基因引物設(shè)計(jì)

常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介目錄全長(zhǎng)cDNA克隆引物設(shè)計(jì)染色體步移技術(shù)全長(zhǎng)cDNA克隆

是許多后續(xù)更深入實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)；真核生物mRNA的特征及轉(zhuǎn)錄過(guò)程的了解；全長(zhǎng)cDNA克隆方法：靈活掌握；同源克隆技術(shù)RACE-PCR技術(shù)基因克隆前的準(zhǔn)備工作看有沒(méi)有被別人克隆出來(lái)；查看文獻(xiàn)了解基因的功能及表達(dá)特征；了解該基因可能涉及的工作（如激酶活性的測(cè)定及DNA-蛋白相互作用等），制定計(jì)劃；了解相近物種該基因的信息，以利于擴(kuò)增過(guò)程中預(yù)測(cè)PCR的延伸時(shí)間；同源片段的克隆本實(shí)驗(yàn)室的EST數(shù)據(jù)庫(kù)；NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)；RT-PCR用兼并引物擴(kuò)增同源片段；設(shè)計(jì)兼并引物是重點(diǎn)?。。。?！注意事項(xiàng)：高質(zhì)量的mRNA和高效率的逆轉(zhuǎn)錄；加大引物濃度；選擇mRNA表達(dá)量高的組織做模板；梯度PCR或者降落PCR；巢氏PCR;序列分析；3’RACE:原理：5’RACE原理：注意事項(xiàng)：RNA的完整性；高效的逆轉(zhuǎn)錄酶；多次5’RACE相結(jié)合；應(yīng)用豐度高的組織做模板；長(zhǎng)片段擴(kuò)增應(yīng)用LA-Taq酶；同源克隆方法；用隨機(jī)引物或者OligoT引導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄；序列分析引物設(shè)計(jì)：Primer5.0；一般的序列處理：DNAStar中的Editseq；序列拼接：DNAStar中的Seqman、BL2；序列在線(xiàn)比對(duì)：NCBI-BLAST()；序列多重比對(duì)：Bioedit、ClustalW2()；尋找ORF:Editseq、ORFFinder()；序列作圖：Bioedit、EMBOSS()；構(gòu)建進(jìn)化樹(shù):MEGA4.1；蛋白結(jié)構(gòu)域分析：SMART()；蛋白理化性質(zhì)分析及二、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析：EXPASY()、Psipred()；信號(hào)肽分析：SignalP()；磷酸化位點(diǎn)分析：NetPhos2.0Server()；糖基化位點(diǎn)：NetNGlyc1.0Server()；引物設(shè)計(jì)兼并引物RACE引物熒光定量引物染色體步移引物原核表達(dá)用引物PCR-SSCP引物總原則①引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性。②產(chǎn)物不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。③引物長(zhǎng)度一般在15~30堿基之間。④G+C含量在40%~60%之間。⑤堿基要隨機(jī)分布。⑥引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。⑦引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。⑧引物5′端可以修飾。⑨引物3′端不可修飾。⑩引物3′端要避開(kāi)密碼子的第3位。兼并引物兼并堿基：

M=A/C

R=A/G

W=A/T

S=G/C

Y=C/T

K=G/T

V=A/G/C

H=A/G/T

D=A/G/T

B=G/C/TN=A/G/C/T簡(jiǎn)并度：兼并引物設(shè)計(jì)步驟利用ncbi搜索不同物種中同一目的基因的蛋白或cDNA編碼的氨基酸序列對(duì)所找到的序列進(jìn)行多序列比對(duì)

確定合適的保守區(qū)域

設(shè)計(jì)兼并引物（軟件或者人工）選擇合適的序列進(jìn)行多重比對(duì)；選擇高度保守的序列作為引物；人工設(shè)計(jì)時(shí)要注意引物序列是和原序列相同還是反向互補(bǔ)的；簡(jiǎn)并度不能太高，可用次黃嘌呤代替N；引物的3‘端殘基盡可能使用確定殘基；降落PCR;巢氏PCR;RACE引物各3條重疊的引物，引物之間最好距離100-200bp；若同源片段長(zhǎng)度太短，可先做3’RACE，再做5’RACE；盡量靠近c(diǎn)DNA末端（3’RACE-3’末端；5’RACE-5’末端）；熒光定量引物純化方式：PAGE；產(chǎn)物長(zhǎng)度：80-150bp；TM值:58-62;在編碼區(qū)內(nèi)靠近3’末端處設(shè)計(jì)；高的特異性：測(cè)序及熔解曲線(xiàn)分析；染色體步移引物以DNA為模板設(shè)計(jì)引物；3條重疊引物；高的退火溫度：高于60度；原核表達(dá)用引物會(huì)讀表達(dá)載體圖譜；去除信號(hào)肽序列；根據(jù)目的表達(dá)序列直接取相應(yīng)序列作為引物，注意要不要加終止密碼子；在引物的5’末端加酶切位點(diǎn)和相應(yīng)的保護(hù)堿基，注意方向；選酶切位點(diǎn)：選擇常用的內(nèi)切酶，并看這兩種酶是否可以在統(tǒng)一體系中進(jìn)行雙酶切；PCR-SSCP引物PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度：150-400bp；高的特異性；染色體步移克隆啟動(dòng)子Tail-PCR預(yù)測(cè)