免疫學(xué)檢測及相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)

免疫學(xué)檢測及相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)第一頁，共五十六頁，2022年，8月28日

免疫學(xué)檢測是應(yīng)用免疫學(xué)理論設(shè)計(jì)的一系列測定抗原、抗體、免疫細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子的實(shí)驗(yàn)手段及分子生物學(xué)技術(shù)在免疫學(xué)研究中的應(yīng)用。

免疫學(xué)技術(shù)的應(yīng)用極為廣泛,疾病的診斷、療效評價(jià)及理論研究等。

第二頁，共五十六頁，2022年，8月28日第一節(jié)免疫學(xué)檢測原理細(xì)胞水平檢測分子水平檢測基因水平檢測第三頁，共五十六頁，2022年，8月28日一、免疫細(xì)胞的檢測

對機(jī)體參與免疫應(yīng)答的細(xì)胞進(jìn)行分離、純化、鑒定、計(jì)數(shù)及功能測定。第四頁，共五十六頁，2022年，8月28日

(一)免疫細(xì)胞分離與純化第五頁，共五十六頁，2022年，8月28日(1)抗凝靜脈血(2)加等量NS(4)密度梯度離心血漿分離液RBCPBMCPMN(3)混勻后，緩慢加于分離液上第六頁，共五十六頁，2022年，8月28日利用表面標(biāo)志分離淋巴細(xì)胞亞群第七頁，共五十六頁，2022年，8月28日流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry,FCM)FCM是將免疫熒光技術(shù)應(yīng)用于流式細(xì)胞儀，對單個(gè)細(xì)胞的表面標(biāo)志（抗原或受體）進(jìn)行快速、精確的分析和自動檢測，并將不同類型的細(xì)胞分選收集。FCM還可對同一細(xì)胞的多種參數(shù)（如DNA、RNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞體積等）進(jìn)行多信息分析，為當(dāng)代生命科學(xué)研究領(lǐng)域中廣泛使用的一項(xiàng)新技術(shù)。第八頁，共五十六頁，2022年，8月28日流式細(xì)胞儀工作原理第九頁，共五十六頁，2022年，8月28日FACS細(xì)胞分選第十頁，共五十六頁，2022年，8月28日FACS技術(shù)分析第十一頁，共五十六頁，2022年，8月28日用抗IgM單抗分離B細(xì)胞克隆第十二頁，共五十六頁，2022年，8月28日RemovalofTcellsfrommarrowgraft

MagnetMagneticantibodies第十三頁，共五十六頁，2022年，8月28日(二)免疫細(xì)胞功能測定

1.T細(xì)胞功能測定

(1)細(xì)胞增殖(轉(zhuǎn)化)試驗(yàn)：可分為非特異性絲裂原和特異性抗原兩類。*絲裂原主要有PHA、ConA和PWM；*抗原刺激物有破傷風(fēng)類毒素、PPD和白色念珠菌等；*同種MHC及抗CD3單抗等*腫瘤細(xì)胞-自體淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)第十四頁，共五十六頁，2022年，8月28日淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)（形態(tài)學(xué)示意圖）原理：人T細(xì)胞表面有PHA或ConA受體，T細(xì)胞在體外受PHA或ConA的刺激后能轉(zhuǎn)化為體積較大、代謝旺盛、且能進(jìn)行分裂的淋巴細(xì)胞，以此測定T細(xì)胞的功能。

PHA刺激48~72小時(shí)第十五頁，共五十六頁，2022年，8月28日培養(yǎng)液3H-TdRPHA淋巴細(xì)胞全血分層液離心過濾測量放射性淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)（3H-TdR摻入法）示意圖第十六頁，共五十六頁，2022年，8月28日靶細(xì)胞51Cr洗滌去除游離的51Cr效應(yīng)細(xì)胞測量上清液中釋放的51Cr混合培養(yǎng)4-6小時(shí)⑵細(xì)胞毒試驗(yàn)（51Cr釋放法）第十七頁，共五十六頁，2022年，8月28日(3)T細(xì)胞功能的體內(nèi)檢測法

*移植物抗宿主反應(yīng)(GVHR)*遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)第十八頁，共五十六頁，2022年，8月28日2.B細(xì)胞功能測定(1)B細(xì)胞增殖(轉(zhuǎn)化)試驗(yàn)(2)溶血空斑形成試驗(yàn)(3)反向溶血空斑試驗(yàn)(4)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(ELISPOT):

一種可檢測抗體分泌細(xì)胞，又可測定抗體分泌量的體外實(shí)驗(yàn)方法。

第十九頁，共五十六頁，2022年，8月28日溶血空斑實(shí)驗(yàn)第二十頁，共五十六頁，2022年，8月28日ELISPOT實(shí)驗(yàn)①

穩(wěn)定、特異，且抗原用量少②可同時(shí)檢測不同抗原誘導(dǎo)的抗體分泌，并可定量檢測③可檢測組織切片中分泌抗體的單個(gè)細(xì)胞第二十一頁，共五十六頁，2022年，8月28日3.NK細(xì)胞活性測定

(1)形態(tài)學(xué)檢查法(2)放射性核素釋放法：用放射性核素(51Cr、125I－UdR)標(biāo)記靶細(xì)胞(3)酶釋放法：測定靶細(xì)胞膜受損后從胞漿內(nèi)釋放至介質(zhì)中的乳酸脫氫酶(LDH)活性(4)化學(xué)發(fā)光法(5)流式細(xì)胞術(shù)

第二十二頁，共五十六頁，2022年，8月28日

4．吞噬細(xì)胞功能測定(1)中性粒細(xì)胞趨化功能測定濾膜滲透法(Boyden小室法)(2)中性粒細(xì)胞吞噬、殺菌功能測定

1)顯微鏡檢法

2)NBT試驗(yàn)

3)化學(xué)發(fā)光測定法(3)巨噬細(xì)胞吞噬功能測定(4)巨噬細(xì)胞細(xì)胞毒測定第二十三頁，共五十六頁，2022年，8月28日免疫球蛋白的測定補(bǔ)體測定細(xì)胞因子及其受體檢測黏附分子的檢測二、免疫分子的檢測第二十四頁，共五十六頁，2022年，8月28日第二十五頁，共五十六頁，2022年，8月28日第二十六頁，共五十六頁，2022年，8月28日第二十七頁，共五十六頁，2022年，8月28日第二十八頁，共五十六頁，2022年，8月28日第二十九頁，共五十六頁，2022年，8月28日細(xì)胞因子及其受體的檢測

生物學(xué)測定法免疫學(xué)檢測法分子生物學(xué)測定法細(xì)胞因子受體檢測的基本技術(shù)第三十頁，共五十六頁，2022年，8月28日

根據(jù)細(xì)胞因子對特定的生物學(xué)活性,應(yīng)用相應(yīng)的指示系統(tǒng),同時(shí)與標(biāo)準(zhǔn)品對比測定,從而得知樣品中細(xì)胞因子的活性水平,一般以活性單位(U/ml)表示。生物學(xué)測定法第三十一頁，共五十六頁，2022年，8月28日1、促進(jìn)細(xì)胞增殖和增殖抑制法

3H-TdR摻入法、比色法（MTT、WST-1）染色法直接計(jì)數(shù)法第三十二頁，共五十六頁，2022年，8月28日2、細(xì)胞毒活性測定法

51Cr釋放比色法（MTT、WST-1）3、集落形成法4、細(xì)胞病變抑制法5、趨化活性測定法第三十三頁，共五十六頁，2022年，8月28日

免疫學(xué)檢測的基本原理是將細(xì)胞因子作為抗原進(jìn)行定量檢測。如免疫斑點(diǎn)法、ELISA法、RIA法和免疫印跡法等均已用于細(xì)胞因子的檢測。某些細(xì)胞因子含量甚微的樣品(如腦脊液)可用免疫聚合酶鏈反應(yīng)(immuno-PCR)進(jìn)行檢測。免疫學(xué)檢測法第三十四頁，共五十六頁，2022年，8月28日分子生物學(xué)測定法

RNA印跡法、核酸酶保護(hù)分析、原位雜交、PCR和RealTimePCR等。亦可通過檢測細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的基因組成或mRNA量，推算出細(xì)胞因子的合成量。

第三十五頁，共五十六頁，2022年，8月28日CKR檢測的基本技術(shù)

細(xì)胞因子的廣泛生物學(xué)活性是通過與各自相應(yīng)的受體結(jié)合而發(fā)揮的。因此細(xì)胞因子受體的檢測與細(xì)胞因子檢測一樣，已成為基礎(chǔ)理論和臨床免疫學(xué)研究的一個(gè)重要內(nèi)容。第三十六頁，共五十六頁，2022年，8月28日粘附分子的檢測

某些粘附分子除表達(dá)于細(xì)胞膜表面外，還以可溶性形式存在于體液中。粘附分子的檢測方法目前大多采用免疫學(xué)技術(shù)檢查其在細(xì)胞膜上的分布和測定某些樣品中的含量。第三十七頁，共五十六頁，2022年，8月28日三、免疫相關(guān)基因檢測

*包括各種類型的雜交技術(shù)，如轉(zhuǎn)印雜交、斑點(diǎn)雜交、原位雜交等以及PCR技術(shù)等。*雜交技術(shù)主要工具是核酸探針，它是指一段用放射性核素或其他標(biāo)記物(生物素、熒光素、地高辛等)標(biāo)記，并與目的基因互補(bǔ)的DNA片段或單鏈DNA、RNA。分為cDNA探針、寡核苷酸探針、基因組DNA探針及RNA探針等。第三十八頁，共五十六頁，2022年，8月28日㈠細(xì)胞因子基因組DNA或mRNA的檢測

1.Northern雜交分析

2.斑點(diǎn)及狹縫印跡雜交:將DNA變性后直接點(diǎn)樣于硝酸纖維膜上再進(jìn)行雜交

3.原位雜交法

4.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雜交分析：將細(xì)胞因子的mRNA經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用特異性細(xì)胞因子引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過Southernblot后，再用標(biāo)記探針檢測特異細(xì)胞因子DNA的水平。

5．Southern印跡雜交

第三十九頁，共五十六頁，2022年，8月28日㈡BCR及TCR克隆性基因重排分析1．Southern印跡雜交法：僅適用于科研，而不適用于臨床診斷。2.PCR擴(kuò)增技術(shù):

第四十頁，共五十六頁，2022年，8月28日免疫印跡法示意圖第四十一頁，共五十六頁，2022年，8月28日

PCR擴(kuò)增技術(shù):正常多克隆淋巴細(xì)胞群DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物含有不同長度的片段，電泳檢查呈現(xiàn)彌漫涂片狀結(jié)構(gòu)或多條帶。而單克隆性基因重排經(jīng)PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)生明顯相同長度的片段，電泳呈現(xiàn)單一緊密折帶狀結(jié)構(gòu)。應(yīng)用PCR擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行基因診斷具有特異、敏感(1/104~1/105克隆性細(xì)胞)、快速(24h可完成)等優(yōu)點(diǎn)。用于惡性淋巴瘤和白血病等的臨床診斷以及白血病治療后微小殘留病灶的檢測。

第四十二頁，共五十六頁，2022年，8月28日㈢HLA基因分型技術(shù)1．序列特異性寡核苷酸探針PCR(PCR-SSOP)或PCR-ASO:應(yīng)用最多的一種簡單、快速而又精確的HLA-Ⅱ類抗原分型方法，能鑒定所有已知序列的HLA-DR、DQ、DP等位基因，精確地分析DNA的多態(tài)性。2．限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)：此項(xiàng)技術(shù)特別適用于個(gè)別標(biāo)本和小樣本的檢測。3．單鏈構(gòu)象多態(tài)性PCR(PCR-SSCP)：藉此可鑒別編碼HLA-Ⅱ類抗原基因的多態(tài)性。應(yīng)用PCR-SSCP可以直接比較供、受體之間HLA-Ⅱ類基因是否完全一致，且可精確到12個(gè)堿基之差，具有相對簡捷而精確的特點(diǎn)。在異基因骨髓移植的配型中已初步應(yīng)用于臨床。第四十三頁，共五十六頁，2022年，8月28日4．序列特異性引物PCR技術(shù)(PCR-SSP)：該法操作簡單、快速、實(shí)驗(yàn)結(jié)果容易判斷，雜合子也很易檢出。不足之處在于，為檢出所有的等位基因必須用多個(gè)引物進(jìn)行擴(kuò)增。5．指紋圖譜(PCR-fingerprinting)技術(shù)：進(jìn)行HLA-基因分型鑒定時(shí)，將供、受體的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物混合，電泳后得出一指紋圖，再與二者各自的PCR指紋圖譜進(jìn)行比較，從中選擇出指紋圖一致的供、受體進(jìn)行移植。*PCR指紋圖譜在選擇非親緣關(guān)系的供、受體進(jìn)行骨髓和器官移植配型時(shí)，可以節(jié)省大量時(shí)間。6.SNP(單個(gè)核苷酸多態(tài)性)分析第四十四頁，共五十六頁，2022年，8月28日四、免疫標(biāo)記技術(shù)

免疫熒光技術(shù)放射免疫分析法酶免疫技術(shù)發(fā)光免疫測定第四十五頁，共五十六頁，2022年，8月28日第四十六頁，共五十六頁，2022年，8月28日

Ag*AbAg

標(biāo)記抗原特異性抗體待測抗原(Ag*-Ab)+(Ag-Ab)抗原抗體復(fù)合物分離Ag*-Ab和游離Ag*從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀知含量測定Ag*-Ab和/或游離Ag*放射性放射免疫測定法(RIA)示意圖第四十七頁，共五十六頁，2022年，8月28日第四十八頁，共五十六頁，2022年，8月28日

形態(tài)學(xué)方法普通光學(xué)顯微鏡檢測法熒光顯微鏡檢測法材料：①石蠟切片;②冰凍切片;③細(xì)胞學(xué)涂方法:電鏡觀察凋亡小體

生化學(xué)方法免疫學(xué)方法末端標(biāo)記法細(xì)胞凋亡的檢測第四十九頁，共五十六頁，2022年，8月28日

形態(tài)學(xué)方法：①PI染液：碘化丙啶(propidiumiodide,PI)；核紅色②DAPI染液；核藍(lán)白色③AO染液：核黃綠色*凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)核濃縮,染色加深,凋亡小體。第五十頁，共五十六頁，2022年，8月28日凋亡的形態(tài)學(xué)檢測U937Cell（DAP1染色）大鼠結(jié)腸組織（AZON染色）第五十一頁，共五十六頁，2022年，8月28日熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡第五十二頁，共五十六頁，2022年，8月28日

生化學(xué)方法電泳法

DNALadder電泳圖譜第五十三頁，共五十六頁，2022年，8月28日原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)

(TdT或TUNEL)

凋亡細(xì)胞由于內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活,核DNA被切割成許多雙鏈DNA片段以及高分子量