flowjo應(yīng)用常見問題及其解答

210722012-7-2513:27|個(gè)人分類:FlowJo|系統(tǒng)分類:周期青，F(xiàn)lowJo技術(shù)專1.點(diǎn)擊坐標(biāo)軸旁邊的“T”按鈕，選擇“Changedisplayedparameter在彈出框中輸入坐標(biāo)軸范2.直方圖中怎樣調(diào)整Y軸的范在圖形窗口中打開“opton”選項(xiàng)，在“YAxis”中選擇“Auto”或者“Manual”，自動(dòng)，軟件能自動(dòng)調(diào)整Y軸的范圍，將整個(gè)直方圖顯示出來Manual：手動(dòng)需要在后面的“Max”選項(xiàng)中手動(dòng)輸入Y軸標(biāo)度的最大值，然后按“回車鍵”確認(rèn)。比如，在此需要將“Max”值設(shè)為160博給我留發(fā)送消 FlowJoFlowJo 流式細(xì)胞技術(shù)相關(guān)資 ，流式細(xì)胞數(shù)據(jù)分析，流式技術(shù)支持及培博客首動(dòng)博相好作者的其他博 全高端流式研討會(huì)，你會(huì)參一首非常好聽的歌，必flowjo中國(guó)流式小組第二次活動(dòng)（流式細(xì)胞技術(shù)培訓(xùn)課通知(第四屆東南亞國(guó)家流式熱門博文導(dǎo) 全減招會(huì)熔斷嗎向XU館長(zhǎng)等求教：學(xué)術(shù)谷狗教育公平背后的5：什么是公平？說說高流式細(xì)胞儀(Flow文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)的標(biāo)引質(zhì)量問逃還是不逃，這是一個(gè)問科研人員在成果保護(hù)中存在該怎么回答孩子“是一案-娼問題是關(guān)鍵問備注：關(guān)于FlowJo調(diào)整坐標(biāo)軸的詳細(xì)內(nèi)容請(qǐng)參考博文：FlowJo如何調(diào)整在布局頁(yè)中右鍵單擊某個(gè)細(xì)胞群的圖，在彈出的下拉菜單中選擇 輸出圖形時(shí)怎樣自動(dòng)對(duì)在布局頁(yè)中選中需要對(duì)齊的多個(gè)圖形，到布局頁(yè)的“排齊”菜單中選擇對(duì)齊的類型，常用的有：頂端對(duì)齊(Tops)、底部對(duì)(Bottoms)、左對(duì)齊(Lefts)、右對(duì)齊輸出的格式有哪幾種，哪種的分辨率最ungroup，進(jìn)行單個(gè)編輯，不過插入PPT后，轉(zhuǎn)變?yōu)镻PT可識(shí)別的圖，將會(huì)降低分辨率。如果是用作文章的話，建議將保存為PDF格式，再在專業(yè)的編輯器如Photoshop或者Illustrtor里面進(jìn)行編輯，再輸出為雜志要求的文件格式，一般為JPG,現(xiàn)在也有雜志傾向于接收PDF。FlowJo默認(rèn)的圖形輸出格式為PNG格式，如果需要更改，到“編輯”菜單欄里選擇“偏好設(shè)置>文件格式”，在“布局編輯器的輸出格式類型中選擇是否可以調(diào)整偽中每個(gè)點(diǎn)所表示的細(xì)胞個(gè)數(shù)，即調(diào)整點(diǎn)的數(shù)目，使其分辨率更不可以調(diào)整。但是 Plot可以調(diào)整。(具體內(nèi)容請(qǐng)參考博文：如何比較不同細(xì)胞數(shù)目的流式數(shù)據(jù)應(yīng)用模板分析數(shù)據(jù)時(shí)，導(dǎo)入數(shù)據(jù)之后，布局編輯器里的圖形批處理結(jié)果顯示為 在這個(gè)例子中，在布局頁(yè)中選擇“Exp1”，然后點(diǎn)擊“Batch”按鈕，重新Mean,Median,Mode,Geom.Mean的區(qū)Mode mean：幾何平均數(shù)，是指n個(gè)觀察值連乘積的n次，計(jì)算公式為在標(biāo)準(zhǔn)的分布情況下，Median=mean=mode.通常在流式中因?yàn)榭倳?huì)有異常值（或者超低值）的存在，不是完美的分布，建議使用Median，降低異常值對(duì)數(shù)據(jù)的影響。不影響。同一組實(shí)驗(yàn)中的不同樣本，目標(biāo)細(xì)胞群的位置和分布范圍可能會(huì)有變化，在設(shè)門的時(shí)候，需要將目標(biāo)細(xì)胞群都劃在門內(nèi)；而在分析數(shù)據(jù)的時(shí)候，是以統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析整個(gè)細(xì)胞群的分布情況，得到百分比以及平均熒光強(qiáng)度等數(shù)據(jù)。因此不會(huì)影響可比性。沒有補(bǔ)償對(duì)照單染管（單染樣本或者單染Beads）是否可以用FlowJo調(diào)補(bǔ)不可以。不論是在儀器上調(diào)補(bǔ)償，還是在軟件比如FlowJo上調(diào)補(bǔ)償，都必需實(shí)際實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，單染管沒有明顯的雙峰分布，應(yīng)該怎么調(diào)補(bǔ)如果沒有明顯的雙峰分布，在設(shè)門界定群和陽(yáng)性群的時(shí)候：應(yīng)使用區(qū)域門進(jìn)行設(shè)門，群和陽(yáng)性群之間的距離要盡量遠(yuǎn)一些， 群不要包含極低值區(qū)域，陽(yáng)性群不要包含極高值區(qū)域。如下圖所示：關(guān)于用FlowJo做軟件補(bǔ)償請(qǐng)參考博文：FlowJo軟件熒光補(bǔ)怎樣才能確定FlowJo依據(jù)單染對(duì)照進(jìn)行判定。以一個(gè)兩色實(shí)驗(yàn)為例（FL1::CD3-FITC和FL2::CD4-PE），在補(bǔ)償之后，如果單染對(duì)照（比如FITC單染）中FITC陽(yáng)性群和FITC群的中位數(shù)（MedianofFL2::CD4-PE）一致，說明補(bǔ)償準(zhǔn)確。詳細(xì)內(nèi)容請(qǐng)參考博文：如何確定流式分析中熒光補(bǔ)償雙指數(shù)轉(zhuǎn)換中的3個(gè)參數(shù)分別表示什WidthBasis：寬度基底，為負(fù)值。在圖形顯示效果上反映了壓縮的程度。在Logile軸中，-10表示“-101~0段”以及“0~101段”以線性形式顯示，-100表示“-102~0段”以及“0~102段”以線性形式顯示，如下圖：左圖中WidthBass為-10，右圖中為-100Exranegatvedecades：附加負(fù)十進(jìn)位，即在坐標(biāo)軸中增加的負(fù)數(shù)段的數(shù)目?！?”表示增加1個(gè)負(fù)十進(jìn)位段，如下圖：紅色方框中的部分為在坐標(biāo)軸上增加1個(gè)負(fù)十進(jìn)位段 decades：正十進(jìn)位，表示正十進(jìn)位的數(shù)目。左圖中Positivedecades為4，表示有4個(gè)正十進(jìn)位段：101~102、102~103、103~104、104~105增大 Decades，能在二維圖中以更大的空間顯示低位段（0~101）的數(shù)CellRMSFlowJo沒有給出一個(gè)確定的RMS值范圍來判斷周期分析結(jié)果是否可用。RMS反映的是FlowJo擬合結(jié)果和實(shí)際數(shù)據(jù)的吻合程度，吻合得越好，RMS值越小。在進(jìn)行周期分析的時(shí)候，如果數(shù)據(jù)比較好，F(xiàn)lowJo能自動(dòng)擬合得到一個(gè)好的周期擬合結(jié)果，RMS值很小。如果數(shù)據(jù)不是很理想，需要不斷更改限制條件，使RMS值更小，模型擬合得更好。RMS是對(duì)同一個(gè)數(shù)據(jù)的不同擬合情況進(jìn)行比較的，數(shù)值越小則擬合越好，不能用來比較不同數(shù)據(jù)間擬合的好壞。CVFlowJo擬合得到的CV值明顯高于CV為變異系數(shù)，反映的是峰的寬度。ModFit在呈現(xiàn)數(shù)據(jù)的時(shí)候，是將熒光強(qiáng)度的范圍歸并為256個(gè)Channel，因此在分析任何數(shù)據(jù)的時(shí)候，其坐標(biāo)軸的范圍均為256。Flowo則是呈現(xiàn)實(shí)際的熒光強(qiáng)度，坐標(biāo)軸的范圍依據(jù)具體數(shù)據(jù)的熒光強(qiáng)度來確定，大于256。因此FlowJo得到的CV值高于ModFit。下圖中為同一個(gè)數(shù)據(jù)分別用ModFit和FlowJo進(jìn)行分析得到的結(jié)果，左邊為ModFit，右邊為FlowJoFlowJoFlowJo的周期模塊是專門用來分析細(xì)胞周期的，得到細(xì)胞周期各個(gè)時(shí)期的比例。分析細(xì)胞凋亡一般需要采用特定的方法，比如AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)記法，用四分門設(shè)門方法來界定出凋亡細(xì)胞。具體內(nèi)容請(qǐng)參考博文：FlowJoFlowJoFlowJo在分析細(xì)胞周期的時(shí)候，能夠得到某一個(gè)細(xì)胞周期各個(gè)時(shí)期的比例。如果樣本中包含有多個(gè)不同的倍體（比如同時(shí)含有二倍體以及異倍體），該樣本中含有多個(gè)細(xì)胞周期，則需要借助其他的分析工具來分析?！皠?chuàng)建門”創(chuàng)建門之前，計(jì)算細(xì)胞周期各個(gè)時(shí)期的比例是根據(jù)擬合方程計(jì)算出來的。左圖為創(chuàng)建門之前的周期圖，其中G1期與S期有相交部分，對(duì)于相交的部分，是根據(jù)方程計(jì)算出其屬于G1期的可能性有多少，屬于S期的可能性有多少，然后再計(jì)算出G1期細(xì)胞所占的總的比例。創(chuàng)建門之后，如右圖，G1期、S期、G2期之間沒有相交的部分，而是硬性地設(shè)了一個(gè)門，明確規(guī)定出G1期、S期和G2期的范圍。因此，創(chuàng)建門之后，細(xì)胞周期各個(gè)時(shí)期的百分比會(huì)發(fā)生變化。如果周期分析的目的只是為了計(jì)算出細(xì)胞周期各個(gè)時(shí)期的比例，則不需要“創(chuàng)建門”如果周期分析之后，需要界定出G1期、S期、G2期的細(xì)胞，并對(duì)某個(gè)時(shí)期比如G1期的細(xì)胞做進(jìn)一步分析，則需要“門”界定出各個(gè)時(shí)期的細(xì)胞。關(guān)于周期分析的內(nèi)容，請(qǐng)參考博文：FlowJo軟件分析細(xì)增殖分析章時(shí)采用哪個(gè)參增殖指數(shù)和指數(shù)的定義及其區(qū)別和關(guān)增殖指數(shù)（ProliferationIndex）：次數(shù)的總和除以發(fā)生過增殖的親代細(xì)胞數(shù)目指數(shù)（DivisionIndex）：次數(shù)的總和除以增殖發(fā)生前的細(xì)胞總數(shù)為什么默認(rèn)的增殖峰的最大值為根據(jù)以往的研究結(jié)果，在CFSE法分析細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)中，可分辨出的最多的增殖峰的數(shù)目為8本本 地址HYPE