重金屬鉬離子免疫學(xué)分析

第頁重金屬鉬離子免疫學(xué)分析一、結(jié)果與分析

1.細(xì)胞融合備用小鼠的效價(jià)與敏感性結(jié)果免疫小鼠血清抗體效價(jià)均到達(dá)1∶104，說明獲得較好的免疫效果，其中3號小鼠效價(jià)最高為1∶（5.12×104）。以Mo6＋在3.906～1000μg／L時(shí)與過量EDTA鰲合后形成的鰲合物為抑制劑，5只小鼠的抗血清均產(chǎn)生了抑制。其中3號小鼠抑制效果最好，將其A450值轉(zhuǎn)化為B／B0，以B／B0為y軸，以Lg［Mo6＋－EDTA］為x軸，再對Lg［Mo6＋－EDTA］開展回歸分析，3號小鼠的線性回歸方程為y＝－32.185x＋96.364，r為0.9771，IC50為27.57μg／L。3號小鼠的抑制曲線見圖1。

2.Mo6＋－EDTAmAb雜交瘤細(xì)胞株的建立雜交瘤細(xì)胞株的篩選：細(xì)胞融合10d后觀察融合效果，4塊細(xì)胞培養(yǎng)板384孔中有雜交瘤克隆形成的有375孔，融合率為97.6％；同時(shí)開展間接ELISA和阻斷ELISA檢測，陽性48孔，陽性率為14.7％；3次亞克隆后獲得4株雜交瘤細(xì)胞，分別命名為1E3、2D7、2F10、4B3。雜交瘤核型鑒定：NS0染色體數(shù)目為62～68條，小鼠脾細(xì)胞染色體數(shù)目為40條，本試驗(yàn)獲得的4株雜交瘤染色體數(shù)目分別為98.3條、99.32條、98.1條、102條，平均99.4條，高于兩個(gè)親本的染色體數(shù)目，說明4株雜交瘤確實(shí)是兩親本細(xì)胞融合后的雜交體。雜交瘤細(xì)胞的穩(wěn)定性測定結(jié)果：4株雜交瘤凍存前細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)與凍存15d、30d、60d復(fù)蘇培養(yǎng)后上清效價(jià)基本一致，說明4株雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的穩(wěn)定性良好。

3.Mo6＋－EDTA－mAb的免疫學(xué)特性鑒定效價(jià)測定篩選出4株雜交瘤細(xì)胞，其中4B3株抗體效價(jià)最高，細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)為1∶（3.6×102），腹水效價(jià)為1∶（5.12×105）。敏感性測定敏感性結(jié)果見表1，4株雜交瘤細(xì)胞株抑制曲線。4株雜交瘤細(xì)胞株均獲得較好的敏感性。4株雜交瘤細(xì)胞的Mo6＋－EDTA－mAb對Mo6＋－EDTA均具有較高的敏感性；其中4B3細(xì)胞株的敏感性最高。特異性鑒定4B3雜交瘤細(xì)胞的mAb的交叉反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果可知，4B3雜交瘤細(xì)胞的mAb對Mo6＋－EDTA的IC50為23.4μg／L，對Cr3＋－EDTA的IC50為28.59μg／L，具有較高交叉反應(yīng)率；與其他金屬離子螯合物交叉反應(yīng)性較低可忽略不計(jì)。

二、討論

1.Mo6＋－EDTA－pAb的免疫學(xué)特性鑒定抗體的免疫學(xué)特性主要表達(dá)于抗原抗體反應(yīng)的結(jié)合容量、親和性和選擇性3個(gè)方面。結(jié)合容量大小以效價(jià)來衡量，本試驗(yàn)采用間接ELISA測定其效價(jià)，免疫動物后均獲得較高的效價(jià)，效價(jià)最高到達(dá)1∶（5.12×104）。由于pAb為異源性抗體，其親和性不均一，測得Ka值的準(zhǔn)確性不高，所以本試驗(yàn)親和性得檢測用敏感度來衡量，敏感度是由抗原抗體反應(yīng)的親和性決定的，用IC50值計(jì)算靈敏度，代表標(biāo)準(zhǔn)品對抗原抗體結(jié)合50％是的抑制質(zhì)量濃度，IC50值越小，靈敏度越高。本試驗(yàn)中2號鼠產(chǎn)生的pAb的IC50值為37.94μg／L，在免疫鼠中最低，親和性最好。本研究采用交叉反應(yīng)試驗(yàn)鑒定其特異性，結(jié)果說明免疫鼠產(chǎn)生的Mo6＋－EDTApAb均具有較高的特異性。

2.雜交瘤細(xì)胞株的篩選方法制備高質(zhì)量的mAb需要建立可靠的雜交瘤細(xì)胞篩選體系，一般有3條要求，一是準(zhǔn)確測定上清效價(jià)，二是能夠防止橋抗體的產(chǎn)生，三是確定mAb的特異性。本試驗(yàn)同時(shí)采用間接ELISA和阻斷ELISA篩選陽性雜交瘤，以Mo6＋－ITCBE－OVA作為包被原采用間接ELISA法測定上清效價(jià)，Mo6＋－EDTA作為標(biāo)準(zhǔn)品采用阻斷ELISA法確定陽性雜交瘤，可以簡便地篩選出效價(jià)高、無橋抗體、特異性強(qiáng)的Mo6＋螯合物雜交瘤細(xì)胞株。本試驗(yàn)所制備Mo6＋－EDTA－mAb為高親和力抗體。

3.關(guān)于交叉反應(yīng)性mAb的交叉反應(yīng)性表示mAb與競爭物結(jié)合的構(gòu)造特異性，是揭露參與反應(yīng)混合物與其交叉結(jié)合的重要化學(xué)參數(shù)。本試驗(yàn)所制備的Mo6＋－EDTAmAb除與Cr3＋－EDTA有較強(qiáng)的交叉反應(yīng)性外，與其他金屬螯合物和EDTA無交叉反應(yīng)；KhosravianiM等建立的水樣中Cd2＋間接競爭ELISA檢測方法，也與Hg2＋具有較強(qiáng)的交叉反應(yīng)；王建華等所建立的鉬離子多克隆抗體ELISA競爭法，也表現(xiàn)出與汞離子有較強(qiáng)的交叉反應(yīng)。JonesRB等采用距離矩陣法（distancematrix，DM）比較不同金屬－螯合劑復(fù)合物分子三維構(gòu)造的差異，發(fā)現(xiàn)Cd2＋－EDTA與Hg2＋－EDTA的三維構(gòu)造差異最小，認(rèn)為這可能是抗體對Hg2＋產(chǎn)生交叉反應(yīng)的主要原因。LoveRA等認(rèn)為，螯合劑與金屬離子通過化學(xué)鍵結(jié)合而使螯合劑的構(gòu)型發(fā)生改變，螯合劑結(jié)合不同金屬離子具有不同的構(gòu)型，螯合劑的構(gòu)型是決定抗原抗體識別