HLA檢測技術(shù)及其應(yīng)用課件

HLA檢測技術(shù)及其應(yīng)用HLA檢測技術(shù)及其應(yīng)用1內(nèi)容血型HLA概念檢測方法HLA的應(yīng)用HLA與臨床輸血內(nèi)容血型2血型種類及其遺傳基礎(chǔ)血型：血液中各種成分的遺傳（表現(xiàn)）多態(tài)性標(biāo)志血液成分：紅細(xì)胞，白細(xì)胞，血小板，血清蛋白遺傳多態(tài)性表現(xiàn)：細(xì)胞表面，血漿中的各種特異性蛋白多態(tài)性的遺傳基礎(chǔ)：基因（染色體上的核酸序列）血型種類及其遺傳基礎(chǔ)血型：血液中各種成分的遺傳（表現(xiàn)）多態(tài)性3血型的發(fā)現(xiàn)輸血治療的需要促使“血型”發(fā)現(xiàn)15世紀(jì)后期開始輸血1900年Landsteiner發(fā)現(xiàn)人類紅細(xì)胞ABO血型1927年發(fā)現(xiàn)MN血型系統(tǒng)1940年發(fā)現(xiàn)Rh血型HLA1958年法國J.多賽發(fā)現(xiàn)血型的發(fā)現(xiàn)輸血治療的需要促使“血型”發(fā)現(xiàn)4LandsteinerLandsteiner5血型的檢測方法免疫血液學(xué)方法：抗原、抗體檢測方法

凝集實驗：試管法、凝膠柱法、固相吸附、

流式技術(shù)細(xì)胞生物學(xué)檢測方法：混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)分子生物學(xué)檢測方法：血型基因檢測SSP、SSO、SBT

血型的檢測方法免疫血液學(xué)方法：抗原、抗體檢測方法6HLA概念人類白細(xì)胞抗原，白細(xì)胞表面的一種糖蛋白，有非常復(fù)雜的生物學(xué)功能，非常復(fù)雜的多態(tài)性廣范存在于除白細(xì)胞表面的其他組織、體液中，與組織相容性有關(guān)，又稱為組織相容性抗原HLA概念人類白細(xì)胞抗原，白細(xì)胞表面的一種糖蛋白，有非常復(fù)雜7HLA概念:HLA分子結(jié)構(gòu)HLA-I類分子HLA-II類分子HLA概念:HLA分子結(jié)構(gòu)HLA-I類分子HLA-II類分8HLA的生物學(xué)功能參與內(nèi)外抗原肽的處理，呈遞．

自我識別的信號某些病毒，細(xì)菌進入細(xì)胞的受體與某些疾病的發(fā)病有關(guān),如：B27與強直

性脊柱炎（AS）HLA的生物學(xué)功能參與內(nèi)外抗原肽的處理，呈遞．9HLA功能HLA功能10（二）HLA復(fù)合體的遺傳特征

1.單元型遺傳

2.多態(tài)性現(xiàn)象（1）復(fù)等位基因（2）共顯性表達(dá)

3.連鎖不平衡

（二）HLA復(fù)合體的遺傳特征11HLA概念:HLA基因結(jié)構(gòu)（6p21,3）HLA概念:HLA基因結(jié)構(gòu)（6p21,3）12已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的HLA種類、數(shù)量已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的HLA種類、數(shù)量13HLA-Ⅰ類分子的分布

1.存在于有核細(xì)胞(含血小板和網(wǎng)織紅細(xì)胞)表面。淋巴細(xì)胞>腎、肝臟、心臟>神經(jīng)組織、成熟的滋養(yǎng)細(xì)胞

2.存在形式（1）膜結(jié)合：有核細(xì)胞表面（2）可溶性：存在于血清、初乳和尿液等體液中。

HLA-Ⅰ類分子的分布14

HLA-Ⅱ類分子的分布

1.APCB細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞；

2.其他激活的T細(xì)胞，精子和血管內(nèi)皮細(xì)胞。

HLA-Ⅱ類分子的分布15血清學(xué)細(xì)胞學(xué)分子生物學(xué)實驗方法補體介導(dǎo)的微量細(xì)胞毒試驗混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)法（MLC)分子生物學(xué)技術(shù)原理抗體(HLA分型)+淋巴細(xì)胞(受者)+補體淋巴細(xì)胞受損判定結(jié)果（細(xì)胞死亡百分率）單向法雙向法比較供、受者編碼HLA抗原基因的DNA序列，判定供、受者間的相似程度。主要應(yīng)用檢測HLA-A、B、C抗原檢測DR抗原

HLA分型法原理及應(yīng)用血清學(xué)細(xì)胞學(xué)分子生物學(xué)實驗方法補體介導(dǎo)的微量細(xì)胞毒試驗混合淋16HLA的檢測方法TERASAKI發(fā)明的微量淋巴細(xì)胞毒實驗:當(dāng)特異性抗體與HLA抗原結(jié)合，激活補體，使淋巴細(xì)胞溶解，顯微鏡下可見到被活性染料著色的淋巴細(xì)胞用于HLA-I類抗原分型HLA的檢測方法TERASAKI發(fā)明的微量淋巴細(xì)胞毒實驗:17HLA檢測方法（分子生物學(xué)）基于PCR技術(shù)的分型方法PCR-SSP方法操作簡單、靈活適合少量樣本臨床病例分型檢測通量較小HLA檢測方法（分子生物學(xué)）基于PCR技術(shù)的分型方法18PCR-SSP方法PCR-SSP方法19HLA檢測方法（分子生物學(xué)）PCR-SSO（序列特異性寡核苷酸探針）雜交條方法基因芯片方法流式熒光微珠HLA檢測方法（分子生物學(xué)）PCR-SSO（序列特異性寡核苷20芯片的工作原理將HLA基因的PCR產(chǎn)物固定在基片上熒光標(biāo)記的序列特異性探針雜交探針1探針2探針3探針n…......雜交圖譜匯總每條探針數(shù)據(jù)得到所有樣品的分型結(jié)果由計算機自動判讀分型結(jié)果芯片的工作原理將HLA基因的PCR產(chǎn)物固定在基片上熒光標(biāo)記的21PCR-SSO流式微珠分型PCR-SSO流式微珠分型22SBT（DNA測序分型）SBT（DNA測序分型）23HLA檢測技術(shù)及其應(yīng)用課件24幾種常用HLA分型方法比較HLA分型方法比較項目

PCR-SSPPCR-SSO雜交條

PCR-SSO微珠法PCR-SSO芯片法

DNA測序方法技術(shù)要求

低

低

較高

高

高

分辨率

中低

中低

中高

中高

高檢測通量

低

一般

較高

高

較高使用設(shè)備

少

少

較多

多

較多環(huán)境污染

EB致癌

輕微

輕微

輕微

輕操作步驟

簡單

簡單

較復(fù)雜

復(fù)雜

較復(fù)雜檢測成本

低

低

較高

高

較高適用范圍臨床或小批量

臨床、較大批量

中、大批量

大批量

臨床、各種批量應(yīng)用情況

國內(nèi)臨床

國內(nèi)臨床

骨髓庫

國家芯片中心

國外常規(guī)采用幾種常用HLA分型方法比較25HLA分型方法的發(fā)展趨勢高準(zhǔn)確性：血清學(xué)-----分子生物學(xué)高通量：SSP-------基因芯片、流式高分辨：低分辨-------中分辨--------高分辨氨基酸殘基配型：血型學(xué)-----基因------AA殘基

（表位）HLA分型方法的發(fā)展趨勢高準(zhǔn)確性：血清學(xué)-----分子生物學(xué)26HLA的應(yīng)用免疫應(yīng)答，T細(xì)胞分化器官移植與疾病關(guān)聯(lián)腫瘤關(guān)聯(lián)法醫(yī)、個體識別、人類學(xué)研究HLA的應(yīng)用免疫應(yīng)答，T細(xì)胞分化27免疫應(yīng)答免疫應(yīng)答28HLA檢測技術(shù)及其應(yīng)用課件29HLA與器官移植、臨床輸血骨髓移植（造血干細(xì)胞移植）腎移植血小板輸注其他血液成分輸血HLA與器官移植、臨床輸血骨髓移植（造血干細(xì)胞移植）30HLA與疾病HLA與疾病31HLA與腫瘤惡性腫瘤細(xì)胞HLA-Ⅰ類分子表達(dá)減少或缺乏，腫瘤細(xì)胞逃逸免疫監(jiān)視。

IFN-

促進腫瘤細(xì)胞HLA-Ⅰ類分子表達(dá)增強CD8+CTL細(xì)胞的特異性殺傷。HLA與腫瘤惡性腫瘤細(xì)胞HLA-Ⅰ類分子表達(dá)減少或缺乏，32法醫(yī)、個體識別、人類學(xué)研究HLA可以作為親子鑒定的一個指標(biāo)刑偵研究種族人群的遷徙法醫(yī)、個體識別、人類學(xué)研究HLA可以作為親子鑒定的一個指標(biāo)33HLA與臨床輸血溶血性輸血反應(yīng)，臨床少見發(fā)熱反應(yīng)，70%發(fā)熱反應(yīng)是由HLA抗體引起血小板輸注無效，首要因素是HLA抗體過敏反應(yīng)，與HLA抗體有關(guān)GVHDTRALIHLA與臨床輸血溶血性輸血反應(yīng)，臨床少見34HLA檢測技術(shù)及其應(yīng)用HLA檢測技術(shù)及其應(yīng)用35內(nèi)容血型HLA概念檢測方法HLA的應(yīng)用HLA與臨床輸血內(nèi)容血型36血型種類及其遺傳基礎(chǔ)血型：血液中各種成分的遺傳（表現(xiàn)）多態(tài)性標(biāo)志血液成分：紅細(xì)胞，白細(xì)胞，血小板，血清蛋白遺傳多態(tài)性表現(xiàn)：細(xì)胞表面，血漿中的各種特異性蛋白多態(tài)性的遺傳基礎(chǔ)：基因（染色體上的核酸序列）血型種類及其遺傳基礎(chǔ)血型：血液中各種成分的遺傳（表現(xiàn)）多態(tài)性37血型的發(fā)現(xiàn)輸血治療的需要促使“血型”發(fā)現(xiàn)15世紀(jì)后期開始輸血1900年Landsteiner發(fā)現(xiàn)人類紅細(xì)胞ABO血型1927年發(fā)現(xiàn)MN血型系統(tǒng)1940年發(fā)現(xiàn)Rh血型HLA1958年法國J.多賽發(fā)現(xiàn)血型的發(fā)現(xiàn)輸血治療的需要促使“血型”發(fā)現(xiàn)38LandsteinerLandsteiner39血型的檢測方法免疫血液學(xué)方法：抗原、抗體檢測方法

凝集實驗：試管法、凝膠柱法、固相吸附、

流式技術(shù)細(xì)胞生物學(xué)檢測方法：混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)分子生物學(xué)檢測方法：血型基因檢測SSP、SSO、SBT

血型的檢測方法免疫血液學(xué)方法：抗原、抗體檢測方法40HLA概念人類白細(xì)胞抗原，白細(xì)胞表面的一種糖蛋白，有非常復(fù)雜的生物學(xué)功能，非常復(fù)雜的多態(tài)性廣范存在于除白細(xì)胞表面的其他組織、體液中，與組織相容性有關(guān)，又稱為組織相容性抗原HLA概念人類白細(xì)胞抗原，白細(xì)胞表面的一種糖蛋白，有非常復(fù)雜41HLA概念:HLA分子結(jié)構(gòu)HLA-I類分子HLA-II類分子HLA概念:HLA分子結(jié)構(gòu)HLA-I類分子HLA-II類分42HLA的生物學(xué)功能參與內(nèi)外抗原肽的處理，呈遞．

自我識別的信號某些病毒，細(xì)菌進入細(xì)胞的受體與某些疾病的發(fā)病有關(guān),如：B27與強直

性脊柱炎（AS）HLA的生物學(xué)功能參與內(nèi)外抗原肽的處理，呈遞．43HLA功能HLA功能44（二）HLA復(fù)合體的遺傳特征

1.單元型遺傳

2.多態(tài)性現(xiàn)象（1）復(fù)等位基因（2）共顯性表達(dá)

3.連鎖不平衡

（二）HLA復(fù)合體的遺傳特征45HLA概念:HLA基因結(jié)構(gòu)（6p21,3）HLA概念:HLA基因結(jié)構(gòu)（6p21,3）46已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的HLA種類、數(shù)量已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的HLA種類、數(shù)量47HLA-Ⅰ類分子的分布

1.存在于有核細(xì)胞(含血小板和網(wǎng)織紅細(xì)胞)表面。淋巴細(xì)胞>腎、肝臟、心臟>神經(jīng)組織、成熟的滋養(yǎng)細(xì)胞

2.存在形式（1）膜結(jié)合：有核細(xì)胞表面（2）可溶性：存在于血清、初乳和尿液等體液中。

HLA-Ⅰ類分子的分布48

HLA-Ⅱ類分子的分布

1.APCB細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞；

2.其他激活的T細(xì)胞，精子和血管內(nèi)皮細(xì)胞。

HLA-Ⅱ類分子的分布49血清學(xué)細(xì)胞學(xué)分子生物學(xué)實驗方法補體介導(dǎo)的微量細(xì)胞毒試驗混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)法（MLC)分子生物學(xué)技術(shù)原理抗體(HLA分型)+淋巴細(xì)胞(受者)+補體淋巴細(xì)胞受損判定結(jié)果（細(xì)胞死亡百分率）單向法雙向法比較供、受者編碼HLA抗原基因的DNA序列，判定供、受者間的相似程度。主要應(yīng)用檢測HLA-A、B、C抗原檢測DR抗原

HLA分型法原理及應(yīng)用血清學(xué)細(xì)胞學(xué)分子生物學(xué)實驗方法補體介導(dǎo)的微量細(xì)胞毒試驗混合淋50HLA的檢測方法TERASAKI發(fā)明的微量淋巴細(xì)胞毒實驗:當(dāng)特異性抗體與HLA抗原結(jié)合，激活補體，使淋巴細(xì)胞溶解，顯微鏡下可見到被活性染料著色的淋巴細(xì)胞用于HLA-I類抗原分型HLA的檢測方法TERASAKI發(fā)明的微量淋巴細(xì)胞毒實驗:51HLA檢測方法（分子生物學(xué)）基于PCR技術(shù)的分型方法PCR-SSP方法操作簡單、靈活適合少量樣本臨床病例分型檢測通量較小HLA檢測方法（分子生物學(xué)）基于PCR技術(shù)的分型方法52PCR-SSP方法PCR-SSP方法53HLA檢測方法（分子生物學(xué)）PCR-SSO（序列特異性寡核苷酸探針）雜交條方法基因芯片方法流式熒光微珠HLA檢測方法（分子生物學(xué)）PCR-SSO（序列特異性寡核苷54芯片的工作原理將HLA基因的PCR產(chǎn)物固定在基片上熒光標(biāo)記的序列特異性探針雜交探針1探針2探針3探針n…......雜交圖譜匯總每條探針數(shù)據(jù)得到所有樣品的分型結(jié)果由計算機自動判讀分型結(jié)果芯片的工作原理將HLA基因的PCR產(chǎn)物固定在基片上熒光標(biāo)記的55PCR-SSO流式微珠分型PCR-SSO流式微珠分型56SBT（DNA測序分型）SBT（DNA測序分型）57HLA檢測技術(shù)及其應(yīng)用課件58幾種常用HLA分型方法比較HLA分型方法比較項目

PCR-SSPPCR-SSO雜交條

PCR-SSO微珠法PCR-SSO芯片法

DNA測序方法技術(shù)要求

低

低

較高

高

高

分辨率

中低

中低

中高

中高

高檢測通量

低

一般

較高

高

較高使用設(shè)備

少

少

較多

多

較多環(huán)境污染

EB致癌

輕微

輕微

輕微

輕操作步驟

簡單

簡單

較復(fù)雜

復(fù)雜

較復(fù)雜檢測成本

低

低

較高

高

較高適用范圍臨床或小批量

臨床、較大批量

中、大批量

大批量

臨床、各種批量應(yīng)用情況