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文檔簡介
實(shí)用第一章 緒 論基因工程(geneticengineering)按照人們預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖,將一種生物的遺傳物質(zhì)繞過有性生殖導(dǎo)入另一種生物中去,使其獲得新的遺傳性狀,形成新的生物類型的基因操作( geneticmanipulation )。基因工程誕生的基礎(chǔ)理論上的三大發(fā)現(xiàn) :DNA是遺傳物質(zhì) 、 DNA雙螺旋模型和半保留復(fù)制機(jī)理、遺傳密碼的破譯和遺傳信息傳遞方式的確定。技術(shù)上的三大發(fā)明:限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)與 DNA的切割 、 DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)與 DNA片段的連接 、基因工程載體的研究和應(yīng)用基因工程研究的主要內(nèi)容基礎(chǔ)研究:基礎(chǔ)研究、克隆載體研究 、受體系統(tǒng)的研究、目的基因的研究、生物基因組學(xué)的研究、應(yīng)用研究基因工程的基本操作程序分離獲得目的基因限制性核酸內(nèi)切酶將切割源 DNA和載體DNA連接酶將外源 DNA和載體連接,組成重組 DNA分子。將重組DNA分子引入受體細(xì)胞帶有重組體的細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增,獲得大量的細(xì)胞繁殖群體篩選和鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)一步研究分析,實(shí)現(xiàn)功能蛋白的表達(dá)第二章 工具酶根據(jù)工具酶催化的反應(yīng)類型分為四大類:①核酸酶,用于切割或降解核酸分子:②連接酶,可以把核酸分子連接起來:③聚合酶,用于核酸分子的擴(kuò)增或拷貝:④修飾酶,能夠給核酸分子添增或除去核甘酸或某些化學(xué)基團(tuán)。常用基因工程工具酶:限制性內(nèi)切酶、甲基化酶、DNA連接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、磷酸激酶和磷酸酶、核酸酶、核酶。一、限制性內(nèi)切酶1.R-M 系統(tǒng):細(xì)菌中存在位點(diǎn)特異性限制酶和特異性甲基化酶,構(gòu)成了寄主控制的限制—修飾系統(tǒng) (R-MRestriction-modificationsystem) 。細(xì)菌R-M系統(tǒng)的限制酶可以降解 DNA,為避免自身 DNA的降解,細(xì)菌可以修飾(甲基化酶)自身 DNA,未被修飾的外來 DNA則會被降解。2. 限制性核酸內(nèi)切酶(限制酶) :在細(xì)胞內(nèi)能夠識別雙鏈 DNA分子中的特定核苷酸序列,并對 DNA分子進(jìn)行切割的一種酶。 有3種限制性核酸內(nèi)切酶,主要應(yīng)用限制性核酸內(nèi)切酶Ⅱ:是具有單一功能的酶,無甲基化作用,輔助因子2+為Mg, 識別特異性序列,在識別序列內(nèi)或附近特異切割。限制性核酸內(nèi)切酶的切割特點(diǎn)①在DNA分子雙鏈的特異性識別序列部位,切割DNA分子,產(chǎn)生鏈的斷裂。識別序列有連續(xù)的(如GATC)和間斷的(如GANTC)兩種,它們都呈回文結(jié)構(gòu)②2個單鏈斷裂部位在DNA分子上的分布,通常不是彼此直接相對。斷裂結(jié)果形成的DNA片段,具有互補(bǔ)的單鏈延伸末端。三種酶切末端:平齊末端、5’粘性末端(如RⅠ)、3’粘性末端(如PstⅠ)Eco同裂酶:來源不同的限制酶識別相同的核苷酸靶序列。產(chǎn)生同樣的切割,形成同樣的末端。同尾酶:來源不同,識別的核苷酸靶序列也不相同,但切割后DNA分子產(chǎn)生的粘性末端相同的限制性核酸內(nèi)切酶。限制性核酸內(nèi)切酶的活性影響因素a底物DNA:DNA純度、DNA濃度([DNA]過大,抑制酶活,影響酶分子擴(kuò)散 )、識別位點(diǎn)及鄰近位點(diǎn)特異性序列 、DNA二級/三級結(jié)構(gòu)(超螺旋 DNA比線狀DNA需酶多)、提取時混入雜質(zhì)可改變識別特異性b反應(yīng)系統(tǒng)因素:緩沖液(無菌、無污染) 、金屬離子(Mg2+)、牛血清蛋白 (BSA是酶穩(wěn)定劑,可避免熱、表面張力、化學(xué)品導(dǎo)致的酶變性。過量 BSA會引起電泳拖尾。 )c星活性(可造成位點(diǎn)切割機(jī)率不等,降解不完全 )5.限制性核酸內(nèi)切酶的應(yīng)用 : 重組DNA前的切割 、構(gòu)建新質(zhì)粒 、構(gòu)建物理圖譜 、DNA分子雜交、用限制性內(nèi)切酶消化受體DNA、制備DNA探針 、亞克隆以用作序列分析 、基因定位,DNA同源性研究文檔實(shí)用6.甲基化酶分兩類: 維持性甲基化酶:用于在新合成的 DNA鏈上進(jìn)行甲基化的酶,甲基化位置與模板鏈上的相同。構(gòu)建性甲基化酶:用于在非甲基化的 DNA鏈上進(jìn)行甲基化的酶。作用:封閉 DNA鏈中的某些識別位點(diǎn),保護(hù)多余的限制性酶切位點(diǎn)。構(gòu)建新的酶切位點(diǎn)7.核酸酶S1核酸酶 :降解單鏈核酸。用于把具粘性末端的 DNA變?yōu)槠烬R末端的 DNA。在DNA部分變性條件下,能在富含 AT區(qū)切斷DNA。切除單鏈中的突出末端和雙鏈中的發(fā)夾結(jié)構(gòu)核酶:具有酶活性的RNA片段,限制性內(nèi)切酶二、DNA連接酶(ligase)能夠催化DNA中相鄰的3’-羥基和5’-磷酸基末端之間形成3′,5′-磷酸二酯鍵的酶+NMN);②激活的機(jī)理:①有ATP(或NAD)提供AMP,形成酶-AMP復(fù)合物,同時釋放出焦磷酸基團(tuán)或煙酰胺單核甘酸(AMP結(jié)合在DNA鏈5`端的磷酸基團(tuán)上,產(chǎn)生含高能磷酸鍵的焦磷酸脂鍵;③與相鄰DNA鏈3`端羥基相連,形成磷酸二脂鍵,并釋放出AMP。DNA連接酶所連接的是DNA分子上相鄰核苷酸之間的切口,能將兩條獨(dú)立的DNA片段連接起來,無法連接缺少核苷酸的裂口和單鏈DNA。TDNA連接酶:可連接帶匹配粘性末端的DNA分子,也可使平端的雙鏈DNA分子相互連接。以ATP作為輔助因子4大腸桿菌DNA連接酶:只能連接帶匹配粘末端的DNA分子和帶有切口的雙鏈DNA分子。以+NAD作為輔助因子三、DNA聚合酶(DNApolymerase)指在DNA(或RNA)模板指導(dǎo)下,以4種脫氧核糖核苷酸(dNTP)為底物,在引物3’–OH末端聚合DNA鏈的一類酶。分類:①依賴于DNA的DNA聚合酶,包括聚合酶Ⅰ、Klenow、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶;②依賴于RNA的DNA聚合酶,逆轉(zhuǎn)錄酶。特點(diǎn):①需模板(DNA或RNA);②需引物;③具有三種酶活性,即5′→3′聚合酶活性;5′→3′外切酶活性和3′→5′外切外切酶活性。1.DNA雜交探針的制備雙鏈的DNA分子DNA酶Ⅰ處理使雙鏈的DNA分子的一條鏈帶有3’-OH末端的單鏈缺口polⅠ的5’-3’核酸外切酶活性從5‘-P移去一個核苷酸polⅠ(5’-3’聚合酶活性)將32P標(biāo)記的核苷酸參入取代被移去的核苷酸(e) 重復(fù)(c)(d) 的步驟,缺口沿 5’-3‘方向移動,形成 32P標(biāo)記的核苷酸合成的 DNA鏈探針:用來探知被測物存在的小 DNA或RNA叫做探針。標(biāo)記物:探針上結(jié)合有易被檢測的化合物稱為標(biāo)記物。分子雜交:探 DNA或RNA與被測物的互補(bǔ)結(jié)合叫做分子雜交( molecularhybridization )切口平移:5′端核苷酸不斷去除,而 3’端核苷酸同時加入,導(dǎo)致斷裂形成的切口沿著 DNA鏈按合成的方向移動。2.DNA聚合酶Ⅰ:5′→3′聚合,3′→5′和5′→3′外切活性Klenow(E.coliDNAPolymeraseⅠ經(jīng)蛋白酶水解的大片段)無引物時3′→5′外切活性,有引物時5′→3′聚合活性用途:填補(bǔ)限制酶的 5′-粘性末端為平齊末端 、3′-末端標(biāo)記.4. T4DNA聚合酶活性:5′→3′聚合活性;3′→5′外切活性,對單鏈活性大于雙鏈 DNA,外切酶活性比 Klenow 大200 倍。無引物時3′→5′外切活性,有引物時 5′→3′聚合活性用途: 填補(bǔ)或標(biāo)記限制酶切后產(chǎn)生的 5′- 粘性末端的 3′-凹缺末端。(同Klenow);3′-粘性末端的標(biāo)記制備 DNA探針,同Klenow 末端標(biāo)記。5.T7DNA聚合酶(測序酶)活性:5′→3′聚合,持續(xù)反應(yīng)時間最長, 所以合成的 DNA鏈長。故在DNA測序中很優(yōu)越。 3′→5′外切,是DNA聚合酶Ⅰ的 1000倍。用途:復(fù)制較長的模板,在測序中可讀出較長的序列文檔實(shí)用用填補(bǔ)或交換反應(yīng)快速進(jìn)行末端標(biāo)記。與T4DNApol一樣,平齊粘性末端。定點(diǎn)突變中互補(bǔ)鏈的合成。修飾的T7DNA聚合酶(測序酶):5′→3′聚合6.TaqDNA:聚合最適溫度為 75-80℃,不具 3′→5′外切酶活性,聚合酶具 5′→3′外切活性 。用途:PCR反應(yīng)。 測序,高溫下進(jìn)行 DNA合成可減少模板二級結(jié)構(gòu)。7.反轉(zhuǎn)錄酶:5’-3’聚合活性, RNAseH用途:對RNA:DNA雜交體中的 RNA特異性地降解,免除了在反轉(zhuǎn)錄完成后再用 NaOH降解RNA模板的步驟。以mRNA為模板合成其互補(bǔ) DNA.8. RNA聚合酶(RNApolymerase)活性:在DNA指導(dǎo)下合成 RNA,結(jié)合于啟動子部位,轉(zhuǎn)錄無意義鏈 (一) 產(chǎn)生與有意義鏈相似 (以U代替模板中 T) 的鏈。四、修飾酶1.末端轉(zhuǎn)移酶 :催化dNTP摻入DNA3′-OH末端,形成同聚物末端;反應(yīng)不需模板 DNA,需Co2+用途: 克隆DNA片段時加上互補(bǔ)同聚物末端,便于與載體連接。 末端標(biāo)記2.磷酸激酶和磷酸酶磷酸激酶催化 5’-OH加P (標(biāo)記)磷酸酶去除 5’-P (防止自身環(huán)化)第三章基因工程載體載體:這種能與目的基因結(jié)合,且有完整的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄功能的 DNA大分子稱之為載體( vector)。條件:(1)能夠在宿主細(xì)胞中存在并繁殖,有功能良好的復(fù)制子和啟動子,使插入基因復(fù)制和表達(dá);(2)具有多種限制性內(nèi)切酶的切點(diǎn),且切點(diǎn)是單一的,這樣可將多個外源 DNA片段插入其中;(3)具有容易檢測的篩選標(biāo)記;(4)載體DNA的分子量適當(dāng),可容納較大的外源 DNA片段,又可在受體細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增較多的拷貝;5)在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性高,這樣可以使重組體可以穩(wěn)定傳代而不易丟失?;蚬こ梯d體克隆載體(clonevector):主要是對目的基因克隆,建立DNA文庫和cDNA文庫,其上有復(fù)制子即可;表達(dá)載體(expressionvector):能使目的基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的一類載體。這類載體既有復(fù)制子,更要有強(qiáng)啟動子;穿梭載體(shottlevector):這類載體可以在原核細(xì)胞中復(fù)制,也可在真核細(xì)胞中擴(kuò)增和表達(dá)。一、質(zhì)粒載體共同組成部分:復(fù)制必須區(qū)、選擇標(biāo)記基因、限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)構(gòu)型:閉合環(huán)狀DNA、開環(huán)DNA、線形DNA。電泳移率依次減少嚴(yán)緊型質(zhì)粒:在宿主細(xì)胞中的拷貝數(shù)較少,一般只有1~3個。松馳型質(zhì)粒:其拷貝數(shù)較多,一般20~60個,多的可達(dá)200~300個。轉(zhuǎn)移型,結(jié)合型粒(conjugativeplasmid):是指一些質(zhì)粒在不同的菌株中可以相互轉(zhuǎn)移。非轉(zhuǎn)移型質(zhì)粒(non-conjugativeplasmid):則只能在一種寄主中生存。理想質(zhì)粒載體的必備條件:①具有較小的分子質(zhì)量和較高的拷貝數(shù)。②具有若干限制性核酸內(nèi)切酶的單一酶切位點(diǎn)③具有兩種以上的選擇標(biāo)記基因(四環(huán)素抗性基因Tetr、氨芐青霉素抗性基因r基因⑤具有復(fù)制起始點(diǎn)Amp)④缺失mob克隆質(zhì)粒載體:專用于基因或DNA片段無性繁殖的質(zhì)粒載體pBR322組成:來自 pSCl01的四環(huán)素抗性基因 Tetr來自ColEl的衍生物 pMBl的松弛復(fù)制起點(diǎn) orir來自RSF2124的氨芐青霉素抗性基因 Amp。文檔實(shí)用特點(diǎn):具有多個單一的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。Tetr 中有BamH1切點(diǎn)(G↓GATCC)和SalⅠ切點(diǎn)(G↓AATTC),Ampr中有 PstⅠ切點(diǎn)(CTGCA↓G)。利用ColEl 的復(fù)制子,所以在細(xì)胞中是多拷貝的,可通過氯霉素使質(zhì)粒拷貝數(shù)進(jìn)一步擴(kuò)增。篩選方法—重組克隆的 “插入失活”在一個基因位點(diǎn)中插入外源 DNA片段,從而使該基因活性喪失的現(xiàn)象叫插入失活。rr插入在Amp中,在含有氨卞青霉素培養(yǎng)基上不生長,在在含有四環(huán)素培養(yǎng)基可生長而在兩種抗生素培養(yǎng)基上都生長的是非重組型。2.pUC系列質(zhì)粒載體組成:pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)氨芐青霉素抗性基因 Ampr大腸桿菌 LacZ′基因多克隆位點(diǎn)鑒別方法LacZ′基因編碼β-半乳糖苷酶氨基端 146個氨基酸 ,可以和β-半乳糖苷酶缺陷型的大腸桿菌實(shí)現(xiàn)基因內(nèi)互補(bǔ),即α—互補(bǔ) ,產(chǎn)生β-半乳糖苷酶能力。 X-gal 也是β-半乳糖苷酶的一種底物, 經(jīng)降解后可生成溴氯吲哚,使大腸桿菌菌落呈藍(lán)色。當(dāng)無β -半乳糖苷酶時, X-gal 不被分解,菌落呈白色。 當(dāng)外源基因插入到 pUC質(zhì)粒的LacZ′基因內(nèi)部,則LacZ′基因受到破壞,便不能再和缺陷型受體菌中生成有活性的β -半乳糖苷酶,因此,菌落呈白色。反之,非重組體為藍(lán)色菌落。含Ampr抗性基因,可通過插入失活和顏色反應(yīng)進(jìn)行雙重篩選。表達(dá)載體:專用于宿主細(xì)胞中高水平表達(dá)外源蛋白質(zhì)的質(zhì)粒載體。細(xì)胞中高水平表達(dá)外源蛋白質(zhì)的質(zhì)粒載體。應(yīng)含有:(1)強(qiáng)啟動子(2)在啟動子下游區(qū)和ATG上游區(qū)有一個好的SD序列。(3)在外源基因插入序列下游區(qū)要有一個強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄終止序列,保證外源基因有效轉(zhuǎn)錄和質(zhì)粒的穩(wěn)定性。二、噬菌體載體λ噬菌體顆粒中DNA為線狀雙鏈DNA分子,全長48502bp,兩端各有一段長度為12個核苷酸的互補(bǔ)單鏈(粘端),稱為cos位點(diǎn)。三個片段組成:左臂(含噬菌體頭、尾蛋白質(zhì)編碼基因)、中央片段為非必需區(qū)(外源基因插入)、右臂(調(diào)節(jié)、復(fù)制、裂解基因)λ噬菌體的缺陷:⑴基因組太大(49kb);⑵酶切點(diǎn)太多,⑶野生型只能接納一定長度的DNA。λ噬菌體的改造:⑴切去非必須區(qū)段,在切去的同時,加載目的基因(2.5kb或更大);⑵去處太多的酶位點(diǎn),每種酶只留1-2個切口;⑶增加標(biāo)記基因(remarkegene)。1.插入型載體(只有1~2種限制性核酸內(nèi)切酶的單一切割位點(diǎn))①失去了非必需區(qū)②僅保留了EcoRⅠ的單一切點(diǎn)③切點(diǎn)又位于報(bào)告基因上,故在切開DNA并插入外源基因后,報(bào)告基因失活,即可依此進(jìn)行重組體的篩選④可插入長度為10kb的外源DNA有免疫功能失活、大腸桿菌β-半乳糖苷酶失活插入型載體2.替換型載體:在其中央部位有一個可以被外源插入的DNA分子取代的DNA片段的克隆載體選擇標(biāo)記:只有λDNA的長度大于野生型λ噬菌體DNA長度的75%而不超過其105%時,才能被包裝成噬菌體顆粒重組子被包裝、非重組子不被包裝λ噬菌體載體是主要用于cDNA文庫構(gòu)建,也經(jīng)常用于外源目的基因的克隆。λ噬菌載體作為載體,其重組噬菌體DNA大小只能:38kb~52kb。三、單鏈DNA噬菌體載體M13噬菌體載體產(chǎn)生單雙鏈DNA的機(jī)制a以(+)鏈DNA為摸板,合成互補(bǔ)(-)鏈,該雙鏈稱復(fù)制型DNA(RFDNA)。bRFDNA在宿主細(xì)胞內(nèi)能快速增殖,可增加到每個細(xì)胞約200個拷貝。文檔實(shí)用c單鏈特異的 DNA結(jié)合蛋白結(jié)合在( +)鏈上,從而阻斷了其互補(bǔ)鏈,即(-)鏈的合成,這樣,細(xì)胞就會不斷的合成+)鏈DNA。d游離出來的( +)鏈DNA先與基因 V的編碼產(chǎn)物形成特異的 DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物,然后轉(zhuǎn)移到寄主細(xì)胞膜,同時基因V的蛋白質(zhì)從(+)DNA鏈上脫落下來,余下的 M13(+)鏈DNA則是從其感染的寄主細(xì)胞的細(xì)胞膜溢出的過程中,被外殼蛋白包裝成病毒顆粒的。四、植物基因工程載體Ti質(zhì)粒是農(nóng)桿菌非染色體的環(huán)狀雙鏈DNA分子結(jié)構(gòu)1)T-DNA區(qū)(transferred-DNAregions ):T-DNA是農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時,從 Ti 質(zhì)粒上切割下來轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的一段 DNA,故稱之為轉(zhuǎn)移 DNA。該DNA片段上的基因與腫瘤的形成有關(guān)。致瘤基因、冠癭堿合成酶及其分解基因(2)Vir 區(qū)(virulenceregion ):該區(qū)段上的基因能激活 T-DNA轉(zhuǎn)移,使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性,故稱之為毒性區(qū)。T-DNA區(qū)與Vir 區(qū)在質(zhì)粒 DNA上彼此相鄰,合起來約占 Ti 質(zhì)粒DNA的三分之一。3)Con區(qū)(regionsencodingconjugations ):該區(qū)段上存在著與細(xì)菌間接合轉(zhuǎn)移相關(guān)基因( tra),調(diào)控Ti 質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移。冠癭堿能激活 tra 基因,誘導(dǎo) Ti 質(zhì)粒轉(zhuǎn)移,因此稱之為接合轉(zhuǎn)移編碼區(qū)。(4)Ori 區(qū)(originofreplication ):該區(qū)段基因調(diào)控 Ti 質(zhì)粒的自我復(fù)制起始。“雙元載體” ,也稱反式載體,是指由兩個分別含 T-DNA和Vir 相容性Ti質(zhì)粒構(gòu)成的雙質(zhì)粒系統(tǒng)。五、動物基因工程載體SV40第四章:核酸操作的基本技術(shù)1、核酸的提取與純化:提取的方法有很多,其中最常用的是化學(xué)試劑提取法和離心分離法。在核酸提取中,應(yīng)去除蛋白質(zhì)和多糖等的污染,在RNA提取中,還要嚴(yán)格防止RNA酶的污染。細(xì)胞裂解1) 酶法:利用某些細(xì)胞壁裂解酶使細(xì)胞變?yōu)樵|(zhì)體,然后加去垢劑使原生質(zhì)體裂解。酶法裂解時要注意細(xì)胞的生長條件和生長時間,反應(yīng)時盡可能滿足酶的最佳反應(yīng)條件。2)機(jī)械法:壓力剪切法射擊破碎法固體研磨法反復(fù)凍融法RNA的分離與純化1) 制備RNA的關(guān)鍵—防止內(nèi)外源 RNase的作用2) 總RNA的制備2、核酸的檢測與保存核酸檢測常用的方法有: 紫外光譜分析法 熒光分析法 瓊脂糖凝膠電泳法核酸的保存:酸性條件下保存、堿性條件下保存 低溫條件下保存3、核酸的凝膠電泳: 瓊脂糖凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳 脈沖電場凝膠電泳電泳的原理:將某種分子放到特定的電場中,它就會以一定的速度向適當(dāng)?shù)碾姌O移動。某物質(zhì)在電場作用下的遷移速度叫作電泳的速率,它與電場強(qiáng)度成正比,與該分子所攜帶的凈電荷數(shù)成正比,而與分子的磨擦系數(shù)成反比(分子大小、極性、介質(zhì)的粘度系數(shù)等) 。染色:在凝膠電泳中,一般加入溴化乙錠( EB)--ethidium bromide 染色,此時,核酸分子在紫外光下發(fā)出熒光,肉眼能看到約 50ngDNA所形成的條帶。4、核酸分子雜交1)探針的制備: 探針(probe):用來探知被測物存在的小分子 DNA或RNA。標(biāo)記物:探針上結(jié)合的易被檢測的化合物。分子雜交:探針DNA或RNA與被測物的互補(bǔ)結(jié)合叫分子雜交。2)核酸雜交: 原理是,帶有互補(bǔ)的特定核苷酸序列的單鏈 DNA或RNA,當(dāng)它們混合在一起時,其相應(yīng)的同源區(qū)段將會退火形成雙鏈的結(jié)構(gòu)。(1)、SouthernDNA 印跡轉(zhuǎn)移技術(shù): 根據(jù)毛細(xì)管作用的原理,使在電泳凝膠中分離的 DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當(dāng)?shù)奈臋n實(shí)用濾膜上,然后通過同標(biāo)記的單鏈DNA或RNA探針的雜交作用檢測這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段(2)、NorthernRNA印跡雜交:將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學(xué)修飾的活性濾紙上,進(jìn)行核酸雜交的一種實(shí)驗(yàn)方法(a)基因組DNA3)、斑點(diǎn)印跡雜交:是在Southern印跡轉(zhuǎn)移技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展而成的快速檢測特異核酸分子的核酸雜交技術(shù)適用于核酸樣品的定量檢測,而不是定性檢測DNA限制片段菌落雜交(b)(c)(d)硝酸纖維素濾膜同探針同源雜交的基因DNA片段第五章聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)式(e)1、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增原理X光底片1)、PCR:用于在體外酶促擴(kuò)增特定DNA片段的快速方法2)、原理:PCR由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制過程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。①模板DNA變性:模板 DNA經(jīng)94℃左右加熱一定時間后,雙鏈 DNA模板或經(jīng) PCR擴(kuò)增形成的雙鏈 DNA解離成為單鏈。②模板DNA與引物的退火 (復(fù)性):模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至 55℃左右,引物與模板 DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合。③引物的延伸:DNA模板--引物結(jié)合物在 TaqDNA聚合酶的作用下, 以dNTP為反應(yīng)原料,靶序列為模板, 按堿基配對與半保留復(fù)制原理,合成一條新的與模板 DNA鏈互補(bǔ)的單鏈。變性--退火--延伸三步驟的重復(fù)循環(huán),就可獲得更多的“模板互補(bǔ)鏈” ,而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。多次循環(huán)后目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。2、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系(一)PCR反應(yīng)體系:參與 PCR反應(yīng)的主要成份 :模板、引物、dNTP、TaqDNA聚合酶和緩沖液等。(1)、模板:包括基因組 DNA、RNA、質(zhì)粒DNA、線粒體 DNA等,模板 DNA需較高的濃度 RNA作為模板時,須先將 RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,再以cDNA作為擴(kuò)增的模板2)、引物:引物決定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性和長度,是化學(xué)合成的寡核苷酸片段3)、脫氧核苷三磷酸(dNTP):是dATP、dCTP、dGTP和dTTP4種脫氧核苷三磷酸的混合物4)、DNA聚合酶:比較常用的酶有:大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ大片段(Klenow片段),具5′→3′DNA聚合酶活性,3′→5′外切酶活性TaqDNA聚合酶:有很高的耐熱穩(wěn)定性。功能:具5′→3′DNA聚合酶活性,5′→3′外切酶活性;特點(diǎn):高度耐熱,最佳溫度75℃—80℃;在序列分析和PCR中應(yīng)用廣泛.T4DNA聚合酶功能:A、具5′-凸端補(bǔ)平效果B、5′→3′外切酶活性C、3′→5′外切酶活性D、用與制備探針和加減法DNA序列分析Taq酶的作用:模板指導(dǎo)下,以dNTP為原料,在引物3’-OH末端加上脫氧單核苷酸,形成3’,5’-磷酸二酯鍵,使DNA鏈沿5’→3’方向延伸,催化DNA合成。文檔實(shí)用(5)、鎂離子濃度: Taq酶的活性只與游離的 Mg2+濃度有關(guān), 但PCR反應(yīng)體系中 dNTP、引物、模板 DNA及鰲合劑的存在均可與 Mg2+結(jié)合而降低游離 Mg2+的濃度從而影響酶的活性。(6)、其它反應(yīng)因素 :pH 鹽 基質(zhì)(二)PCR的反應(yīng)條件 :反應(yīng)溫度(變性、退火、延伸)反應(yīng)時間(變性、退火、延伸)循環(huán)次數(shù)(PCR效率及產(chǎn)物量)溫度:變性溫度:94~97 ℃退火溫度:低于引物 Tm5℃左右,溫度過高:降低擴(kuò)增效率; 溫度過低:增加非特異性擴(kuò)增延伸溫度:72度,此時Taq酶具有較高的酶促活性時間:第一次變性應(yīng)給予足夠時間( 5~7 分鐘)每一個步驟所需時間取決于擴(kuò)增片段的長度,一般為 30秒~1分鐘,時間過長易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增循環(huán)次數(shù):重復(fù)次數(shù)一般設(shè)為 25~35個循環(huán)(三)引物設(shè)計(jì)的一般原則(1)引物長度應(yīng)為 15~30個核苷酸,Tm可按下列簡單公式計(jì)算: Tm=(G+C)x4+(A+T)x22)引物中堿基的分布應(yīng)當(dāng)是隨機(jī)的,避免出現(xiàn)一連串的單一堿基或產(chǎn)生二級結(jié)構(gòu)。3)G+C堿基的含量在45%~55%左右。4)兩個引物在3端均必須與模板互補(bǔ),5端可以不互補(bǔ)。(5)引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基小于4個。(6)引物之間連續(xù)互補(bǔ)堿基亦應(yīng)小于4。3、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)類型一、已知DNA序列的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增(一)巢式PCR巢式PCR是為了增加擴(kuò)增的靈敏度,對已知序列設(shè)計(jì)出第一對引物,擴(kuò)增25個循環(huán)。然后根據(jù)序列設(shè)計(jì)出第二對引物,它和已擴(kuò)增出序列內(nèi)部兩條鏈序列互補(bǔ),繼續(xù)再擴(kuò)增25個循環(huán)。(二)熱巢式PCR:是巢式PCR的改進(jìn)技術(shù)。(三)半巢式PCR:為了節(jié)省材料,往往在設(shè)計(jì)巢式引物時,利用第一對引物中的一個引物,再從靶序列內(nèi)部設(shè)計(jì)出另一個引物,效果與巢式PCR相同。(四)不對稱PCR:不對稱PCR多用于序列分析。(五)等位特異性PCR:等位特異性PCR,即AS-PCR,又稱擴(kuò)增受阻突變體系是為檢測點(diǎn)突變而設(shè)計(jì)的。(六)PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)1、原理和方法:PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)(singlestrandconformtionpolymorphism,SSCP)2、特點(diǎn):PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)(PCR-SSCP)的優(yōu)點(diǎn)是簡單、快速、靈敏度高,可同時處理多個樣本。(七)競爭引物PCR:競爭引物PCR(COP-PCR)針對靶DNA一個測點(diǎn)突變設(shè)計(jì)出兩個等位特異性寡核苷酸(allelespecificoligonucleotide,ASO),一個為正常引物,另一個為突變引物。(八)降落PCR:降落(TD)PCR代表了一種完全不同的PCR優(yōu)化方法,它不是用許多反應(yīng)管和每管用不同的試劑濃度和(或)循環(huán)參數(shù),而是一個反應(yīng)管或一小組反應(yīng)管,在適合于擴(kuò)增目的產(chǎn)物而的不到人為產(chǎn)物或引物二聚體的循環(huán)條件下反應(yīng)。二、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)先用逆轉(zhuǎn)錄酶作用于 mRNA,以寡聚dT為引物合成 cDNA第一鏈,然后用已知一對引物,擴(kuò)增嵌合分子, 這種方法稱為逆轉(zhuǎn)錄(reversetranscription,RT )PCR,即RT-PCR。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) :用于該反應(yīng)的引物可以是隨即六聚體核苷酸,也可以是 oligo(dT)n 。三、已知cDNA一端序列獲得全長 cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(一)快速擴(kuò)增 cDNA末端技術(shù)PCR用于擴(kuò)增代表 mRNA轉(zhuǎn)錄物某單一位點(diǎn)與 3‘或5’末端之間的部分 cDNA稱為快速擴(kuò)增 cDNA末端技術(shù)(rapidanplificationcDNAend,RACE )。(二)新RACE5 ’RACE是通過反轉(zhuǎn)錄酶將目的 mRNA完整地變成第一鏈 cDNA。因?yàn)檫^早終止的第一鏈 cDNA,其有效性文檔實(shí)用像全長cDNA一樣,可用末端轉(zhuǎn)移酶同樣有效地加尾。四、已知側(cè)翼序列聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增(一)染色體步移-反向PCR已知側(cè)翼序列可以擴(kuò)增靶序列,稱為染色體步移-反向PCR(inversePCR)。PCR通常用于擴(kuò)增位于兩寡核苷酸引物之間的DNA區(qū)段,但是經(jīng)特殊設(shè)計(jì)的PCR也可以擴(kuò)增那些位于已知序列外側(cè)的序列,這就是反向PCR。(二)鍋餅PCR五、未知序列聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增:1、島嶼獲救PCR的原理六、定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(一)競爭性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用于定量測定mRNA(二)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)七、免疫相關(guān)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(一)免疫聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(immunePCR,免疫PCR)(二)酶聯(lián)免疫吸附分析-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(ELISA-PCR)八、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)衍生的分子標(biāo)記4、聚合酶鏈?zhǔn)椒从臣夹g(shù)應(yīng)用一、核酸的基礎(chǔ)研究二、序列分析三、檢測基因表達(dá)四、從cDNA庫中放大特定序列五、研究已知片段鄰近基因或未知DNA片段六、進(jìn)化分析七、醫(yī)學(xué)應(yīng)用八、分析生物學(xué)證據(jù)九、性別控制十、轉(zhuǎn)基因檢測第六章DNA文庫的構(gòu)建和目的基因的篩選外源基因:插入到載體內(nèi)的那個特定的片段基因。目的基因:那些已被或者準(zhǔn)備要分離、改造、擴(kuò)增或表達(dá)的特定基因或DNA片段?;蛭膸?genelibrary)又稱DNA文庫,是指某個生物的基因組DNA或cDNA片段與適當(dāng)?shù)妮d體在體外重組后,轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞,并通過一定的選擇機(jī)制篩選后得到大量的陽性菌落(或噬菌體),所有菌落或噬菌體的集合即為該生物的基因文庫?;蛭膸煊赏庠碊NA片段、載體和宿主組成。構(gòu)建基因文庫的基本程序:1)提取研究對象基因組DNA,制備合適大小的DNA片段,或提取組織或器官的mRNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA;2)DNA片段或cDNA片段與經(jīng)特殊處理的載體連接形成重組DNA;3)重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞或體外包裝后侵染受體菌;4)陽性重組菌落或噬菌斑的選擇。一、基因組DNA文庫的構(gòu)建載體可以分為:質(zhì)粒文庫、噬菌體文庫、粘粒文庫、人工染色體文庫(細(xì)菌人工染色體文庫、酵母人工染色體文庫)。構(gòu)建的程序:①載體DNA的制備;②高純度大相對分子質(zhì)量基因組DNA的提取和大片段的制備;③高純度大相對分子質(zhì)量基因組DNA的部分酶切與脈沖電泳分級分離;④載體與外源片段的連接與轉(zhuǎn)化或侵染宿主細(xì)胞;⑤重組克隆的挑選和保存。1.λ噬菌體載體文庫(9~22kb):先以限制性內(nèi)切酶酶切基因組DNA和λ噬菌體,切除λ噬菌體DNA的非必需區(qū),目的基因與λ噬菌體載體連接,再經(jīng)過體外包裝重組λ噬菌體顆粒,感染大腸桿菌,通過噬菌體空斑篩選。粘粒文庫(33~46kb):粘粒組成:噬菌體DNA包裝序列(cos)、復(fù)制原點(diǎn)、藥物抗性基因和多克隆位點(diǎn)。DNA插入片段的兩端分別與一個粘粒相連,其它構(gòu)建過程與λ噬菌體文庫相似。重組的的粘粒可以通過體外包裝以噬菌體的形式感染大腸桿菌,也可以用標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方法直接導(dǎo)入大腸桿菌中進(jìn)行增殖。以抗生素培養(yǎng)基、噬菌斑選擇重組子。3.酵母人工染色體文庫( 100~200kb):用兩種限制性內(nèi)切酶酶切酵母菌 DNA為2個末端片段,與目的基因片段連接組成完整的YAC載體導(dǎo)入酵母細(xì)胞中。用不含色氨酸的培養(yǎng)基選擇 YAC重組子。4.基因組DNA文庫克隆子的保存與篩選:保存:影印膜濾保存法、文庫在液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增保存、保存單個克隆子于含有甘油的培養(yǎng)基中篩選:表型篩選法:表達(dá)性狀易于鑒別,如互補(bǔ)篩選抗性篩選法:如二氫葉酸還原酶可以使三甲芐二氨嘧啶降解,而該化學(xué)物可抑制大腸桿菌生長分子雜交法:利用分子探針對文庫進(jìn)行篩選免疫篩選法:利用多肽等作為抗原進(jìn)行原位雜交篩選文檔實(shí)用PCR篩選法:根據(jù)保守序列合成引物,擴(kuò)增特異性片段二、cDNA文庫構(gòu)建構(gòu)建的步驟:細(xì)胞總RNA的提取和 mRNA的分離;第一條 cDNA合成;第二條 cDNA合成;雙鏈 cDNA克隆進(jìn)質(zhì)粒或噬菌體載體并導(dǎo)入宿主中繁殖;鑒定和保存。1細(xì)胞總RNA的提取和 mRNA的分離纖維素柱層析法:纖維素上的poly(dT)與mRNA的poly(A)尾結(jié)合。慈珠分離法:慈珠上的oligo(dT)與mRNA的poly(A)尾結(jié)合2第一鏈cDNA的合成:oligo(dT) 引導(dǎo)的 DNA合成法:利用真核 mRNA分子所具有的 poly(A) 尾巴的特性,加入 12-20個脫氧胸腺嘧啶核苷組成的oligo(dT) 短片段,由反轉(zhuǎn)錄酶合成 cDNA的第一鏈。缺陷:因?yàn)槟孓D(zhuǎn)錄酶無法到達(dá) mRNA分子的5’-末端,必須從 3’-末端開始合成 cDNA。對于大分子量的較長的mRNA分子而言,特別麻煩。隨機(jī)引物引導(dǎo)的 cDNA合成法(randomlyprimedcDNAsynthesis) :根據(jù)許多可能的序列,合成出 6-10個核苷酸長的寡核苷酸短片段(混合物) ,作為合成第一鏈 cDNA的引物。在應(yīng)用這種混合引物的情況下, cDNA的合成可以從 mRNA模板的許多位點(diǎn)同時發(fā)生,而不僅僅從 3’-末端的oligo(dT) 引物一處開始。3第二鏈cDNA的合成將上一步形成的 mRNA-cDNA雜合雙鏈變成互補(bǔ)雙鏈 cDNA的過程。1)自身引導(dǎo)合成法: 用加熱或堿處理 mRNA-cDNA變性,降解 RNA,獲得的單鏈 cDNA3’端會形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能力,以此作為第二鏈合成的引物,在大腸桿菌聚合酶 IKlenow或反轉(zhuǎn)錄酶的作用下,合成 cDNA的第二鏈,再用 S1核酸酶切割cDNA的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)。缺點(diǎn): 在以S1核酸酶切割 cDNA的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)時,會導(dǎo)致對應(yīng)于 mRNA5’端的地方的序列出現(xiàn)缺失和重排。 S1核酸酶的純度不夠時,會偶爾破壞合成的雙鏈 cDNA分子。2)置換合成法 :以第一鏈合成產(chǎn)物 cDNA:mRNA雜交體作為切口平移的模板, RNA酶H在雜交體的 mRNA鏈上造成切口和缺口,產(chǎn)生一系列 RNA引物,在大腸桿菌 DNA聚合酶I 的作用下合成 cDNA的第二鏈。T4噬菌體DNA聚合酶填補(bǔ)平口末端。獲得的雙鏈 cDNA5’端也會有幾對堿基缺失優(yōu)點(diǎn):a)合成cDNA的效率高 b)直接利用第一鏈的反應(yīng)產(chǎn)物,不需純化 c)避免使用 S1核酸酶來切割雙鏈 cDNA3)引導(dǎo)合成法(PCR):以cDNA第一鏈為模版,設(shè)計(jì)并合成一組引物,通過PCR擴(kuò)增獲得的雙鏈cDNA能保留完整的5’端序列4)引物-銜接頭法文檔實(shí)用4雙鏈cDNA克隆進(jìn)質(zhì)?;蚴删w載體并導(dǎo)入宿主中繁殖cDNA末端的處理:添加特異性核酸接頭以形成適合于克隆的黏性末端末端轉(zhuǎn)移酶—可以向cDNA末端加上與克隆載體末端互補(bǔ)的尾部雙鏈cDNA的克?。弘p鏈平頭的cDNA通常可以使用下列三種方法克隆入載體中:1>平頭末端直接與載體連接,但插入的片段無法回收2>平頭兩端分別接同聚物尾,最好是 AT同聚物尾,這樣重組分子可通過加熱局部變性和 S1核酸酶處理回收插入片段3>加裝人工接頭引入酶切口,以便插入片段回收三、基因文庫的篩選與鑒定重組體(轉(zhuǎn)化子):就是摻入或?qū)胪庠?DNA后獲得了新遺傳標(biāo)志的細(xì)菌細(xì)胞或其他受體細(xì)胞。篩選表型篩選法抗藥性篩選:這是利用載體DNA分子上的抗藥性選擇標(biāo)記進(jìn)行的篩選方法。插入失活篩選法顯色反應(yīng)選擇法(α-互補(bǔ)法)2.PCR篩選法:利用合適的引物,以從初選出來的陽性克隆中提出的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR,通過對PCR產(chǎn)物的電泳分析,確定目的基因是否插入到載體中。菌落原位雜交法(右圖)免疫篩選法基因文庫的鑒定限制性核酸內(nèi)切酶分析:當(dāng)載體與外源基因進(jìn)行連接時,都需要對其進(jìn)行酶切,而且這些內(nèi)切酶都是已知的,因此可以從初步篩選出來的陽性重組菌中提取質(zhì)粒 DNA,然后用已知的內(nèi)切酶進(jìn)行酶切,酶切進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,如果出現(xiàn)與預(yù)知的大小一致的電泳片段,就證明已經(jīng)有目的基因插入到載體中。2Southern Blotting :①將DNA的限制性核酸內(nèi)切酶的酶切片段從瓊脂糖凝膠上轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或尼龍膜上;②用各種標(biāo)記的DNA探針同固定在膜上的DNA片段雜交,經(jīng)放射自顯影或其它顯色方法確定出與探針互補(bǔ)的電泳帶。DNA序列測定第七章 DNA體外重組與基因轉(zhuǎn)移目的基因與載體的連接:一、粘末端 DNA片段的連接文檔實(shí)用(一)具有相同粘末端的 DNA分子之間的連接使用堿性磷酸酶處理載體 DNA,去掉其 5’末端的磷酸基,以防質(zhì)粒 DNA的自身環(huán)化 。(二)具有不同粘性末端的 DNA分子之間的連接用兩種不同的限制性內(nèi)切酶對載體和外源 DNA進(jìn)行切割后,在它們兩端會產(chǎn)生非互補(bǔ)的突出端,經(jīng) DNA連接酶連接后即產(chǎn)生定向重組體。二、平末端 DNA片段的連接1、直接用 T4連接酶連接 2、同聚物加尾法 3 、銜接物連接法:銜接物是指用化學(xué)方法合成的一段由 10~12個核苷酸組成,具有一個或數(shù)個限制酶識別位點(diǎn)的平末端的雙鏈寡核苷酸片段4、DNA接頭連接法 :接頭的一端是齊平的,而另一端是某種內(nèi)切酶的粘性末端,先利用齊平末端連接方法將它與平端的外源DNA連接起來,造成人工粘性末端,即可再與之互補(bǔ)的粘性末端的載體 DNA相連接。三、載體與 DNA片段酶切位點(diǎn)不匹配的連接所謂載體與DNA片段酶切位點(diǎn)不匹配,指載體與待克隆的DNA片段上的酶切位點(diǎn)不相同,因而用一種或兩種酶切制造不出可互補(bǔ)的粘性末端。1、按照平末端連接方法加上接頭。2、將凹端變?yōu)槠蕉?)使用Klenow 酶在4 種dNTP存在下,將 3′凹端完全補(bǔ)平。2)用S1 核酸酶去除 3′突出末端產(chǎn)生平端 DNA分子。3、使用大腸桿菌 DNA聚合酶IKlenow 片段部分補(bǔ)平 3′凹端轉(zhuǎn)變成粘端。四、cDNA與載體的連接基因轉(zhuǎn)移:向原核細(xì)胞的基因?qū)肟刹捎没瘜W(xué)轉(zhuǎn)化法和電擊轉(zhuǎn)化法。真核細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移有借助于載體的基因轉(zhuǎn)移和不需載體的基因轉(zhuǎn)移,前者主要是靠動植物病毒的感染來完成;后者有磷酸鈣沉淀法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法、血影細(xì)胞介導(dǎo)法、電穿孔轉(zhuǎn)移法等。第八章 重組DNA分子的篩選與鑒定一、遺傳檢測法:(一)根據(jù)載體表型特征選擇重組體分子1、抗藥性標(biāo)記插入失活篩選法: 例:pBR322如果外源基因插入到 tetr 基因內(nèi)部,tetr 抗性消失,表型為不抗四環(huán)素( tets)、而仍抗氨芐青霉素( ampr),這樣的轉(zhuǎn)化細(xì)胞在含有 amp的培養(yǎng)基仍可生長,但在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上不能再生長;反之,如果 ampr 基因由于外源基因插入其內(nèi)部而失活,帶有重組 DNA分子的轉(zhuǎn)化細(xì)胞在含有 tet 的培養(yǎng)基平板上生長,在含有 amp的培養(yǎng)基不能生長。2、α—互補(bǔ) :例;pUC質(zhì)粒在LacZ—的大腸桿菌中,在平板培養(yǎng)中,菌落是白色的。若在該細(xì)胞中引入 pUC質(zhì)粒,其上有 LacZ′,質(zhì)粒和大腸桿菌DNA可實(shí)現(xiàn)α—互補(bǔ),菌落呈藍(lán)色。如果在質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)的某個酶切點(diǎn)上克隆了外源基因,則 LacZ′基因受到破壞,便不能再和缺陷型受體菌中生成有活性的β -半乳糖苷酶,因此,菌落呈白色。(二)根據(jù)插入序列的表型特征選擇重組體二、物理檢測法 :1、凝膠電泳檢測法 2、R-環(huán)法三、核酸雜交檢測法1.菌落印跡原位雜交 2. 斑點(diǎn)印跡雜交 3.Southern 印跡雜交四、免疫化學(xué)檢測法免疫化學(xué)檢測法是利用抗體與抗原結(jié)合的高度特異性來鑒別基因的。如果某個重組克隆中的外源基因能夠表達(dá),在這個克隆中就存在著這個基因的特定蛋白,即可用特異性抗體來檢測。常用的有標(biāo)記抗體測定法和免疫沉淀測定法兩種。五、DNA-蛋白質(zhì)篩選法六、轉(zhuǎn)譯篩選法第九章 基因表達(dá)文檔實(shí)用基因表達(dá)是指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過程。宿主細(xì)胞分為兩大類:第一類為原核細(xì)胞: 常用有大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、鏈霉菌等;第二類為真核細(xì)胞: 常用有酵母、絲狀真菌、哺乳動物細(xì)胞等。⒈真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)載體必須具備條件:⑴載體能夠獨(dú)立復(fù)制。載體本身是 一個復(fù)制子,具有復(fù)制起點(diǎn)。⑵應(yīng)具有靈活的克隆位點(diǎn)和方便的篩選標(biāo)記,以利于外源基因的克隆鑒定和篩選。⑶應(yīng)具有很強(qiáng)的啟動子,能為大腸桿菌 RNA聚合酶所識別。⑷應(yīng)具有阻遏子,使啟動子受到控制,只有當(dāng)誘導(dǎo)時才能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。⑸應(yīng)具有很強(qiáng)的終止子,只轉(zhuǎn)錄克隆的基因,所產(chǎn)生的mRNA較為穩(wěn)定。⑹所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起始信號AUG和SD序列,以便轉(zhuǎn)錄后順利翻譯。一、大腸桿菌中的基因表達(dá)大腸桿菌表達(dá)載體的組成:選擇標(biāo)記基因、載體的復(fù)制起點(diǎn)、供外源基因正確插入的多克隆位點(diǎn)、啟動子、轉(zhuǎn)錄終止子、翻譯起始序列、翻譯增強(qiáng)子、翻譯終止子等。啟動子1)Lac啟動子:包括啟動子、活化蛋白( CAP)結(jié)合位點(diǎn)、操作子及 lacZ。野生型Lac啟動子要啟動轉(zhuǎn)錄條件:有活化蛋白及cAMP等正調(diào)控因子和乳糖或IPTG等解除負(fù)調(diào)控的物質(zhì)同時存在LacUV5僅有乳糖或IPTG存在就能啟動轉(zhuǎn)錄。2)Trp啟動子:包括啟動子、衰減子、操縱子及 trpR的部分結(jié)構(gòu)基因。由阻遏蛋白和衰減子調(diào)控。 trpR基因產(chǎn)生的阻遏蛋白只有與色氨酸結(jié)合時才能轉(zhuǎn)化為活性蛋白與操縱子結(jié)合阻止轉(zhuǎn)錄起始。當(dāng)色氨酸濃度高時,在衰減子的作用下,操縱子 DNA可以形成類似終止子的莖環(huán)結(jié)構(gòu)??梢酝ㄟ^除去色氨酸或增加 IAA。3)Tac啟動子:Lac啟動子和 Trp啟動子的雜合啟動子。4)PL啟動子:受cI所編碼的阻遏蛋白的調(diào)控,阻遏蛋白與 PL啟動子結(jié)合,阻止基因的轉(zhuǎn)錄。 cI編碼阻遏蛋白受溫度控制,當(dāng)在 28~30℃下,cI所編碼的阻遏蛋白具有活性;當(dāng)溫度升高到 42℃時,阻遏蛋白失活。轉(zhuǎn)錄終止子:轉(zhuǎn)錄終止,增強(qiáng)mRNA分子的穩(wěn)定性。3.翻譯起始序列:決定mRNA的翻譯起始效率。增強(qiáng)方法:①在核糖體結(jié)合位點(diǎn)(PBS)的序列結(jié)構(gòu)中,增加腺嘌呤和胸腺嘧啶脫氧核苷殘基含量的比例,誘發(fā)特異堿基發(fā)生點(diǎn)突變。②使用翻譯偶聯(lián)系統(tǒng)進(jìn)行克隆基因表達(dá)等。4.翻譯增強(qiáng)子:增強(qiáng)異源基因表達(dá)的特殊序列元件,如大腸桿菌mRNA分子5`-UTR中富含U的區(qū)段。5.翻譯終止子:UAA6常用的表達(dá)載體⑴pBV220系統(tǒng):①來源于pUC8多克隆位點(diǎn)②核糖體 rrnB基因終止信號 ③pBR322第4225~3735位 ④pUC18第2066~680位 ⑤λ噬菌體 cIts857 抑制子基因及 PR啟動子 ⑥pRC23的PL啟動子及SD序列2)融合表達(dá)質(zhì)粒 pBG-2:含有啟動子 Lac和操縱子Lac、S-D序列、lacI阻遏蛋白基因3)分融合表現(xiàn)型蛋白載體 Pkk223-3:啟動子由 Trp啟動子的-35區(qū)、LacUV5啟動子的-10區(qū)、操縱子及 S-D序列組成。7.外源蛋白表達(dá)部位1)在胞內(nèi)直接表達(dá)重組蛋白(包涵體:胞內(nèi)不溶性蛋白聚集成的晶體) 2)重組蛋白分泌到周質(zhì)3)重組蛋白分泌到胞外培養(yǎng)基中 4 )以融合形式表達(dá)重組蛋白影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素⑴外源基因的拷貝數(shù) ⑵外源基因的表達(dá)效率:①啟動子的強(qiáng)弱 ②核糖體接合位點(diǎn)的有效性 ③SD序列和起始密文檔實(shí)用碼ATG的間距 ④密碼子組成 ⑶表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性 ⑷細(xì)胞代謝負(fù)荷 ⑸工程菌的培養(yǎng)條件第十章 微生物基因工程一、實(shí)現(xiàn)外源基因表達(dá)的基本操作原核細(xì)胞表達(dá)真核基因存在困難①原核細(xì)胞 RNA聚合酶不能識別真核基因的啟動子。② 由于真核基因?yàn)椴贿B續(xù)基因,因而必須將內(nèi)含子切除后才能成為成熟的 mRNA,但原核細(xì)胞中缺乏真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)。③ 在原核細(xì)胞中, mRNA必須含有SD序列才能和核糖核蛋白體結(jié)合,從而指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。而真核基因轉(zhuǎn)錄的 mRNA缺少SD序列。④ 真核基因在原核細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生的外源蛋白很不穩(wěn)定,容易被細(xì)胞蛋白酶所破壞。1、啟動子的選擇: 基因要進(jìn)行有效的表達(dá),最基本的要求是要有一個強(qiáng)有力、可調(diào)控的啟動子。強(qiáng)有力的啟動子課余RNA聚合酶緊密結(jié)合,帶動下游的基因進(jìn)行高效轉(zhuǎn)錄;啟動子的可調(diào)控性,是為了精確地控制基因的轉(zhuǎn)錄速度及開始轉(zhuǎn)錄的時間。2、大腸桿菌的密碼子偏愛性及密碼子的正確選擇獲得最佳表達(dá):(1)更換同義密碼子法。(2)外源基因和相關(guān)tRNA同步克隆法二、大腸桿菌工程菌的構(gòu)建策略(一)包涵體型異源蛋白的表達(dá)1、包涵體的組成和特點(diǎn):以包涵體形式表達(dá)重組異源蛋白的優(yōu)點(diǎn):①外源基因表達(dá)的蛋白質(zhì)分離易達(dá)到高純度和高濃度。②異源重組在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性主要取決于形成包涵體的速度。③以包涵體形式存在的外源基因表達(dá)產(chǎn)物沒有活性,對于那些有毒性的表達(dá)蛋白來說,以包涵體形式存在則使宿主細(xì)胞免受傷害。2、重組異源蛋白包涵體表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建:方法:將外源基因插入到原核表達(dá)載體強(qiáng)啟動子和有效的S-D序列的下游,表達(dá)產(chǎn)物位于胞內(nèi),氨基端和羧基端不含有其他蛋白或多肽序列。(二)分泌型異源蛋白的表達(dá):1、分泌型異源蛋白的表達(dá)2、蛋白傳輸分泌機(jī)制3、分泌型異源蛋白的表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建(三)融合型異源蛋白的表達(dá)特點(diǎn):①穩(wěn)定性大大增加。②分離純化程序簡單。③表達(dá)效率較高。異源蛋白從融合蛋白中的回收:化學(xué)法和酶解法(四)提高大腸桿菌中外源基因表達(dá)效率的策略1、寡聚型異源蛋白的表達(dá):(1)多表達(dá)單元型重組(2)多順反子型重組(3)多編碼序列型重組2、整合型異源蛋白的表達(dá)整合型外源基因表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建步驟:①以外源DNA片段插入后不影響細(xì)胞的正常生理功能為前提,探測并鑒定受體菌染色體DNA的整合位點(diǎn)。②克隆分離選定的染色體整合位點(diǎn),并進(jìn)行序列分析。③將外源基因以及必要的可控性表達(dá)元件連接到已克隆的染色體整合位點(diǎn)中間或鄰近區(qū)域。④將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞中。⑤篩選和擴(kuò)增整合了外源基因的受體細(xì)胞。3、蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建: (1)細(xì)胞內(nèi)蛋白降解的基本特征( 2)蛋白酶缺陷型受體細(xì)胞的改造3)抗蛋白酶的重組異源蛋白序列設(shè)計(jì)三、基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性及其對策(一)工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機(jī)制;不穩(wěn)定性的主要形式:(1)重組DNA分子某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排或修飾。(2)整個重組 DNA分子不穩(wěn)定,從而使部分重組 DNA分子子代細(xì)胞不帶質(zhì)粒。(二)改善工程菌不穩(wěn)定性的對策: 1、改善載體宿主系統(tǒng) 2、施加選擇壓力 3 、控制外源基因過量表達(dá)4、優(yōu)化培養(yǎng)條件 5 、固定化四、酵母菌的載體系統(tǒng): 一般分為質(zhì)粒載體、酵母整合載體( YIP)、酵母人工染色體(YAC)。質(zhì)粒載體分為酵母附加型質(zhì)粒( YEP)、酵母復(fù)制質(zhì)粒( YRP)酵母著絲粒質(zhì)粒( YCP)(一)酵母載體的基本結(jié)構(gòu) :1、DNA復(fù)制起始區(qū) 2、選擇標(biāo)記一類是酵母宿主為營養(yǎng)缺陷型、一類是顯性標(biāo)記; 3、整合介導(dǎo) 4、有絲分裂穩(wěn)定區(qū) 5、表達(dá)盒它主要由轉(zhuǎn)錄啟動子和終止子組成(二)酵母質(zhì)粒載體及其構(gòu)建:文檔實(shí)用1、釀酒酵母中的 2um環(huán)狀質(zhì)粒,他在宿主細(xì)胞核內(nèi)的拷貝數(shù)可維持在 50-100之間,其復(fù)制的控制模式與染色體 DNA完全相同2、YEP質(zhì)粒,廣泛應(yīng)用于外譯蛋白質(zhì)胞外表達(dá),是在 2um質(zhì)粒基礎(chǔ)上,加入了酵母核DNA序列以及 E.coli 質(zhì)粒pMB9的部分序列構(gòu)建而成3、ycp質(zhì)粒:著絲粒區(qū)域染色體均勻分配的重要順式作用元件。將該區(qū)域 DNA片段插入到ASR型質(zhì)粒中,能明顯改善質(zhì)粒復(fù)制拷貝在子代細(xì)胞中的均勻分配,同時提高質(zhì)粒在宿主細(xì)胞增殖過程的穩(wěn)定性4、yrp質(zhì)粒:是酵母自主復(fù)制型載體,含有酵母基因組的 DNA復(fù)制起始區(qū)的 ARS序列,能在酵母染色體外自主復(fù)制。五、微生物基因工程的應(yīng)用(一)、重組微生物工程菌與人類藥物生產(chǎn): 1、重組人胰島素生產(chǎn) 2、重組人生長激素生產(chǎn) 3、重組人干擾素生產(chǎn)4、重組人抗體及其片段的生產(chǎn)(二)、重組微生物工程菌與疫苗生產(chǎn)1、基因工程疫苗是 指用重組DNA技術(shù)克隆并表達(dá)保護(hù)性抗原基因,利用表達(dá)的產(chǎn)物或重組體本身制成疫苗。2、核酸疫苗:指使用能夠表達(dá)抗原的基因本身(即核酸)制成的疫苗。 3、蛋白工程疫苗(三)、重組微生物工程菌與食品、飼料工業(yè):重組工程菌與干酪、單細(xì)胞蛋白質(zhì)、釀酒工業(yè)、氨基酸、維生素生產(chǎn)(四)、重組微生物工程菌與環(huán)境保護(hù)(五)、重組微生物工程菌與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)第十一章植物基因工程1、Ti質(zhì)粒:Ti質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質(zhì),為雙股共價閉合環(huán)狀DNA分子,其分子量為95~156×106D,約有200kb2、不同的Ti質(zhì)粒有二個同源區(qū):①Vir區(qū)(轉(zhuǎn)化所必須)②T-DNA是Ti質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化植物的DNA,3、Ti質(zhì)粒的基因位點(diǎn)及其功能區(qū)域(1)T-DNA區(qū):T-DNA是農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時,從Ti質(zhì)粒上切割下來轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的一段DNA,故稱之為轉(zhuǎn)移DNA。該DNA片段上的基因與腫瘤的形成有關(guān)。(2)Vir區(qū):區(qū)段上的基因能激活T-DNA轉(zhuǎn)移,使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性,故稱之為毒性區(qū)。T-DNA區(qū)與Vir區(qū)在質(zhì)粒DNA上彼此相鄰,合起來約占Ti質(zhì)粒DNA的三分之一。(3)Con區(qū):段上存在著與細(xì)菌間接合轉(zhuǎn)移相關(guān)基因(tra),調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移。冠癭堿能激活tra基因,誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移,因此稱之為接合轉(zhuǎn)移編碼區(qū)。(4)Ori區(qū)(originofreplication):區(qū)段基因調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復(fù)制起始。4、T-DNA結(jié)構(gòu):胭脂堿型的T-DNA是15kb長的DNA連續(xù)片段,占Ti的7-15%,兩邊有23bp的定向重復(fù)序列。章魚堿型的T-DNA區(qū)分為兩部分,左區(qū)(TL-DNA)為13kb的單拷貝序列,是誘發(fā)和維持腫瘤所必需的。右區(qū)(TR-DNA)為7
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