15第十五章核酸的研究方法

第十五章核酸的研究方法生物化學(xué)一、DNA的分離二、RNA的分離三、核酸含量的測定法第一節(jié)核酸的分離、提純和定量測定核酸制備的原則防止核酸的降解和變性采用溫和的條件，防止過酸、過堿、避免劇烈攪拌，尤其重要的是防止核酸酶的作用。一、DNA的分離真核生物細(xì)胞中的染色體DNA與堿性的組蛋白結(jié)合在一起，成為核蛋白（DNP），DNP溶于高鹽溶液（1mol/LNaCl），但不溶于低鹽溶液（0.14mol/LNaCl）。利用這一性質(zhì)，可將細(xì)胞破碎后用濃鹽溶液提取，低鹽沉淀，使DNP纖維沉淀出來。用玻璃棒將DNP纖維纏繞在棒上，再經(jīng)多次溶解和沉淀以純化DNP。二、RNA的分離分離RNA時要特別注意防止RNase對RNA的降解。RNase無處不在，且耐高溫，不易滅活。制備RNA通常需要注意3點：①所有用于制備RNA的玻璃器皿都要經(jīng)過高溫焙烤，塑料用具經(jīng)過高壓滅菌，不能高壓滅菌的用具要用0.1％焦碳酸二乙酯(DEPC)處理，再煮沸以除凈DEPC。DEPC能使蛋白質(zhì)乙基化而破壞RNase活性。②在破碎細(xì)胞的同時加入強(qiáng)變性劑(如胍鹽)使RNase失活。③在RNA的反應(yīng)體系內(nèi)加入RNase的抑制劑(如RNasin)。三、核酸含量的測定法紫外分光光度法（260nm）定磷法（鉬藍(lán)比色法）

先用濃硫酸或過氯酸將有機(jī)磷水解成無機(jī)磷。在酸性條件下正磷酸與鉬酸作用生成磷鉬酸，在還原劑存在下被還原成鉬藍(lán)（660nm），從磷的標(biāo)準(zhǔn)曲線可知樣品中磷的含量，從而求出核酸的含量。當(dāng)RNA與鹽酸共熱時核糖轉(zhuǎn)變?yōu)榭啡?，它與甲基苯二酚(地衣酚)反應(yīng)呈鮮綠色（670nm)DNA在酸性溶液中與二苯胺共熱，其脫氧核糖可參與反應(yīng)生成藍(lán)色化合物，最大吸收峰在595nm處定糖法第三節(jié)核酸的凝膠電泳一、瓊脂糖凝膠電泳二、聚丙烯酰胺凝膠電泳瓊脂糖

一種線性多糖聚合物，從紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取而來。一、瓊脂糖凝膠電泳

以瓊脂糖凝膠為支持物時，DNA電泳的遷移率決定于以下因素：（1）核酸分子的大小。遷移率與分子量的對數(shù)成反比。（2）膠濃度。膠濃度大則網(wǎng)孔小，核酸的遷移率變小。（3）DNA的構(gòu)象。超螺旋的DNA遷移率>線性DNA>開環(huán)DNA

但凝膠中的溴乙錠濃度對此有影響。EB是扁平分子，能插入DNA堿基之間，但不與瓊脂糖結(jié)合。EB在300nm紫外光照射下能發(fā)紅-橙色熒光，即可顯示DNA泳帶在凝膠中所處的位置。熒光強(qiáng)度與DNA含量及大小成正比。

電泳后將膠浸泡在溴乙錠溶液中染色，紫外光照射下觀察電泳結(jié)果。也可在制膠時就加入溴乙錠，這樣可以在電泳過程中用紫外燈照射，觀察電泳的進(jìn)程。扁平狀染料與DNA的結(jié)合吖啶橙溴（化）乙啶

1ngDNA條帶可顯示第五節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）PCR：是一種利用DNA變性和復(fù)性原理在體外進(jìn)行特定的DNA片斷高效擴(kuò)增的技術(shù)。1985年，美國PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制最初采用E-coliDNA聚合酶進(jìn)行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時，費力，且易出錯耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進(jìn)行1989年美國《Science》雜志列PCR為十余項重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎。原理：1DNA變性，兩條鏈解開

2引物模板退火，二者堿基配對

3DNA聚合酶隨即以4種dNTP為底物，在

引物的引導(dǎo)下合成與模板互補(bǔ)的DNA新鏈

4重復(fù)此過程，DNA以指數(shù)方式擴(kuò)增PCR

PCR動畫1stcycle2ndcycle3rdcycle過程變性引物退火延伸1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍Juang

RH

(2004)

BCbasicsCAGGTCCAGCAGGCCCAGGCC+

polymerase+

primerreplicationCGGGCCMutantThrtranslation定點突變

Wild

typeCAGGTCValtranslationWild

type

proteinMutant

protein(1)

(2)primer(3)(5)(4)(6)突變只改變了一個氨基酸

Val

→

ThrSmith

(1993)基本步驟：設(shè)計一對引物優(yōu)化反應(yīng)體系：模板、引物、4種dNTP，耐熱DNA聚合酶、Mg2+選擇3個溫度進(jìn)行熱循環(huán)(25~30個周期)：

變性94℃

退火45~60℃

延伸(1min)，循環(huán)25~30個周期，最后延伸10min應(yīng)用電泳技術(shù)，檢測擴(kuò)增結(jié)果.標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系4種dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA

0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+

1.5mmol/L10×擴(kuò)增緩沖液

PCR反應(yīng)五要素：引物、酶、dNTP、模板和Mg2+PCR的特點靈敏度高皮克(pg=10-12)量級擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平能從100萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞病毒檢測的靈敏度可達(dá)3個RFU細(xì)菌檢測的最小檢出率為3個細(xì)菌簡便、快速一次性加好反應(yīng)液，2～4小時完成擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析對標(biāo)本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提DNAPCR瓊脂糖凝膠電泳最終產(chǎn)物紫外光觀察3-4小時PCR技術(shù)的應(yīng)用用于合成特異探針；用于DNA的測序；將逆轉(zhuǎn)錄與PCR相偶聯(lián)（RT-PCR）；

用于基因定位誘變；末知序列的PCR擴(kuò)增；基因組序列的比較研究；

用于臨床診斷（遺傳病，癌基因的檢查等）。生物學(xué)領(lǐng)域幾乎無處不用基因、DNA片段的克隆人工基因構(gòu)建DNA序列測定基因定點突變基因型（突變）檢測，SNP分析，遺傳背景分析生物物種鑒定，系統(tǒng)進(jìn)化研究基因表達(dá)量研究（real-timePCR）/基因表達(dá)譜研究（DNAchip,SAGE）醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用疾病基因