乳兔關節(jié)軟骨細胞的分離、培養(yǎng)及生物學特性的觀察

乳兔關節(jié)軟骨細胞的分離、培養(yǎng)及生物學特性的觀察劉雷;韋慶軍;陳管雄;謝偉;陳歡目的:建立乳兔軟骨細胞分離及培養(yǎng)的方法,觀察軟骨細胞在體外培養(yǎng)中的MTTPCR)法觀24h2.MTTRTPCR【期刊名稱】《廣西醫(yī)科大學學報》【年(卷),期】2014(031)003【總頁數(shù)】5頁(P364-368)【關鍵詞】軟骨細胞;細胞培養(yǎng);組織工程【作者】劉雷;韋慶軍;陳管雄;謝偉;陳歡【作者單位】廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院創(chuàng)傷骨科手外科南寧530021;廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院創(chuàng)傷骨科手外科南寧530021;廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院創(chuàng)傷骨科手外科南寧530021;廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院創(chuàng)傷骨科手外科南寧530021;廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院創(chuàng)傷骨科手外科南寧530021【正文語種】中文R-33目前研究中獲得軟骨細胞的來源主要是通過成年兔，但是過程較為復雜且獲得的提供實驗基礎。材料與方法2劑與儀器：α-MEME（Hy-Clone）、胎牛血清（Gibco）、Ⅱ型膠原酶（Sigma）、胰蛋白酶（索萊寶）、CO2培養(yǎng)箱（Thermo公司）、四甲基偶氮唑鹽（MTT）（Sigma）、定量PCR試劑盒（Roche公司）、倒置相差顯微鏡（OlympusIX-70）、免疫組化試劑盒（中國北京中山公司）、DAB顯色試劑（中國武漢博士德公司）、逆轉錄試劑盒（大連寶生物工程有限公司）。實驗方法1PBS0.2530min20%胎牛血清和雙抗的培養(yǎng)基終止1mm33～437℃3～4h150銹鋼網篩過濾，15mL離心管收集濾液在1000r/min下離心5min，棄上清液、加入20%胎牛血清及雙抗的α-MEM培養(yǎng)基，吹打均勻接種于75cm2培養(yǎng)瓶內進行培養(yǎng)。1×108CO248h2～3d80%PBS2～30.25%胰酶2mL20%胎牛血1000r/min5min，加含血清培養(yǎng)基1∶22、40.25%胰酶消化，重懸細胞后計數(shù)，每孔接種1×104/mL細胞，按200μL/孔接種于96孔板內，分別于1，3，5，7，9d20μL/MTT4h，吸150μL/DMSO10min，使結晶物充分溶解，ThermoMK3492nm2，41，3，50.25%胰酶消化后，采用爬24（0.5mL/孔、2×104/孔），待軟骨細胞貼壁9515min，PBS215s氨水內5min使細胞核藍化。自來水浸洗，置入伊紅染液內10min染色。經70%，80%，90%酒精各一次，95%酒精2次100%酒精3次逐級脫水。中性樹膠固定后，即可拍照。1，3，5420min15min，130min，洗去浮色，無水乙醇進行脫水，中性樹膠封片。即可拍照。Ⅰ、Ⅱ型膠原免疫組織化學（免疫組化）染色：對各代細胞采用爬片技術，420min。3%H2O2（無色液體）10min，PBS32～3h。PBS15min，PBS15min，PBSDAB性樹膠封片。RT-PCR6P1、P3P5TrizolP1、P3、P5RNA。然RT-PCRSPSS16.0（ANOVA）qP＜0.05結果從關節(jié)取下的軟骨呈乳白色，周圍組織覆蓋較少，用胰酶消化30min充分后，0.2%Ⅱ3～4h倒置顯微鏡觀察軟骨：通過酶消化法分離的原代軟骨細胞多呈球形懸浮在培養(yǎng)24h1a）。3～4d1b）。6～7d1c）。9～10d的軟骨細胞爬滿瓶壁，細胞之間相互連接似“鋪路石”樣（1d）131代細胞長，呈中梭形改變。到第5，6代時，軟骨細胞形態(tài)明顯改變，呈長梭形，與成纖維形態(tài)類似。細胞蘇木精—伊紅和甲苯胺藍染色152）。甲苯胺藍染色：原代軟骨細胞被甲苯胺藍染色后，可見細胞內有藍紫色的異染顆粒，尤其在生長聚集的細胞區(qū)更為明顯，但經多次傳代后，異染反應逐漸減弱，表現(xiàn)為軟骨細胞甲苯胺藍染色隨傳代次數(shù)的增加，其顏色逐漸變淺（見圖3）。Ⅰ、Ⅱ型膠原免疫組化染色：原代軟骨細胞內Ⅱ型膠原的表達較高，但同時也有較弱的Ⅰ型膠原表達。細胞染色后可見胞核周圍及細胞外基質有黃褐色淡染區(qū)。經多次傳代，Ⅰ型膠原表達逐漸升高，Ⅱ型膠原的表達逐漸減少（見圖4、圖5）。圖1倒置顯微鏡下觀察到的兔軟骨細胞的細胞形態(tài)（×100）a：軟骨細胞體外培養(yǎng)2d；b：軟骨細胞體外培養(yǎng)3～4d；c：軟骨細胞體外培養(yǎng)6～7d；d：軟骨細胞體外培養(yǎng)9～10d圖2軟骨細胞蘇木精—伊紅染色（×100）a：第1代軟骨細胞；b：第3代軟骨細胞；c：第5代軟骨細胞圖3軟骨細胞甲苯胺藍染色（×100）a：第1代軟骨細胞；b：第3代軟骨細胞；c：第5代軟骨細胞4軟骨細胞Ⅰ型膠原免疫組化染色（×100）a13c55軟骨細胞Ⅱ型膠原免疫組化染色（×100）a13c5軟骨細胞生長曲線：體外培養(yǎng)的第2代，4代軟骨細胞，潛伏期為第1～3天，第3天后開始增殖，第5天時增殖明顯，呈指數(shù)增長。第7～10天后，由于細胞426）。圖6軟骨細胞生長曲線RT-PCR：通過檢測發(fā)現(xiàn)隨代數(shù)次數(shù)增加Ⅰ型膠原蛋白表達逐漸增加，第3，5代細胞Ⅰ型膠原表達均高于第1代細胞（P＜0.05），3，51（P＜0.05）3向發(fā)展（7）。圖7Ⅰ型膠原和Ⅱ型膠原在軟骨細胞中的基因表達＃＃P＜0.01，＃＃＃P＜0.001討論關節(jié)軟骨由軟骨細胞和致密的細胞外基質組成，而細胞所占比例相對較少，如何快速有效的分離出高活性的軟骨細胞是進一步研究的基礎。1976年Manning等［1］首次成功報道了利用胰蛋白酶和細菌膠原酶聯(lián)合消化法，將軟骨細胞從堅韌消化法和機械—酶消化法，國外常用的方法有Green［2］、Klagabrun［3］Shimomura［4］。但是通過酶消化法分離乳兔關節(jié)軟骨的細胞的報道卻尚未見，因此本實驗采用胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶聯(lián)合消化法，對乳兔關節(jié)軟骨進行消化、分離出軟骨細胞，并觀察軟骨細胞在體外培養(yǎng)生物學特性的變化。首先，我們利用胰蛋白酶具有較強的消化能力，將軟骨基質內蛋白多糖分解和清除周圍附著的滑膜組織。然后用Ⅱ型膠原酶對基質內的膠原網架進行消化，在隨后的機械吹打中，便可將大量的軟骨細胞從松散的網架內分離出來。軟骨細胞屬于低氧、低代謝細胞。經過長期單層培養(yǎng)及傳代次數(shù)增加后，軟骨細胞在體外的表型將難以維持，將會在細胞形態(tài)、表型及基因表達等方面發(fā)生變化，這種過程被稱為軟骨的去分化現(xiàn)象［5］。單層培養(yǎng)過程中，隨細胞傳代次數(shù)增加，細胞的形態(tài)也逐漸發(fā)生變化，原代軟骨細胞貼壁后多呈短梭形、圓形及星形，并且胞質色深，胞核較圓。傳至第2～4代時出現(xiàn)形態(tài)變?yōu)橹兴笮?，形態(tài)多樣，待到第5代后細胞大部分呈長梭形，而軟骨的梭形樣改變也是判斷軟骨細胞表型是否改變的標志［6］。高密度培養(yǎng)時由于局部細胞因子濃度較高，使細胞與基質間的反饋調節(jié)更為緊密，有利于細胞的增殖生長和基質沉積。若為低密度培養(yǎng)則不利于保持細胞表型及保持基質新陳代謝的平衡。所以在體外培養(yǎng)時應注意接種的密度。軟骨細胞傳代前后細胞的功能變化，本實驗主要通過甲苯胺藍及Ⅱ型膠原免疫組化細胞周圍可見少量出現(xiàn)，原代細胞較明顯。經多次傳代后染色多呈陰性。從而證明隨傳代次數(shù)的增加，軟骨細胞分泌氨基多糖的能力下降。Ⅱ型膠原是軟骨中的主要膠原成分，由軟骨細胞分泌，通過Ⅱ型膠原免疫組化染色可見軟骨細胞的胞核周圍呈黃褐色，并且胞外有黃褐色顆粒。經傳代染色逐漸減弱，而且細胞形態(tài)多呈長梭形，向成纖維細胞轉變，進一步失去了表達Ⅱ型膠原和分泌氨基多糖的能力［7，8］。其生長速度也明顯快于正常軟骨細胞。因此，正常軟骨細胞在體外培養(yǎng)，無法長期保持其生物學特性，隨傳代次數(shù)增加其分泌和增殖能力下降，并且向去分化轉變。通過實驗發(fā)現(xiàn)，選擇3代以內的軟骨細胞不僅生長良好，而且保持自身的生物學特性，適用于后期實驗及軟骨組組工程的需要。綜上所述，通過采用兩步酶消化法，成功從乳兔關節(jié)軟骨內提取出軟骨細胞。并較以往采用的成年兔取關節(jié)軟骨細胞的方法，能更加方便、快捷的獲得大量生物活性好，純度高的軟骨細胞。通過觀察了解軟骨細胞生物學特性，為進一步實施體外大量培養(yǎng)軟骨細胞和維持細胞生物學特性的研究做了實驗基礎，也為組織工程軟骨的研究提供了種子細胞的來源。參考文獻：［1］ManningWK，BonnerWMJr.Isolationandcultureofchondrocytesfromhumanarticularcartilage［J］.ArthritisRheum，1967，10（1）：235-239.［2］GreenWTJr.Behaviorofarticularchondrocytesincellculture［J］.ClinOrthopRelatRes，1971，75：248-260.［3］KlagsbrunM.Large-scalepreparationofchondrocytes［J］.MethodsEnzymol，1979，58（8）：560-564［4］ShimomuraY，YonedaT，SuzukiF.Osteogenesisbychondrocytesfromgrowthcartilageofratrib［J］.CalcifTissueRes，1975，19（3）：179-187.［5］ChanCK，AnastassiadesTP.Anionicglycoconjugatesfromdifferentiatedanddedifferentiatedculturesofbovinearticularchondrocytes：modulationbyTGF-beta［J］.InVitroCellDevBiolAnim，1998，34（6）：492-498.［6］HoshibaT，YamadaT，LuH，etal.Nucleardeformationandexpressionchangeofcartilaginousgenesduringinvitroexpansionofchondrocytes［J］.BiochemBiophysResCommun，2008，374（4）：688-692.［7］KleinGR，VaccaroAR，AlbertTJ，etal.Efficacyofmagneticresonanceimagingintheevaluationofposteriorcervicalspinefractu