第六章外源性化學物的一般毒性作用

第六章外源性化學物的一般毒性作用第1頁，共53頁。一般毒作用（generaltoxicity）：指外源化學物在一定的劑量范圍內(nèi)，經(jīng)一定的接觸時間按照一定的接觸方式，對生物有機體產(chǎn)生的綜合毒性效應(yīng)。又稱為基本毒性（basictoxicity）。根據(jù)接觸毒物的時間長短可分為：急性毒性、亞慢性毒性和慢性毒性。相應(yīng)的試驗稱為急性毒性試驗、亞慢性毒性試驗和慢性毒性試驗。第2頁，共53頁。一般毒性測試污染物理化特性毒性大小和特征蓄積和耐受特性了解靶部位和指標確定閾和閾下劑量急性毒性試驗亞急性毒性試驗亞慢性毒性試驗慢性毒性試驗蓄積毒性試驗（≤3個月）（3—6個月）（6個月到終身）急性致死試驗非急性致死試驗外源化學物一般毒性試驗項目第3頁，共53頁。第一節(jié)急性毒性作用及其實驗與評價方法一、基本概念急性毒性（acutetoxicity）——是指機體一次接觸或24小時內(nèi)多次接觸外源化學物之后所引起的快速劇烈的毒效應(yīng)。包括一般行為、外觀及形態(tài)改變，甚至死亡。急性毒性試驗（acutetest）——是指一次給予或24小時內(nèi)多次給予受試物后，短時間內(nèi)動物所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)。第4頁，共53頁。二、急性毒性試驗?zāi)康?、確定LD50，根據(jù)LD50值進行急性毒性分級。2、闡明外源化學物相對毒性、作用方式和特殊毒性表現(xiàn)，得到劑量-效應(yīng)（反應(yīng)）關(guān)系曲線，了解其臨床癥狀、生理生化、病理改變及可能的靶器官。3、確定外源化學物入侵機體的途徑，研究其在機體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)運、轉(zhuǎn)化過程。4、研究受試物急性中毒的預防和急救治療措施。第5頁，共53頁。三、急性毒性試驗方法（一）實驗動物的選擇和要求1、動物種屬選擇選擇對化學物毒性反應(yīng)與人相似的動物，要求試驗操作方便、易于飼養(yǎng)管理、易于獲得且價格低廉的動物。一般選擇兩種或兩種以上的試驗動物，最好一種為嚙齒動物，另一種為非嚙齒類動物，分別求出其急性毒性參數(shù)。第6頁，共53頁。2、動物品系、性別及年齡的選擇為了避免試驗結(jié)果存在品系差異，最好選擇純種動物。性別選擇以試驗?zāi)康亩?。年齡一般選用初成年動物。大鼠180～240g小鼠18～25g、家兔2～2.5kg、豚鼠200～250g、狗10～15kg。第7頁，共53頁。實驗動物應(yīng)進行檢疫，檢疫期一般為5～7天，剔除異常的動物。染毒途徑應(yīng)模擬人可能的接觸途徑。經(jīng)口灌胃染毒，要求試驗前要對動物禁食。大鼠應(yīng)過夜禁食，小鼠應(yīng)禁食4小時。第8頁，共53頁。3、各劑量組動物數(shù)及實驗動物分組急性毒性試驗中每個劑量組的動物數(shù)，小鼠不少于10只，大鼠6～8只，家兔4～6只。實驗動物分組采用隨機分組。第9頁，共53頁。4、實驗動物喂養(yǎng)環(huán)境試驗動物喂養(yǎng)室室溫控制在（22±3）℃，家兔可控制在（20±3）℃，無賊風。每籠動物數(shù)以不干擾動物個體活動及不影響試驗觀察為度，必要時單籠喂養(yǎng)。人工晝夜——早6點至晚6點進行12小時光照，其余時間黑暗，常規(guī)飼料，自由飲水。第10頁，共53頁。2、實驗動物染毒方法（1）經(jīng)口（胃腸道）接觸灌胃飼喂吞咽膠囊（2）經(jīng)呼吸道接觸：靜式、動式（3）經(jīng)皮膚接觸（4）經(jīng)注射途徑染毒第11頁，共53頁。3、劑量組及劑量分組通過預試驗測定受試物LD100和LD0的范圍，才能正確地設(shè)計正式試驗各組的劑量。第12頁，共53頁。（1）預實驗的劑量設(shè)計等比劑量設(shè)計：r=4，組距=lg4=0.6目的：得到死亡率在10%~90%的致死劑量范圍3X3法：r=10序貫法：設(shè)計一系列等比劑量，將動物一只一只序貫進行第13頁，共53頁。求LD100和LD0的范圍方法如下：小白鼠隨機分成3～4組，每組3只，各劑量組分別是1、10、100、1000mg/kg，灌胃或腹腔注射染毒。若某組死亡率為3/3，其前一組死亡率為2/3或1/3，則該組劑量就是100%致死劑量。同樣的方法找出LD0

。如果死亡率沒有獲得上述的理想劑量范圍，則可依據(jù)實際情況將劑量提高或降低一個數(shù)量級繼續(xù)進行預試驗，直至找出符合要求的最高和最低劑量范圍為止。正式試驗按等比級數(shù)（1.2～1.5）在最高和最低劑量范圍內(nèi)插上3～5個劑量組進行試驗。第14頁，共53頁。（2）正式試驗的劑量設(shè)計計算組距或公比：第15頁，共53頁。γ:：各組公比數(shù)n：劑量組數(shù)a：最低致死量b：最高致死量第16頁，共53頁。logLD50=Xm－d(Σp－0.5)Xm：最大劑量的對數(shù)d：相鄰劑量比值的對數(shù)Σp：各組死亡率總和第17頁，共53頁。例如——每組各小白鼠給予同一種劑量，灌胃染毒，劑量范圍大約400～800mg/kg。以各組公比數(shù)計算每組染毒的劑量a=400mg/Kgaγ=400×1.2=480mg/Kgaγ2=400×1.22=576mg/Kgaγ3=400×1.23=691mg/Kgaγ4=400×1.24=829.44mg/Kg以此劑量作用于小白鼠，得出結(jié)果如下：第18頁，共53頁。組別劑量mg/Kg動物數(shù)死亡數(shù)死亡率p存活率q140010001.024801020.20.835761050.50.54691.21070.70.35829.4410101.00第19頁，共53頁。計算logLD50=Xm－d(Σp－0.5)Xm：最大劑量的對數(shù)d：相鄰劑量比值的對數(shù)Σp：各組死亡率總和Xm=log829.44=2.9188d=log1.2=0.0792Σp=0+0.2+0.588+0.7+1.0=2.4代入公式：logLD50=2.9188－0.0792×（2.4－0.5）=2.76832查反對數(shù)得出LD50=log-12.76832=586.57mg/Kg求logLD50標準誤“S”第20頁，共53頁。LD50的95%可信限=log-1(logLD50±1.96×SlogLD50)=log-1(2.76832±1.96×0.0197)=536.6857－567.0318第21頁，共53頁。劑量組的設(shè)置應(yīng)依據(jù)預試驗結(jié)果而定，一般最高最低兩劑量組間差別較大者，則組數(shù)即每組動物數(shù)應(yīng)較多。最高最低劑量相差2～4倍，至少設(shè)3～4組；相差4～9倍者，至少應(yīng)設(shè)4～5組；相差10倍以上者，至少應(yīng)設(shè)6個組。通常最高最低劑量相差多在10倍以內(nèi)，以設(shè)置5-7組為宜。第22頁，共53頁。（六）試驗周期急性毒性試驗除了計算受試物LD50外，還需要通過觀察實驗動物的中毒癥狀判斷受試物的毒作用性質(zhì)，推斷中毒的靶器官。試驗周期以2周為宜。第23頁，共53頁。（七）觀察指標

1、LD502、癥狀觀察

3、病理學檢查

4、其他指標觀察死亡與死亡時間體重變化第24頁，共53頁。四、急性毒性的分級與評價為評價外源化學物急性毒性的強弱及對人類的潛在危害程度，國際上提出了外源化學物的急性毒性分級標準用以對急性毒性進行評價。第25頁，共53頁。我國食品毒理學中外源化學物經(jīng)口毒性分級級別大鼠口服LD50mg/Kg相當于人的致死量相當于體重70Kg人致死劑量mg/Kg克/人6級，極毒＜1稍嘗0.05稍嘗，＜7滴5級，劇毒1～50500～40000.57滴至1茶匙4級，中等毒51～5004000～3000051茶匙至35克3級，低毒501～500030000～2500005035～350克2級，實際無毒5001500000500350～1050克1級，無毒＞15000＞5000002500＞1050克（引自《食品安全性毒理學評價程序和方法》，GB15193.1～15193.19-94）第26頁，共53頁。外源化學物急性毒性分級(WHO)毒性分級大鼠一次經(jīng)口LD50(mg/kg)6只大鼠吸入4小時死亡2～4只的濃度(ppm)(mg/kg)兔經(jīng)皮LD50(mg/kg)對人可能致死劑量g/kg(g/60kg)劇毒＜1＜10＜5＜0.050.1高毒1～10～5～0.05～3中等毒50～100～44～0.5～30低毒500～1000～350～5～250微毒5000～10000～2180～＞15＞1000第27頁，共53頁。結(jié)果判定：1.LD50或7天喂養(yǎng)試驗最小有作用量小于人的可能攝入量的10倍者，則放棄該受試物用于食品，不再繼續(xù)其他毒理學試驗。2.如大于10倍，可進入下階段試驗，為慎重起見，試驗應(yīng)進行重復試驗，或用另一種方法進行驗證。第28頁，共53頁。第二節(jié)蓄積毒性作用及其評價蓄積作用（accumulation）若一種外源化學物反復多次進入機體而且其前次進入劑量尚未完全消除，則這一化學物在體內(nèi)的總量將不斷增加并貯留，此現(xiàn)象稱化學物的蓄積作用。蓄積性的存在，無論是物質(zhì)蓄積還是功能蓄積，都是長期接觸毒物發(fā)生慢性毒作用的重要條件。因此：理論上應(yīng)從蓄積試驗作為前提條件，以決定是否還需要進一步做慢性毒性蓄積試驗。一、基本概念第29頁，共53頁。二、蓄積毒性試驗方法及其評價蓄積毒性試驗是檢測化學物蓄積性大小的試驗，并可為慢性毒性試驗做準備。常用的試驗方法有蓄積系數(shù)法及生物半衰期法。第30頁，共53頁。（一）蓄積系數(shù)法蓄積系數(shù)(K)是指多次染毒使半數(shù)動物出現(xiàn)效應(yīng)的總劑量(ED50（n）)與1次染毒的半效量(ED50（1）)之比值，即：試驗常以死亡為觀察的效應(yīng)，此時：第31頁，共53頁。如果受試物在體內(nèi)物質(zhì)蓄積或功能蓄積是完全的，則多次給予的總劑量與一次給予同等劑量的毒性相當，此時ED50（n）=ED50（1），即：K=1。若蓄積不完全則毒效應(yīng)程度上有差別，一般根據(jù)K對蓄積性進行估計。K＜1：高度蓄積；1≤K＜3：明顯蓄積；3≤K＜5：中等蓄積；K≥5：輕度蓄積。K越大，蓄積毒性越弱。反之亦然。第32頁，共53頁。1、固定劑量法固定劑量法為Kagan和Stankevic(1964)提出，它采用先測出1次染毒的LD50(即為LD50(1))，然后對另一組動物每天給予l/10LD50(偶爾有用1/20LD50)直至半數(shù)動物死亡為止，此時的總劑量即為LD50

(n)。如果到第50天死亡動物仍末達半數(shù)，則停止試驗，因為此時總劑量已達5個LD50(指每天l/10LD50(1))時表示僅有輕度蓄積作用。第33頁，共53頁。2、遞增劑量法遞增劑量法為Lim等(1961)提出，它也是先測定LD50(1)，然后用另一組動物測定LD50

(n)

。其染毒以4天為1個周期，在同一周期中，每天劑量相同，下一周期劑量為上一周期劑量的1.5倍，第一周期每天為0.1LD50(1)，直至半數(shù)動物死亡為止，計算總劑量即為LD50

(n)

。如果到28d，死亡動物仍不到半數(shù)，可停止試驗，因為這時總劑量已達12.8LD50

，K＞12.8，可認為無蓄積性。第34頁，共53頁。定期遞增劑量法染毒劑量表接觸天數(shù)1～4d5～8d9～12d13～16d17～20d2l～24d25～28d每天接觸劑量(LD50)0.10.150.220.340.500.751.12四天接觸總劑量(LD50)0.40.60.91.42.03.04.5累積接觸總劑量(LD50)0.41.01.93.35.38.312.8第35頁，共53頁。3、20天蓄積試驗法

其方法是將受試動物分成5組，以1/2、1／5、l/10、l/20LD50和陰性對照組，分別進行染毒，每天1次，共20d，故稱20天法。結(jié)果評定標準為：停藥后7d，各劑量組動物均無死亡，即為蓄積性不明顯(或未見蓄積性)；僅高劑量(1/2LD50)組有死亡，其他組無死亡，為弱蓄積性；若低劑量(1/20LD50)組無死亡，但其他劑量組有動物死亡，并呈劑量反應(yīng)關(guān)系，為中等蓄積性；如僅劑量組出現(xiàn)死亡，且各劑量組呈劑量反應(yīng)關(guān)系，則為強蓄積性。第36頁，共53頁。（二）生物半衰期法（biologicalhalf-life，t1/2）進入機體的外源化學物在體內(nèi)消除一半所需的時間稱為～。單位：分鐘或小時。方法：將受試物靜脈注入，按一定時間間隔連續(xù)多次測定機體接觸受試物后實驗動物血漿中該物質(zhì)的濃度，以時間為橫坐標，以血漿中物質(zhì)濃度的對數(shù)值為縱坐標繪圖，依圖求出直線的斜率ke，t1/2=0.693/ke。蓄積極限值L（mg）=1.44×化學物吸收量×t1/2第37頁，共53頁。（三）蓄積率及其測定蓄積率越高表明該化學物蓄積可能性越大。第38頁，共53頁。三、機體耐受性某些情況下，某一種外源化學物反復作用于機體后，本來在一定劑量下可以引起的某種毒效應(yīng)卻沒有出現(xiàn)，必須加大劑量才能使機體呈現(xiàn)預期的效應(yīng)。此現(xiàn)象稱為機體對該化學物的耐受性。在蓄積實驗中有時常于試驗結(jié)束時將存活的動物給予一次沖擊劑量（多用1個LD50

），若此時動物的死亡數(shù)仍少于一半，則認為已出現(xiàn)耐受性。有時打擊劑量可高達3個LD50仍不會出現(xiàn)半數(shù)動物死亡，可以認為耐受性較高。第39頁，共53頁。第三節(jié)亞慢性、慢性毒性作用及其評價在多數(shù)情況下，人類對生活和生產(chǎn)環(huán)境中的化學物接觸水平均較低，不至于發(fā)生急性中毒，但卻可能在長期反復接觸中發(fā)生慢性中毒。機體對1次染毒與多次反復染毒的反應(yīng)可能不同，例如苯在1次大劑量染毒時的作用是麻醉，而多次小劑量反復染毒，其作用則是損害造血系統(tǒng)。或者靶器官不同。研究和評價化學物的亞慢性和慢性毒性作用是評價外源化學物安全性的主要內(nèi)容之一，為制定衛(wèi)生標準、預防慢性中毒有重要意義。第40頁，共53頁。一、基本概念及試驗?zāi)康模ㄒ唬﹣喡远拘栽囼灒菏窃谙喈斢趧游锷?/10時間內(nèi)，使動物每日或反復多次接觸受試物的毒性試驗。一般1～3個月。亞慢性毒性試驗?zāi)康氖怯^察受試物以不同劑量水平經(jīng)較長期喂養(yǎng)后對動物的毒性作用性質(zhì)和靶器官，并初步確定最大作用劑量；為慢性毒性試驗提供依據(jù)。第41頁，共53頁。（二）慢性毒性試驗使動物大部分時間或終生接觸受試物的毒性試驗。一般為4～6個月或更長（2～3年）。其目的是了解經(jīng)長期接觸受試物后出現(xiàn)的毒性作用，尤其是進行性或不可逆的毒性作用以及致癌作用；最后確定最大無作用劑量，為受試物能否應(yīng)用于食品的最終評價提供依據(jù)。第42頁，共53頁。二、亞慢性毒性試驗設(shè)計（一）實驗動物的選擇及喂飼環(huán)境原則上應(yīng)選擇兩種實驗動物，一種為嚙齒類動物（大、小白鼠等），另一種為非嚙齒類動物（狗、貓、猴等）。大鼠4周齡，體重50g；小鼠3周齡，體重10g雌雄各半。營養(yǎng)合理的飼料、充足潔凈的飲水和舒適衛(wèi)生的環(huán)境，適宜的溫、濕度。第43頁，共53頁。（二）劑量選擇與劑量分組劑量選擇——劑量上限參考急性閾劑量為最高劑量或以該化學物的LD50的1/20～1/5為最高劑量。應(yīng)控制在整個實驗過程中不發(fā)生死亡，有明顯的中毒效應(yīng)或靶器官出現(xiàn)典型的損傷。劑量分組——3～4個染毒組和一個對照組，必要時再加一個受試物的溶劑對照組。第44頁，共53頁。（三）實驗動物染毒途徑原則——一是盡量模擬人類在環(huán)境中接觸該化學物的途徑和方式；二是保持與將要進行的慢性毒性試驗一致的接觸途徑。第45頁，共53頁。（四）試驗周期亞慢性毒性試驗的周期一般占實驗動物生命的1/10。對于長期、經(jīng)常接觸的受試物可選擇90天試驗周期。對于較短時期接觸的受試物可選擇30天。第46頁，共53頁。（五）觀察指標一般性指標（體重、中毒癥狀）血液和行為學變化生理生化指標變化病理解剖學檢查病理組織學檢查第47頁，共53頁。三、慢性毒性試驗設(shè)計（一）實驗動物和飼養(yǎng)環(huán)境（同亞慢性毒性試驗）（二）劑量選擇與分組劑量選擇——對照組、預期無作用劑量組、閾劑量組、輕微且有明確毒效應(yīng)劑