電子顯微鏡的應(yīng)用與診斷

關(guān)于電子顯微鏡的應(yīng)用與診斷第一頁，共三十三頁，2022年，8月28日電鏡的起始電子顯微鏡誕生于30年代初,但直到60年代以前,電子顯微鏡在生物醫(yī)學中的應(yīng)用主要限于細胞生物學、微生物、實驗病理學等研究領(lǐng)域。60年代初期人們開始將電子顯微鏡應(yīng)用于人體病理標本,通過對這些人體病理標本的超微結(jié)構(gòu)分析,人們進一步了解了疾病的病理變化及其發(fā)生機制,也同時認識到電鏡做為一個新的診斷工具可直接為臨床服務(wù),為某些疾病的診斷提供重要的形態(tài)依據(jù)。第二頁，共三十三頁，2022年，8月28日60年代、70年代是國際上診斷電鏡發(fā)展的黃金時代,越來越多的疾病通過電鏡檢查而得到確診,越來越多的病理學家認識到了電鏡診斷的價值,電鏡逐漸成為病理診斷的一個基本工具,歐美國家中幾乎所有大的醫(yī)療中心及醫(yī)院都將電子顯微鏡用于疾病的研究和診斷。第三頁，共三十三頁，2022年，8月28日電子顯微鏡在腎活檢診斷、疑難腫瘤的病理診斷、感染性疾病(病毒性,細菌性等)、代謝性疾病(貯積性疾病)、細胞外物質(zhì)沉積性疾病(如淀粉樣變性)、組織細胞增生癥(郎格罕細胞增生性疾病)、纖毛運動不能綜合征等特殊疾病的診斷中公認起著重要的作用。第四頁，共三十三頁，2022年，8月28日幾種常用電鏡技術(shù)1.1常規(guī)電鏡技術(shù)標本經(jīng)固定后用microslicer切片以增加樣品量,取其中一部分(其余切片繼續(xù)保存)做快速常規(guī)包埋、定位及超薄切片,用透射電鏡觀察,整個過程2～3d。有些特殊結(jié)構(gòu)在器官組織中分布很少,而對于疾病診斷又很有意義。本方法是先切大量半薄切片,在光鏡下先找到這些特殊結(jié)構(gòu)(必要時可用美藍染色),然后再做原位包埋、超薄切片,透射電鏡觀察。雖然將光鏡和電鏡的結(jié)果結(jié)合起來分析增加了技術(shù)難度,但可使疾病的電鏡病理診斷結(jié)果更全面、可靠。第五頁，共三十三頁，2022年，8月28日1.2電鏡酶細胞化學技術(shù)有些疾病在光鏡和常規(guī)電鏡的基礎(chǔ)上還不能完全確診,需結(jié)合電鏡酶細胞化學技術(shù)才能明確診斷。經(jīng)過篩選,常用于疾病診斷和鑒別診斷的酶主要有以下幾種[1]:第六頁，共三十三頁，2022年，8月28日(1)酸性磷酸酶,主要定位于溶酶體及高爾基體,是兩者的標志酶;(2)葡萄糖262磷酸酶,定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核膜,是兩者的標志酶;(3)琥珀酸脫氫酶,定位于線粒體內(nèi)膜,是其標志酶;(4)髓過氧化物酶,定位于粒細胞和單核細胞的線粒體、核膜、高爾基體及胞質(zhì)顆粒,在原始細胞階段的白血病可依靠該酶來進行細胞分型和鑒別診斷;(5)血小板過氧化物酶,定位于巨核細胞的核膜、線粒體及致密管道系統(tǒng),對巨核細胞性白血病的診斷有重要作用。第七頁，共三十三頁，2022年，8月28日1.3免疫電鏡技術(shù)主要有兩種:一種是免疫凝集電鏡技術(shù),一般是抗原、抗體凝集經(jīng)負染后在電鏡下觀察,多用于診斷病毒性感染疾病。另一種是免疫電鏡定位技術(shù),是用標記物標記后定位,常用標記物有3種[2]:第八頁，共三十三頁，2022年，8月28日(1)辣根過氧化物酶,相對分子質(zhì)量較小,標記后可用光鏡及電鏡觀察,多用于細胞內(nèi)標記;(2)膠體金顆粒,可根據(jù)需要制備成不同大小(常用直徑為5、10、15nm),能用于細胞內(nèi)及細胞表面標記;(3)鐵蛋白顆粒,相對分子質(zhì)量較大,一般用于細胞表面標記,但不如膠金標記優(yōu)越,現(xiàn)使用較少。根據(jù)標本來源、種類和疾病診斷的需要可做包埋前和包埋后標記,也可進行單標、雙標或多標。第九頁，共三十三頁，2022年，8月28日1.4掃描電鏡技術(shù)可觀察到組織及細胞表面結(jié)構(gòu),適用于較大范圍內(nèi)觀察病變細胞表面結(jié)構(gòu),在白血病細胞分類中起重要作用。如毛細胞性白血病,除了在細胞內(nèi)找到典型的板層體外,另一個特征是細胞表面有大量多而長的微絨毛突化可以分析和判斷對疾病的治療情況。另外遺傳性口形細胞增多癥可利用掃描電鏡分型,為臨床治療提供依據(jù)。第十頁，共三十三頁，2022年，8月28日免疫組織化學技術(shù)與電鏡的比較進入80年代后,免疫組織化學技術(shù)開始引入病理診斷。由于此項技術(shù)的不斷改進,特異性及敏感性逐漸得到改善,操作技術(shù)不斷地簡化并規(guī)范化,又由于單克隆技術(shù)的發(fā)展使得大量有診斷價值的抗體得以臨床應(yīng)用,因此這項技術(shù)很快便在人體各種疾病,尤其在腫瘤的診斷中廣泛開展起來,直至今日方興未艾。第十一頁，共三十三頁，2022年，8月28日當時許多人認為人類疾病的診斷進入了免疫組化的時代,免疫組化將取代電子顯微鏡成為人類疾病診斷的一個重要的手段。不少醫(yī)療單位越來越忽視電鏡在疾病研究、診斷中的作用,甚至錯誤地認為今后的疾病診斷將不再需要電子顯微鏡的助,有了操作簡單、快捷、費用低廉的免疫組化技術(shù)以及近年來發(fā)展起來的分子雜交、PCR、細胞基因分析等更加先進的診斷技術(shù),足以解決人體疾病診斷中的難題。第十二頁，共三十三頁，2022年，8月28日要想讓電鏡仍然發(fā)揮出應(yīng)有的或更大的作用,首先要進一步提高和發(fā)展現(xiàn)有的電鏡技術(shù):進一步縮短電鏡標本的制備時間,發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用新型固定劑、包埋材料等,簡化規(guī)范電鏡標本制備過程,并適用于多種類型的標本(新鮮標本及甲醛固定甚至石蠟包埋后的標本,實體組織及液體標本等);第十三頁，共三十三頁，2022年，8月28日進一步簡化,改進電鏡酶細胞化學技術(shù)、膠體金免疫電鏡技術(shù)等,不但保持其原來的特異性、敏感性,更要降低對標本的要求,更適應(yīng)于臨床的需要,使得這些技術(shù)能更廣泛地應(yīng)用于常規(guī)電鏡診斷。其次,除了進一步拓寬常規(guī)透射電鏡、掃描電鏡、電子能量色散譜、微區(qū)電子衍散等。第十四頁，共三十三頁，2022年，8月28日在人體疾病診斷中的應(yīng)用范圍,還要積極地將掃描隧道顯微鏡、原子力顯微鏡等新型的超顯微鏡引入到人體疾病的研究及診斷中,開拓病理診斷的新領(lǐng)域。除了開展活檢、外檢組織的電鏡檢查,還要積極開展細胞學的電鏡檢查。第十五頁，共三十三頁，2022年，8月28日此外,要提高電鏡診斷水平,還要注意電鏡工作者、病理醫(yī)生和臨床醫(yī)生之間的協(xié)作,注意培養(yǎng)提高動用臨床醫(yī)療知識、病理知識、超微結(jié)構(gòu)觀察及電鏡技術(shù)綜合知識的能力,積累各種疾病電鏡診斷的要點,總結(jié)出各種疾病診斷的標準。要積極參與電鏡診斷各種形式的學術(shù)交流,不斷充實、更新知識。第十六頁，共三十三頁，2022年，8月28日在我國,電子顯微鏡以往主要建立于大專院校及科研究院(所),部分電鏡工作者缺乏電鏡診斷的經(jīng)驗,而臨床醫(yī)生、病理醫(yī)生往往又缺乏電鏡知識,忽視電鏡在疾病診斷中的作用。因此,要推動我國電鏡診斷的進一步發(fā)展,積極進電鏡工作者、病理醫(yī)生和臨床醫(yī)生之間的協(xié)作及溝通顯得尤為重要。第十七頁，共三十三頁，2022年，8月28日電鏡在疾病診斷中的應(yīng)用在生命科學領(lǐng)域中,運用電鏡技術(shù)觀察研究生物細胞超微結(jié)構(gòu)已有近半個世紀歷史,而將電鏡技術(shù)用于臨床研究和疾病診斷也有近四十年時間。幾十年來電鏡作為一種先進手段,在醫(yī)學科學的研究和臨床疾病診斷方面作出了重大貢獻。第十八頁，共三十三頁，2022年，8月28日1.電鏡對病毒性疾病的診斷病毒性疾病的診斷離不開電鏡,電子顯微術(shù)是確定各種病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)最有用的工具。傳統(tǒng)的超薄切片可供觀察感染細胞內(nèi)病毒的大小、形態(tài)、排列及其復(fù)制組裝、成熟的過程以及某些有包膜病毒的芽生成熟的部位和病毒包涵體的形態(tài)特征[3]。第十九頁，共三十三頁，2022年，8月28日依據(jù)電鏡下病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)特征,包括衣殼的對稱性、殼微粒數(shù)和排列方式、核衣殼在細胞內(nèi)復(fù)制組裝的部位、病毒體的形態(tài)和大小以及螺旋對稱核衣殼的直徑等,再結(jié)合病毒的核酸和蛋白分子生物學特性,可以對致病病毒進行鑒定和分類。電鏡負染技術(shù)是一種快速簡便的操作程序,也是病毒性致病因子電鏡診斷常用的方法,在新病毒的發(fā)現(xiàn)中作出了重要貢獻。免疫電鏡技術(shù)的應(yīng)用更提高了病毒快速診斷的敏感性和特異性[4]。第二十頁，共三十三頁，2022年，8月28日另外,電鏡技術(shù)對研究某些病毒感染的發(fā)病機理也很有幫助。例如新近Geisbert等[5]報道了馬爾堡出血熱病人的電鏡觀察結(jié)果是先前無人報道過的。他們發(fā)現(xiàn)在胰島中有病毒感染,在其他中,巨噬細胞是最早受病毒攻擊的靶細胞。肝細胞、腎上腺皮質(zhì)和髓質(zhì)細胞以及纖維母細胞也是病毒復(fù)制的重要部位。第二十一頁，共三十三頁，2022年，8月28日2.電鏡對腫瘤的診斷病理科醫(yī)生對腫瘤的診斷,主要依賴于光鏡,輔以免疫組織化學等技術(shù)。一般講,使用這些技術(shù),絕大部分腫瘤都得以明確診斷。但有些腫瘤的診斷及鑒別診斷,電鏡所起的作用很大,如無色素性黑色素瘤、肥大細胞腫瘤、嗜酸細胞瘤、肌源性腫瘤、軟組織腺泡狀肉瘤及神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤等[6]。第二十二頁，共三十三頁，2022年，8月28日對于這些腫瘤,光鏡有時難以明確診斷。免疫組織化學方法雖然對腫瘤的診斷發(fā)揮了很大作用,但由于腫瘤的多向分化及部分市售免疫組化試劑存在明顯的交叉反應(yīng)性,所以應(yīng)用免疫組化染色診斷腫瘤有一定的局限性。而電鏡技術(shù)的應(yīng)用為腫瘤的診斷提供了一條新的途徑。如對神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的診斷即為佐證。神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤都含有神經(jīng)內(nèi)分泌顆粒,不論其分化程度如何,是原發(fā)的還是轉(zhuǎn)移的,在電鏡下都很易識別。另外,通過對此類瘤細胞分泌顆粒及其他超微結(jié)構(gòu)特點的識別,還可以對一些內(nèi)分泌腫瘤作進一步的功能分類。以上這些都是光鏡難以做到的。第二十三頁，共三十三頁，2022年，8月28日電鏡對下列腫瘤的鑒別診斷可起到重要作用:①區(qū)別癌、黑色素瘤和肉瘤;②區(qū)別腺癌和間皮瘤;③在前縱膈腫瘤中可區(qū)別胸腺瘤、胸腺類癌、惡性淋巴瘤和生殖細胞瘤;④在小圓細胞瘤中可區(qū)別神經(jīng)母細胞瘤、胚胎性橫紋肌瘤、Ewing氏肉瘤、惡性淋巴瘤和小細胞癌;⑤在軟組織梭形細胞瘤中可區(qū)別纖維肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、平滑肌肉瘤和惡性神經(jīng)鞘瘤;⑥區(qū)別梭形細胞癌和癌肉瘤[7]。第二十四頁，共三十三頁，2022年，8月28日3.電鏡對非腫瘤性疾病的診斷電鏡對各器官系統(tǒng)疾病的病理診斷,在許多單位受到重視,但用得最多的是腎臟活檢和某些皮膚疾病的診斷。對腎臟病的診斷,通常將光鏡、免疫熒光光鏡和電鏡觀察三者結(jié)合。第二十五頁，共三十三頁，2022年，8月28日在某些腎病的診斷中,電鏡起著決定作用:①遺傳性腎炎。此病腎小球的組織學改變無特殊,唯電鏡檢查方能作出準確診斷;②腎小球薄基底膜病。光鏡檢查無助于對此病的診斷,電鏡檢查是唯一能夠明確此病的手段;③Farbry氏病。此病的嗜鋨顆粒和板層小體只有在電鏡下才能觀察到;④腎淀粉樣變及纖維性腎小球病。此類疾病在電鏡下見到類淀粉纖維由無分枝的周期性細纖維組成(直徑8~10nm,腎淀粉樣變)或微管狀纖維結(jié)構(gòu)(直徑約20nm,纖維性腎小球病),因而可作出肯定的診斷[8]。第二十六頁，共三十三頁，2022年，8月28日4.電鏡獲得的信息對光鏡診斷結(jié)果進行補充或修正臨床上,有時僅靠光鏡難以對疾病明確診斷,而電鏡具有高分辨性能,可以獲得許多不為光鏡捕捉到的信息,往往就是這些信息,為疾病的正確診斷提供了寶貴的資料,甚至修正光鏡的診斷結(jié)論。Wills等[9]對200例病例進行了光鏡診斷和電鏡診斷的結(jié)果比較,發(fā)現(xiàn)有15%的病例靠電鏡提供新的信息得以診斷。第二十七頁，共三十三頁，2022年，8月28日圖1a,1b

Merkel細胞癌胞漿內(nèi)有神經(jīng)內(nèi)分泌顆粒。Bar=015μm,012μm

Fig.1a,1b

NeurosecretorygranulesinthecytoplasmofMerkelcellcarcinoma.Bar=015μm,012μm第二十八頁，共三十三頁，2022年，8月28日電鏡的展望新世紀來臨之際,回眸過去的一百年中人類對疾病的認識有了非常深刻的變化,疾病診斷的技術(shù)手段也有了巨大的進步,這其中無疑包含了電子顯微鏡所作的偉大貢獻。有人指出的那樣:“沒有電子顯微鏡增添新的認識和知識,就不可能有對疾病或病理過程的了解。時至今日,電子顯微鏡并未像某些人預(yù)測的那樣隨著免疫組化技術(shù)的發(fā)展而進入了末日。相反,近年來越來越多的事實證明電鏡在人體各種疾病的診斷中仍然發(fā)揮著重要的作用。第二十九頁，共三十三頁，2022年，8月28日無疑,對于許多非腫瘤性疾病,由于常常無特異的抗原表達,因此其診斷仍依賴于特異的光鏡及電鏡形態(tài)表現(xiàn)。如腎活檢,除了組織學特點外,電鏡觀察還能揭示免疫復(fù)合物沉積的確切部位及形態(tài),基底膜及各種細胞的變化等特點,這些仍然是重要的診斷依據(jù),因此腎活檢標本目前都常規(guī)地進行電鏡檢查。通過檢測各種細胞器、肌絲的變化及特殊的超微結(jié)構(gòu),電鏡對許多代謝性疾病、細胞內(nèi)?外異常物質(zhì)沉積性疾病(如淀粉性變性)、肌病的診斷也還起著關(guān)鍵的作用第三十頁，共三十三頁，2022年，8月28日而這些疾病目前尚無法采用免疫組化的方法來診斷。對于許多感染性疾病,目前國內(nèi)外雖然已建立了免疫學或PCR等診斷技術(shù),但在不知道具體病原體的情況下,電鏡檢查仍然是最快捷、可靠的診斷手段。此外,由于不少病原體(如病毒,弓形蟲等)在電鏡下具有明確可靠的形態(tài)特點,易于辨認,而免疫學及PCR檢測可出現(xiàn)程度不等的假陰性或假陽性,因此電鏡檢查目前仍公認為最可靠的診斷技術(shù)[10]。第三十一頁，共三十三頁，2022年，8月28日參考文獻1.顏永碧,陸月良,王英電鏡技術(shù)在病理學診斷中的應(yīng)用[J]第二軍醫(yī)大學學報2003年6月,第24卷2.鄭尊,于秉學,陳德蕙電鏡診斷學的興起與發(fā)展[J]電子