藥分電子-課件第十一章講義

第十一章抗生素類藥物的分析第一節(jié)概述第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類抗生素第三節(jié)氨基糖苷類抗生素第四節(jié)四環(huán)素類抗生素第一節(jié)概述一、抗生素的定義和特點狹義——是微生物在代謝過程中產(chǎn)生的，在低濃度下就能抑制它種微生物的生長和活動，甚至殺死它種微生物的化學(xué)物質(zhì)（1943年鏈霉素的發(fā)現(xiàn)者瓦克斯曼提出）。廣義——兩點補充來源方面：不僅限于微生物產(chǎn)生的，也包括高等動植物產(chǎn)生的代謝物，甚至包括化學(xué)合成或半合成的化合物。性能方面：不僅抗細菌的物質(zhì)，某些抗腫瘤、抗原蟲、抗病毒、抗真菌、抗藻類、抗寄生蟲以及殺蟲除蟲等的物質(zhì)也都包括在抗生素這個范疇內(nèi)。（一）定義1.化學(xué)純度低（二）特點同系物多：母核上不同取代基。異構(gòu)體多：如β-內(nèi)酰胺類抗生素和氨基糖苷類抗生素具有手性中心。降解物多：如β-內(nèi)酰胺類抗生素的水解，四環(huán)素類抗生素的脫水。2.活性組分易發(fā)生改變：微生物菌株和發(fā)酵條件的改變可導(dǎo)致產(chǎn)品的組分組成和比例的改變。3.穩(wěn)定性差：易發(fā)生水解，消去反應(yīng)，差向異構(gòu)，分子重排等。β-內(nèi)酰胺類：包括青霉素類、頭孢菌素類等?！鶕?jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)青霉素氨基糖苷類：包括鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、新霉素等。鏈霉素二、抗生素藥物的分類四環(huán)素類：包括四環(huán)素、土霉素、金霉素等。大環(huán)內(nèi)酯類：包括紅霉素、白霉素、乙酰螺旋霉素等。金霉素紅霉素多烯大環(huán)類：包括制霉菌素、兩性霉素B、曲古霉素等。多肽類：包括萬古霉素、硫酸多黏菌素B等。兩性霉素B萬古霉素酰胺醇類：包括氯霉素、甲砜霉素等。氯霉素喹諾酮類：包括諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星等。諾氟沙星(吡啶酮酸)硝基咪唑類：包括甲硝唑、替硝唑、奧硝唑等。替硝唑三、抗生素藥物的質(zhì)量分析質(zhì)量控制方法鑒別檢查含量（效價）測定分析方法理化方法生物學(xué)方法（一）鑒別試驗官能團顯色反應(yīng)光譜法：IR，UV色譜法：TLC，HPLC生物學(xué)法：檢查抗生素滅活前后的抑菌能力，并與已知含量的對照品進行對照鑒別。（二）檢查影響穩(wěn)定性的檢查項目：結(jié)晶性，酸堿度，水分等?？刂朴袡C和無機雜質(zhì)的檢查項目：溶液澄清度和顏色，有關(guān)物質(zhì)，殘留溶劑，熾灼殘渣，重金屬等。與臨床安全相關(guān)的檢查項目：異常毒性，熱源或細菌內(nèi)毒素，降壓物質(zhì)，無菌等。其他檢查項目：組分分析生物學(xué)方法理化方法以抗生素對微生物的殺傷或抑制程度為指標衡量抗生素的生物效價。根據(jù)抗生素結(jié)構(gòu)特點，利用其特有的理化性質(zhì)測定其含量。已知或新發(fā)現(xiàn)的抗生素、精制品或粗制品均能測定。測定化學(xué)結(jié)構(gòu)已知、已提純的抗生素。靈敏度高、干擾物質(zhì)少、與臨床效果一致，但操作步驟多、費時、誤差大。準確度高、簡單、快速，但易受雜質(zhì)干擾、不一定代表生物效價。（三）含量或效價測定結(jié)構(gòu)復(fù)雜、多組分的抗生素首選生物學(xué)法。HPLC法，如β-內(nèi)酰胺、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類。抗生素的活性以效價單位表示，即每毫升或每毫克中含有某種抗生素的有效成分的多少，用單位（U）或微克（μg）表示?？股鼗钚员硎痉椒ǎ?mg青霉素鈉鹽定為1670U同一種抗生素的不同鹽類可根據(jù)其分子量與標準鹽類進行換算：1mg青霉素鉀鹽的單位(U)

=1670×356.4/372.5=1598U/mg第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類抗生素一、β-內(nèi)酰胺類抗生素分類和化學(xué)結(jié)構(gòu)β-內(nèi)酰胺類抗生素系指化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有β-內(nèi)酰胺環(huán)的一大類抗生素，其中包括青霉素類和頭孢菌素類。αβ青霉素類ABA環(huán)：β-內(nèi)酰胺環(huán)B環(huán)：氫化噻唑環(huán)母核（6-氨基青霉烷酸）側(cè)鏈1234567***青霉素氨芐西林（氨芐青霉素）阿莫西林（羥氨芐青霉素）頭孢菌素類ABA環(huán)：β-內(nèi)酰胺環(huán)B環(huán)：氫化噻嗪環(huán)母核（7-氨基頭孢菌烷酸）側(cè)鏈1234567**8頭孢氨芐頭孢拉定頭孢噻吩鈉結(jié)構(gòu)特點：分子內(nèi)有一個四元的β-內(nèi)酰胺環(huán)。除了單環(huán)β-內(nèi)酰胺外，該四元環(huán)與另一個五元環(huán)或六元環(huán)相稠和。所有β-內(nèi)酰胺環(huán)羰基α碳上都有一個酰胺基側(cè)鏈。與β-內(nèi)酰胺環(huán)稠合的環(huán)上都有一個羧基。母核有手性碳原子二、性質(zhì)（一）羧基酸性pKa=2.74pKa=4.5青霉素頭孢氨芐與堿金屬(Na+、K+)成鹽，易溶于水與有機堿(普魯卡因)成鹽，難溶于水Na+青霉素青霉素鈉（易溶于水）普魯卡因普魯卡因青霉素（難溶于水）（二）手性碳旋光性C2，C5，C6C6，C7青霉素類頭孢菌素類（三）共軛體系母核無明顯UV，但多數(shù)側(cè)鏈有苯環(huán)取代基，有UV

母核有共軛體系，有UV

青霉素類頭孢菌素類（四）β-內(nèi)酰胺環(huán)不穩(wěn)定性因素四元環(huán)張力大酰胺鍵易水解水溶液不穩(wěn)定干燥純凈穩(wěn)定青霉素類頭孢菌素類酸、堿、青霉素酶羥胺、金屬離子降解分子重排失效青霉素的降解反應(yīng)青霉素酶H2O,OH-NH2OH青霉噻唑酸青霉素青霉噻唑酰基羥胺(異羥肟酸)青霉烯酸青霉酸青霉醛青霉胺R=PhCH2H2O,H+100°CpH2pH4三、鑒別各種鹽的反應(yīng)（一）1.鈉鹽Na+焰色→鮮黃色2.鉀鹽K+焰色→紫色3.有機銨鹽反應(yīng)普魯卡因青霉素H+

偶合反應(yīng)呈色重氮化-偶合反應(yīng)芳伯氨基普魯卡因NaNO2,HCl

重氮化與三硝基苯酚反應(yīng)二芐基乙二胺OH-二芐基乙二胺芐星青霉素三硝基苯酚+二芐基乙二胺苦味酸結(jié)晶（二）呈色反應(yīng)1.羥肟酸鐵反應(yīng)β-內(nèi)酰胺類呈色(紅、棕、褐)Fe3+H+異羥肟酸NaOH,C2H5OH2.茚三酮反應(yīng)α-氨基△,弱酸性α-氨基、伯胺某些羥基胺類酮式烯醇式茚三酮茚三酮縮合藍紫色3.雙縮脲反應(yīng)蛋白質(zhì)在堿性溶液中與硫酸銅作用形成紫色絡(luò)合物，在540nm波長處有最大吸收，可用于蛋白質(zhì)的定性和定量檢測。β-內(nèi)酰胺類似肽鍵（開環(huán)分解）紫紅色內(nèi)酰胺類堿性酒石酸銅???????-b頭孢菌素類4.其他呈色反應(yīng)頭孢氨芐頭孢噻吩鈉頭孢噻肟鈉黃色紅棕亮黃H2SO4-HNO3與H2SO4-HNO3反應(yīng)青霉素鉀（鈉）氨芐西林與H2SO4–HCHO反應(yīng)H2SO4–HCHO△暗黃色紅棕色與變色酸-硫酸反應(yīng)羰基側(cè)鏈含活潑“-CH2-”的青霉素、阿莫西林、氨芐西林等H2SO4，150?CHCHO變色酸阿莫西林λmax=570-580nm藍紫色與重氮苯磺酸反應(yīng)酚羥基例：頭孢哌酮（偶合）橙黃色重氮苯磺酸???????-56OHHC（偶合）頭孢哌酮（三）光譜法1.UV法最大吸收波長鑒定法水解產(chǎn)物的最大吸收波長鑒定法頭孢氨芐λmax=262nmCu2+β-內(nèi)酰胺環(huán)酰胺2.IR法VCOO-

1610cm-1對照品法（四）色譜法1.TLC法2.HPLC法四、檢查（一）聚合物——分子排阻色譜法根據(jù)待測組分的分子大小進行分離的一種液相色譜技術(shù)1.色譜條件固定相：葡聚糖凝膠G-10（40-120μm）流動相A：3.5%硫酸銨的0.01mol/l磷酸鹽緩沖液流動相B：0.01%十二烷基硫酸鈉對照品溶液：頭孢他啶對照品100μg/ml流速：1ml/min；檢測波長：254nm頭孢他啶聚合物的測定2.系統(tǒng)適用性試驗：理論塔板數(shù)和拖尾因子用1mg/ml藍色葡聚糖2000、流動相A測定；重復(fù)性用對照品溶液、流動相B測定。N不低于900，拖尾因子0.75~1.5，峰面積的RSD應(yīng)小于5.0%。

3.測定方法：取本品適量，精密稱定，加水制成含頭孢他啶20mg/ml的溶液，立即進樣200μl，以流動相A為流動相進行測定，記錄色譜圖；另取對照品溶液200μl注入液相色譜儀，以流動相B為流動相，記錄色譜圖。按外標法計算，本品含頭孢他啶聚合物以頭孢他啶計不得過0.3%。（二）有關(guān)物質(zhì)和異構(gòu)體——HPLC法頭孢呋辛酯中有關(guān)物質(zhì)和異構(gòu)體的檢查色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗固定相：ODS流動相：0.2mol/L磷酸二氫銨-甲醇（62:38）檢測波長：278nm要求各異構(gòu)體之間的分離度R﹥1.5；理論板數(shù)按頭孢呋辛酯A異構(gòu)體峰計算，n≥1500。異構(gòu)體：以A異構(gòu)體峰的相對tR為1.0，B異構(gòu)體峰的相對tR約為0.85；供試品色譜圖中A異構(gòu)體峰的面積與A、B異構(gòu)體峰的面積和之比應(yīng)為0.48～0.55。有關(guān)物質(zhì)：按自身對照法測定有關(guān)物質(zhì)限量。（三）吸光度青霉素鈉（鉀）的吸收度檢查取本品，加水制成每1mL中含1.80mg的溶液，照分光光度法，在280nm的波長處測定吸收度，不得大于0.10；在264nm的波長處有最大吸收，吸收度應(yīng)為0.80～0.88?？刂齐s質(zhì)的量控制青霉素鈉（鉀）的含量HPLC是β-內(nèi)酰胺類抗生素含量測定的主要方法。中國藥典收載的本類抗生素原料及制劑共約70種，應(yīng)用HPLC法測定含量的有50多種，約占78%。本類藥物的HPLC法通常采用反相HPLC，以外標法計算含量。五、含量測定色譜柱：ODS柱流動相：磷酸鹽緩沖液－甲醇（95：5）檢測波長：220nm流速：0.7ml/min阿莫西林分離度：>3.5含量計算：按外標法以峰面積計算**β-內(nèi)酰胺不穩(wěn)定性羥肟酸鐵反應(yīng)——鑒別和含量測定雙縮脲反應(yīng)——鑒別酸性，可成鹽——鑒別*茚三酮反應(yīng)——鑒別與變色酸-硫酸反應(yīng)——鑒別與重氮苯磺酸反應(yīng)——鑒別UV——鑒別阿莫西林IR——鑒別HPLC——鑒別，檢查和含量測定第三節(jié)氨基糖苷類抗生素糖：多羥基(2個或以上)的醛或酮葡萄糖D-Fischer投影式+

ROHH++

ROHH+半縮醛(酮)縮醛(酮)醛(酮)與醇的反應(yīng)β-D-吡喃葡萄糖α-D-吡喃葡萄糖[α]D=+18.7o[α]D=+112oα-D-呋喃葡萄糖β-D-呋喃葡萄糖<0.026%<1%≈63.6%≈36.4%[α]D=+52.7o糖苷(配糖體)：單糖半縮醛羥基與另一個分子的羥基(-OH)、胺基(-NH2)或巰基(-SH)縮合形成的含糖衍生物。（苷元）羥基(-OH)：O-苷胺基(-NH2)：N-苷巰基(-SH)：S-苷+

CH3OHHClΔβ-D-吡喃葡萄糖甲基-β-D-吡喃葡萄糖苷[α]D=+18.7o[α]D=-34o糖+苷元糖苷縮合（半縮醛）（縮醛）（非糖部分）氨基糖+苷元氨基糖苷縮合氨基糖苷類抗生素：堿性環(huán)己多元醇羥基被氨基取代的糖氨基葡萄糖鏈霉素新霉素卡那霉素慶大霉素巴龍霉素氨基糖苷類抗生素：一、化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)鏈霉素鏈霉胍鏈霉糖N-甲基-L-葡萄糖胺鏈霉雙糖胺苷元pKa=12.5（堿性環(huán)己多元醇）（氨基糖）巴龍霉素D-葡萄糖胺脫氧鏈霉胺D-核糖巴龍霉糖

糖

糖

糖

苷元巴龍二糖胺巴龍胺慶大霉素絳紅糖胺2-脫氧鏈霉胺加洛糖胺

糖

糖

苷元慶大霉素C復(fù)合物：慶大霉素C1R=HR1、R2=CH3

慶大霉素C2R=R2=H

R1=CH3

慶大霉素C1aR、R1、R2=H

慶大霉素C2aR=CH3R1=R2=H慶大霉素C2bR=R1=HR2=CH3性質(zhì)1.溶解性多羥基、氨基易溶于水2.酸堿性氨基、胍基堿性，多與硫酸成鹽3.穩(wěn)定性鏈霉素pH5.0～7.5慶大霉素pH2.0～12.0穩(wěn)定鏈霉素鏈霉胍N-甲基-L-葡萄糖胺+水解4.旋光性5.UV鏈霉素在230nm處有紫外吸收二、鑒別茚三酮反應(yīng)（一）羥基胺、α-氨基酸+

2Δ+

CO2+3H2O藍紫色反應(yīng)極其靈敏氨基酸茚三酮示例16-8硫酸小諾米星的茚三酮反應(yīng)鑒別法：取本品約5mg，加水1ml溶解后，加0.1%茚三酮的水飽和正丁醇溶液1ml與吡啶0.5ml，在水浴中加熱5分鐘，即呈藍紫色。Molisch試驗（二）氨基糖苷類H+-2H2O-H2O5-羥甲基糠醛284nm糠醛紅紫色α-萘酚蒽酮藍紫色示例16-9阿米卡星的蒽酮呈色鑒別：取本品約10mg，加水1ml溶解后，加0.1%蒽酮的硫酸溶液4ml，即呈藍紫色。葡萄糖胺反應(yīng)（三）(Elson-Morgan反應(yīng))葡萄糖胺水解乙酰丙酮OH-吡咯衍生物對二甲氨基苯甲醛H+紫紅色氨基糖苷巴龍霉素水解D-葡萄糖胺+

OH-吡咯衍生物乙酰丙酮+

對二甲氨基苯甲醛的酸性醇溶液（Ehrlich試劑）紫紅色親電取代示例16-10硫酸新霉素的N-甲基葡萄糖胺反應(yīng)鑒別麥芽酚(Maltol)反應(yīng)（四）鏈霉素OH-重排、水解麥芽酚H+Fe3+紫紅色鏈霉糖鏈霉素的特征反應(yīng)示例16-11硫酸鏈霉素的麥芽酚反應(yīng)鑒別：取本品約20mg，加水5ml溶解后，加NaOH試液0.3ml，置水浴上加熱5分鐘，加硫酸鐵銨FeNH4(SO4)2溶液0.5ml，即呈紫紅色。坂口(Sakaguchi)反應(yīng)（五）水解鏈霉胍OH-NaBrOOH--Br-NaBrOα-萘酚橙紅色2-溴-1,4-萘醌鏈霉素鏈霉胍的特征反應(yīng)示例16-12硫酸鏈霉素的坂口反應(yīng)鑒別：取本品約0.5mg，加水4ml溶解后，加NaOH試液2.5ml與0.1%8-羥基喹啉的乙醇溶液1ml，放冷至15℃，加次溴酸鈉試液3滴，即呈橙紅色。8-羥基喹啉（六）硫酸鹽反應(yīng)（七）色譜法1.TLC法：硫酸慶大霉素的鑒別供試液和對照液：點樣、展開、涼干、碘蒸氣中顯色判斷：供試液與對照液所顯斑點的個數(shù)、顏色與位置應(yīng)一致。2.HPLC法：硫酸慶大霉素的鑒別

比較供試液與對照液各組分的保留時間。（八）光譜法1.IR

ChP和BP均采用IR鑒別本類藥物2.UVnmmax230=l鏈霉素三、特殊雜質(zhì)檢查

（一）鏈霉素中鏈霉素B的檢查鏈霉素B（甘露糖鏈霉素）方法：TLC中的對照品法1.來源：發(fā)酵中菌種產(chǎn)生對微生物的活性無明顯差異毒副作用和耐藥性不同發(fā)酵菌種不同工藝差別C組分比例不一致規(guī)定控制C各組分的相對百分含量（二）慶大霉素C組分的測定+巰基醋酸鄰苯二醛R-NH2λmax=330nm慶大霉素?zé)oUV吸收，用紫外檢測時需進行衍生化處理+HSCH2COOH氨基OH-異吲哚衍生物RP－HPLC方法2.規(guī)定C125~50%C1a15~40%C2a+C220~50%計算3.峰面積歸一化法四、含量測定微生物檢定法HPLC法常用于體內(nèi)藥物分析各國藥典主要采用麥芽酚反應(yīng)——鑒別在酸性或堿性條件下可水解Molisch反應(yīng)——鑒別N-甲基葡萄糖胺反應(yīng)——鑒別堿性——和酸成鹽坂口反應(yīng)——鑒別水溶性旋光性α-氨基的茚三酮反應(yīng)——鑒別硫酸根——鑒別IR——鑒別HPLC——鑒別，檢查和含量測定第四節(jié)四環(huán)素類抗生素ABCD123456789101112一、化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)四并苯或萘并萘94弱酸性弱堿性兩性化合物四環(huán)素（TC）tetracycline95金霉素

(CTC)

chlortetracycline氯四環(huán)素96土霉素

(OTC)

oxytetracycline氧四環(huán)素97多西環(huán)素

(DOXC)doxycycline脫氧土霉素98美他環(huán)素（METC）metacycline99

性質(zhì)兩性（一）1.與酸、堿均能成鹽，臨床上多為鹽酸鹽2.具引濕性。其鹽酸鹽易溶于水，在強酸或強堿中溶解度↑

酚羥基、烯醇基弱酸性二甲氨基弱堿性100（三）UV和熒光性質(zhì)（二）旋光性101分子內(nèi)有不對稱碳原子，有旋光性含共軛雙鍵，有UV吸收如鹽酸多西環(huán)素的甲醇溶液在269nm和353nm處有最大吸收，在234nm和296nm處有最小吸收。102四環(huán)素類抗生素在紫外光照射下產(chǎn)生熒光，它們的降解產(chǎn)物也具有熒光。鹽酸土霉素酸性降解產(chǎn)物有綠色熒光鹽酸金霉素堿性降解產(chǎn)物有藍色熒光鹽酸四環(huán)素堿性降解產(chǎn)物有黃色熒光區(qū)別不同的四環(huán)素（四）不穩(wěn)定性1.差向異構(gòu)化差向金霉素差向四環(huán)素金霉素四環(huán)素～-4-462pH藍色熒光103差向四環(huán)素四環(huán)素4104土霉素、多西環(huán)素、美他環(huán)素不易發(fā)生差向異構(gòu)化541052.降解反應(yīng)（1）酸性降解λmax=445nmλmax=435nm共軛雙鍵數(shù)目增加，色澤加深脫水金霉素脫水四環(huán)素金霉素四環(huán)素＜2pH106脫水四環(huán)素107四環(huán)素～～四環(huán)素差向四環(huán)素脫水四環(huán)素差向脫水四環(huán)素＜＜108（2）堿性降解異四環(huán)素四環(huán)素-OH109110111與金屬離子生成有色配位化合物Ca2+Mg2+Fe3+Al3+（五）與金屬離子絡(luò)合二、鑒別試驗

濃H2SO4反應(yīng)