克隆基因的表達與產(chǎn)物純化外源基因在原核細胞中的表達

克隆基因的表達與產(chǎn)物純化外源基因在原核細胞中的表達第一頁，共九十四頁，2022年，8月28日一、原核生物基因表達的特點1.只有一種RNA多聚酶識別原核細胞的啟動子，催化所有的RNA合成。2.以操縱子為單位數(shù)個相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因與其調(diào)控區(qū)結(jié)合形成一個表達的協(xié)同單位。第二頁，共九十四頁，2022年，8月28日3.轉(zhuǎn)錄和翻譯偶聯(lián)、連續(xù)進行。第三頁，共九十四頁，2022年，8月28日第四頁，共九十四頁，2022年，8月28日4.不含內(nèi)含子，缺乏轉(zhuǎn)錄后的加工系統(tǒng)。5.調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平上。6.mRNA的核糖體結(jié)合位點。Shine-Dalgarno（SD）sequence:含有一個啟始密碼子和一段同核糖體16SRNA3’末端堿基互補的序列，叫Shine-Dalgarno（SD）序列。第五頁，共九十四頁，2022年，8月28日二、原核表達系統(tǒng)的注意事項1.外源基因不能帶有內(nèi)含子。2.必須用cDNA3.不能直接用真核基因組DNA。4.必須利用原核細胞的調(diào)控原件（啟動子等）5.防止外源基因產(chǎn)物對宿主細胞的毒害。第六頁，共九十四頁，2022年，8月28日三、原核生物基因表達的調(diào)控1.啟動子是DNA上的能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列。（1）啟動子序列大腸桿菌的所有啟動子中都有兩段一致順序（consensussequence）。-35Box和-10Box第七頁，共九十四頁，2022年，8月28日第八頁，共九十四頁，2022年，8月28日①-35boxRNA聚合酶δ亞基的識別位點。

5’

–TTGACA-3’②-10box（PribnowBox）

5’–TATAAT-3’5’TTGACATATAAT

轉(zhuǎn)錄起始位點17bp核糖體結(jié)合位點第九頁，共九十四頁，2022年，8月28日第十頁，共九十四頁，2022年，8月28日（2）翻譯的起始位點①核糖體結(jié)合位點（RBS）ribosomebindingsite1）Shine-Dalgarno（SD）sequence：第十一頁，共九十四頁，2022年，8月28日2）起始密碼：位于SD序列下游。AUG(91%)GUG(8%)UUG(1%)第十二頁，共九十四頁，2022年，8月28日2.RNA多聚酶大腸桿菌只有一種類型的RNA多聚酶轉(zhuǎn)錄tRNA，rRNA和mRNA。結(jié)構(gòu)全酶是一個5聚體，含有兩個α小亞基，和2兩個大亞基（β和β′），一個σ亞基。第十三頁，共九十四頁，2022年，8月28日3.轉(zhuǎn)錄終止子在表達載體克隆位點的下游一般設(shè)計一段轉(zhuǎn)錄終止子。啟動子操縱子S-D序列目的基因終止子內(nèi)終止子intrinsicterminator：E.coli中促使轉(zhuǎn)錄終止的DNA位置有一段反向回文順序，其后緊接一串A，稱為內(nèi)終止子，形成終止信號。第十四頁，共九十四頁，2022年，8月28日原因：①莖環(huán)結(jié)構(gòu)②多聚A/U反向回文順序被轉(zhuǎn)錄后，立即形成一個莖環(huán)結(jié)構(gòu)，使轉(zhuǎn)錄物與模板之間配對的堿基數(shù)降低，整個減弱了RNA與DNA的互作。由于莖環(huán)3’段緊接一串A/U的配對，穩(wěn)定性比較差，有利于轉(zhuǎn)錄物脫落而不利于轉(zhuǎn)錄延續(xù)。第十五頁，共九十四頁，2022年，8月28日第十六頁，共九十四頁，2022年，8月28日第十七頁，共九十四頁，2022年，8月28日4.翻譯終止密碼5.翻譯增強子大腸桿菌偏愛UAAU。一般安置上全部的三個終止密碼防止核糖體跳躍（skipping）。Translationenhancer能夠顯著增強外源基因在大腸桿菌細胞中的表達效率的特殊序列。T7噬菌體基因10前導(dǎo)序列（簡稱g10-L序列）;大腸桿菌atpE基因mRNA5’-UTR中富含U的區(qū)段。第十八頁，共九十四頁，2022年，8月28日6.基因工程常用的原核啟動子（1）最佳啟動子必須具備的條件①必須是一種強啟動子能使外源基因的蛋白產(chǎn)量達到細胞總蛋白的10%-30%以上。②應(yīng)呈現(xiàn)低水平的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄③應(yīng)是可誘導(dǎo)型的便于表達毒性蛋白等。用溫度或化學(xué)試劑誘導(dǎo)。第十九頁，共九十四頁，2022年，8月28日（2）乳糖啟動子lac來自大腸桿菌的乳糖操縱子。用乳糖或其類似物IPTG充當誘導(dǎo)物，與阻遏蛋白結(jié)合，解除抑制。Plac

O

目的基因第二十頁，共九十四頁，2022年，8月28日調(diào)控區(qū)CAP結(jié)合位點啟動序列操縱序列結(jié)構(gòu)基因Z：β-半乳糖苷酶Y：透酶A：乙?；D(zhuǎn)移酶ZYAOPDNA第二十一頁，共九十四頁，2022年，8月28日mRNA阻遏蛋白IDNAZYAOPpol沒有乳糖存在時阻遏基因第二十二頁，共九十四頁，2022年，8月28日mRNA阻遏蛋白有乳糖存在時IDNAZYAOPpol啟動轉(zhuǎn)錄mRNA乳糖半乳糖β-半乳糖苷酶第二十三頁，共九十四頁，2022年，8月28日第二十四頁，共九十四頁，2022年，8月28日第二十五頁，共九十四頁，2022年，8月28日第二十六頁，共九十四頁，2022年，8月28日①乳糖操縱子控制區(qū)的結(jié)構(gòu)“可移動的lac啟動子小片斷”組成：阻遏物作用區(qū)CAP作用區(qū)RNA聚合酶作用區(qū)長度：203bp的HaeIII片斷（包括β-半乳糖苷酶的前8個密碼）。第二十七頁，共九十四頁，2022年，8月28日大腸桿菌乳糖操縱子控制區(qū)的結(jié)構(gòu)第二十八頁，共九十四頁，2022年，8月28日第二十九頁，共九十四頁，2022年，8月28日第三十頁，共九十四頁，2022年，8月28日第三十一頁，共九十四頁，2022年，8月28日（3）色氨酸啟動子trp來自大腸桿菌的色氨酸操縱子。第三十二頁，共九十四頁，2022年，8月28日第三十三頁，共九十四頁，2022年，8月28日第三十四頁，共九十四頁，2022年，8月28日第三十五頁，共九十四頁，2022年，8月28日（4）PL和PR啟動子第三十六頁，共九十四頁，2022年，8月28日第三十七頁，共九十四頁，2022年，8月28日第三十八頁，共九十四頁，2022年，8月28日第三十九頁，共九十四頁，2022年，8月28日第四十頁，共九十四頁，2022年，8月28日四、外源蛋白在大腸桿菌中的表達部位1.細胞質(zhì)中表達包涵體（inclusionbody）是存在于細胞質(zhì)中的一種不溶性蛋白質(zhì)聚集折疊而成的晶體結(jié)構(gòu)物。形成原理未知。第四十一頁，共九十四頁，2022年，8月28日①優(yōu)點②缺點使重組蛋白易于分離、免受蛋白酶降解、不損害寄主細胞回收的蛋白生物活性差。例：在大腸桿菌細胞內(nèi)表達人生長激素（humangrowthhormone,hGH）。第四十二頁，共九十四頁，2022年，8月28日第四十三頁，共九十四頁，2022年，8月28日第四十四頁，共九十四頁，2022年，8月28日2.周質(zhì)中表達（1）周質(zhì)（periplasm）格蘭氏陰性大腸桿菌位于內(nèi)膜和外膜之間的細胞結(jié)構(gòu)部分。蛋白質(zhì)從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到周質(zhì)的復(fù)雜機理目前不完全清楚優(yōu)點：容易被濃縮和純化、有利于正確折疊、被降解的少。第四十五頁，共九十四頁，2022年，8月28日①常用的原核信號肽（2）信號肽（signalpeptide）能帶領(lǐng)蛋白穿過膜到達周質(zhì)。但以后需要正確切割掉。一般位于N端。①大腸桿菌的信號肽：phoA、OmpA、OmpT、OmpF、LamB、β-內(nèi)酰胺酶（lactamase）、腸毒素（enterotoxin）ST-II、LT-B等第四十六頁，共九十四頁，2022年，8月28日②金黃色葡萄球菌的蛋白A。③枯草芽孢桿菌的內(nèi)切葡聚糖酶（endoglucanase）。④胡蘿卜歐氏桿菌的PelB蛋白。②真核信號肽也能在細菌中起作用。鼠源RNase、人生長激素信號肽。第四十七頁，共九十四頁，2022年，8月28日3.胞外表達使在大腸桿菌細胞中表達的外源蛋白分泌到細胞外的培養(yǎng)基中。用溶血素（hemolysin）基因構(gòu)建分泌性融合蛋白；或與細菌素釋放蛋白（bacteriocinreleaseprotein)共表達。由于需要穿過兩層膜，大腸桿菌只能分泌極少的蛋白質(zhì)到培養(yǎng)基中，效果都不太理想。第四十八頁，共九十四頁，2022年，8月28日第四十九頁，共九十四頁，2022年，8月28日五、幾種類型的原核表達載體1.非融合型表達載體載體表達出的外源基因蛋白質(zhì)不與細菌的任何蛋白質(zhì)融合在一起。S-D序列ATG-外源基因-TAG優(yōu)點：產(chǎn)物結(jié)構(gòu)接近于真核細胞體內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。缺點：容易被宿主菌的蛋白酶所破壞。第五十頁，共九十四頁，2022年，8月28日pKK223-3載體哈佛大學(xué)Gilbert實驗室建立的。表達能力強。組成結(jié)構(gòu)：①強啟動子:tac（trp-lac）:trp的-35區(qū)lacUV5的-10區(qū)②操縱基因：乳糖操縱子系統(tǒng)。lac操縱基因舉例第五十一頁，共九十四頁，2022年，8月28日③調(diào)節(jié)基因：宿主菌染色體上的乳糖操縱子系統(tǒng)。如JM105菌。

LacI④終止子：rrnB的強終止子rrnB強終止子⑤S-D序列和插入位點區(qū)：S-D插入位點區(qū)第五十二頁，共九十四頁，2022年，8月28日⑥載體的其余部分：來自pBR322質(zhì)粒。⑦表達誘導(dǎo)物：IPTG（乳糖的類似物，不會被降解）宿主lacItacPLacOS-D插入位點區(qū)rrnBT阻遏物IPTG第五十三頁，共九十四頁，2022年，8月28日第五十四頁，共九十四頁，2022年，8月28日2.分泌型表達載體載體表達出的外源蛋白質(zhì)與細菌的分泌信號肽連在一起，可被宿主菌分泌到細胞周質(zhì)中。如：pINIII系列：pINIII-comA1,pINIII-comA2,pINIII-comA3,第五十五頁，共九十四頁，2022年，8月28日組成結(jié)構(gòu)①強啟動子：Ipp（脂蛋白基因啟動子）和lacUV5啟動子。②調(diào)節(jié)基因：lacI③S-D序列和起始密碼ATG。④分泌信號肽：大腸桿菌外膜蛋白基因ompa。⑤插入位點區(qū)（多克隆位點）。IpplacPlacOS-D/ATG

ompa

插入位點第五十六頁，共九十四頁，2022年，8月28日第五十七頁，共九十四頁，2022年，8月28日3.融合蛋白表達載體系統(tǒng)—pGEX系列表達出的外源基因產(chǎn)物蛋白是與質(zhì)粒載體上的菌體蛋白連接在一起的。(1)優(yōu)點(2)組成結(jié)構(gòu)便于融合蛋白的分離和純化。①啟動子：tac②操縱基因：lacP③調(diào)節(jié)基因：lacI④S-D序列第五十八頁，共九十四頁，2022年，8月28日⑤ori：pBR322ori⑥融合肽：GST(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶）(3)產(chǎn)物提純GST融合蛋白用GlutathioneSepharose親和層析柱分離純化。lacItaclacPlacOS-D/ATG

GST

插入位點TGA第五十九頁，共九十四頁，2022年，8月28日(4)產(chǎn)物分離用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白從GST上切下來。第六十頁，共九十四頁，2022年，8月28日第六十一頁，共九十四頁，2022年，8月28日第六十二頁，共九十四頁，2022年，8月28日(5)其他融合蛋白系統(tǒng)His-tag（組氨酸標簽）：在外源多肽的N端或C端接上6個組氨酸（His）。His-tag能與Ni2+柱結(jié)合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脫下來，可以純化蛋白質(zhì)。第六十三頁，共九十四頁，2022年，8月28日第六十四頁，共九十四頁，2022年，8月28日六、影響外源基因表達效率的因素1.啟動子的結(jié)構(gòu)對表達效率的影響(1)一致順序第六十五頁，共九十四頁，2022年，8月28日越接近一致順序，啟動子越強。(3)-35區(qū)和-10區(qū)的堿基順序(2)-35區(qū)與-10區(qū)之間的距離間隔為17bp時，啟動子最強。第六十六頁，共九十四頁，2022年，8月28日2.轉(zhuǎn)譯起始序列對表達效率的影響(1)S-D序列5’-AGGAGGU-3’S-D序列后面的4個堿基：如果是A（T）,翻譯效率最高；如果是G（C）,效率只有50%或25%。第六十七頁，共九十四頁，2022年，8月28日(2)起始密碼AUGAUG左側(cè)的三個堿基也有影響。β-半乳糖苷酶的mRNA中：AUG左側(cè)如果是UAU或CUU時，最為有效；如果是UUC、UCA或AGG時下降20倍。第六十八頁，共九十四頁，2022年，8月28日(3)其它多順反子的mRNA與核糖體的結(jié)合位點有一個或幾個終止密碼。噬菌體外殼蛋白或核糖體蛋白mRNA的核糖體結(jié)合位點有多個U。第六十九頁，共九十四頁，2022年，8月28日3.啟動子與外源基因之間的距離第七十頁，共九十四頁，2022年，8月28日4.轉(zhuǎn)錄終止區(qū)對表達效率的影響5.載體拷貝數(shù)及穩(wěn)定性對表達效率的影響6.外源蛋白在菌體中的穩(wěn)定性對表達效率的影響轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的存在保證載體不會轉(zhuǎn)錄非必須基因，不必浪費源量和能量、不會干擾正常的表達。增加載體的拷貝數(shù)會增加轉(zhuǎn)錄出的mRNA數(shù)目。增加表達效率。但過度的外源基因的表達會影響宿主的正常生長。第七十一頁，共九十四頁，2022年，8月28日七、提高表達水平常用的方法1.選擇強啟動子序列，如

tac

等2.調(diào)整S-D序列與AUG堿基的距離3.改變起始密碼下面的幾組密碼子一般為5-9bp。距離過長或過短都影響真核基因的表達。根據(jù)不同的啟動子選擇不同的距離。能提高翻譯的起始效率。第七十二頁，共九十四頁，2022年，8月28日5.減輕宿主細胞的代謝負荷4.增加mRNA的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性在外源基因的下游插入“重復(fù)性基因外回文序列”能防止mRNA受到3’→5’外切酶的攻擊。合理地調(diào)節(jié)代謝負荷與外源基因高效表達的關(guān)系。（1）誘導(dǎo)表達將宿主生長代謝與外源基因表達分開。一般采用溫度誘導(dǎo)或藥物誘導(dǎo)。第七十三頁，共九十四頁，2022年，8月28日λPL啟動子是溫度誘導(dǎo)型32℃cI857(cI的溫度敏感突變等位基因)阻遏物有活性，抑制λPL啟動子，外源基因不表達，宿主大量生長。42℃:cI857阻遏物失活，PL啟動子啟動，外源基因高水平表達，宿主生長受到限制。cI857PL

PO

外源基因第七十四頁，共九十四頁，2022年，8月28日λPL啟動子是藥物誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)基因lacI（位于宿主基因組內(nèi)或載體上）始終產(chǎn)生阻遏物。無IPTG:阻遏物與lac操縱基因結(jié)合，抑制外源基因轉(zhuǎn)錄。宿主大量生長。有IPTG:阻遏物與IPTG結(jié)合，lac操縱基因解放，外源基因大量轉(zhuǎn)錄。宿主生長受抑制。第七十五頁，共九十四頁，2022年，8月28日（2）表達載體誘導(dǎo)復(fù)制將宿主的生長與載體的復(fù)制分開。當需要宿主大量生長時，抑制載體質(zhì)粒的復(fù)制。當宿主大量生長后，再誘導(dǎo)載體質(zhì)粒的復(fù)制，增加拷貝數(shù)。第七十六頁，共九十四頁，2022年，8月28日6.提高表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性防止被宿主的酶降解。（1）設(shè)計成融合蛋白這是避免被降解的最好措施。N末