：第一個(gè)字

Ⅱ型限制酶識別序列特點(diǎn)—回文結(jié)構(gòu)······GAATTC············CTTAAG······切口：黏性切口和平端切口Ⅱ型限制酶識別序列特點(diǎn)—回文結(jié)構(gòu)······GAATTC

EcoRⅠHpaⅡ

—GAATTC—

—GTTAAC—

—CTTAAG—

—CAATTG—

—G

—CTTAA

黏端切口平端切口

+AATTC—G——GTT—CAA+AAC—TTG—EcoRⅠBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口BamHⅠGTCGGATCC+GGATCCHindⅡGTC三種切割方式

EcoRI5`----NGAATTCN----3`

5`----NGAATTGN----3`3`----NCTTAAGN----5`3`----NCTTAACN----5`5`粘性末端在對稱軸5`側(cè)切割產(chǎn)生5`粘端三種切割方式3`----NCTTAAGN-在對稱軸的3`側(cè)切割產(chǎn)生3`粘端，PstI5`----NCTGCAGN----3`3`----NGACGTCN----5`CTGCAGGACGTC5`----NCTGCA3`----NGCTGCAGGN----3`ACGTCN----5`GACGTC3`-粘性末端在對稱軸的3`側(cè)切割產(chǎn)生3`粘端，PstI5`----N同功異源酶來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點(diǎn)，這些酶稱同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同功異源酶GGATCCGGATCC+BamHⅠGGATCC同尾酶有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個(gè)相同的粘性末端稱為配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA同尾酶BamHⅠBglⅡGGATCCAGATCTGDNA連接酶是基因工程第二位重要的工具酶，常用T4DNAligase.

（一）功能：催化有互補(bǔ)順序的兩個(gè)dsDNA分子的粘性末端或平頭末端3′－OH和5′－P連接作用。（二）來源－噬菌體T4感染Ecoli分離的一種單鏈多肽酶、MW6.0KD。

2．DNA連接酶DNA連接酶是基因工程第二位重要的工具酶，常用T4DNAlOH5`5`3`3`P連接酶5`5`3`3`OH5`5`3`3`P連接酶5`5`3`3`（一）概述

逆轉(zhuǎn)錄酶也稱反轉(zhuǎn)錄酶或RNA依賴的DNA聚合酶（RNAdependentDNApolymerase,RDDP）。是由Baltimove從鼠白血病病毒（murineleukemiavirus,MLV）和Mizutan從勞氏肉瘤病毒(Roussarcomavirus,RSV)中，于1970年分別各自發(fā)現(xiàn)的，這兩個(gè)小組論文同時(shí)在同一期Nature上，可見其意義。該酶在逆轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus）生產(chǎn)循環(huán)中起主宰作用。（二）功能基因工程中主要用于逆轉(zhuǎn)錄mRNA→cDNA（complementoryDNA）。（三）商品化逆轉(zhuǎn)錄酶有兩種

①AMV（禽成髓細(xì)胞瘤）②Mc-MLV(鼠白血病病毒)。3、逆轉(zhuǎn)錄酶（一）概述逆轉(zhuǎn)錄酶也稱反轉(zhuǎn)錄酶或RNA依賴的DNA聚合酶逆轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象RNA模板逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RNA雜化雙鏈RNA酶單鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶雙鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象RNA模板逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RN逆轉(zhuǎn)錄酶

AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT分子生物學(xué)研究可應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶，作為獲取基因工程目的基因的重要方法之一，此法稱為cDNA法。

以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成的與mRNA堿基序列互補(bǔ)的DNA鏈。試管內(nèi)合成cDNAcDNAcomplementaryDNA逆轉(zhuǎn)錄酶AAAATTTTAAAASI核酸酶D4.DNA聚合酶I主要有：大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段Taq酶T4噬菌體DNA聚合酶結(jié)束放映返回目錄4.DNA聚合酶I主要有：結(jié)束放映返回目錄

1956年，A.kornberg首先從E.coli中分離得到。是由1條多肽鏈組成的球蛋白，MW109KD，

（1）5′→3′DNA聚合酶活性以ssDNA為模板，沿引物3′－OH方向，按模板順序從5′→3′延伸。

（2）3′→5′外切酶活性即從游離的3′－OH末端降解ssDNA或dsDNA，其意義在于識別和消除不配對的核酸，保證DNA復(fù)制的忠實(shí)性。

（3）5′→3′外切酶活性從游離的5’端降解dsDNA成單核苷酸或寡核苷酸，也降解DNA:RNA雜交體RNA成分（具有RnaseH活性）大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ（E.coliDNApolⅠ）1956年，A.kornberg首先從E.c

基因工程很多情況下，E.coliDNApolⅠ可用它的1個(gè)大片段Klenow片段酶代替。該酶是枯草桿菌蛋白酶或胰蛋白酶降解E.coliDNApolⅠ所得到的。

1.Klenow大片段是一條多肽鏈，MW76KD，保留了E.colipolⅠ的5′→3′DNA聚合酶，3′→5′外切酶活性。

2.Klenow在基因工程用于：

(1)補(bǔ)平用限制酶消化dsDNA得到的5’粘性末端（即3’延伸末端）

(2)同（1），填平過程中，用32pdNTP標(biāo)記DNA片段3’末端。

(3)cDNA克隆了中，用于合成cDNA的第二條鏈。

(4)在Sanger雙脫氧法d