分子熒光光譜法

MolecularFluorescenceSpectrometry分子熒光光譜法1熒光燈管-電激發(fā)發(fā)光3-Br-Carbazole磷光光棒-化學(xué)反應(yīng)發(fā)光2按激發(fā)的模式分類：按分子激發(fā)態(tài)的類型分類：光致發(fā)光化學(xué)發(fā)光/生物發(fā)光熱致發(fā)光場(chǎng)致發(fā)光摩擦發(fā)光

分子發(fā)光分子發(fā)光熒光磷光分子發(fā)光的類型3

1852年，Stokes在用分光光度計(jì)考察奎寧和葉綠素的熒光時(shí)，觀察到其熒光波長比入射光波長稍長些，判斷這種現(xiàn)象是物質(zhì)在吸收光能后重新發(fā)射不同波長的光，從而導(dǎo)入了熒光是光發(fā)射的概念，他還由發(fā)熒光的礦石“螢石”而提出“熒光”這一術(shù)語。GeorgeGabrielStokes（1819-1903）4Natural

FluorescenceGreen

fluorescent

protein(GFP)From

jellyfish（水母）Widely

applied

in

molecularbiology

(2009

Nobel

Prize)Red

fluorescent

protein(DsRed)originally

isolated

from

the

IndoPacific

sea

anemone(?？?

relative

Discosoma

speciesh45產(chǎn)生機(jī)理1、熒光\磷光的產(chǎn)生激發(fā)后分子的多重性可能改變(S/T兩態(tài)).單重態(tài):

所有電子自旋都配對(duì)的分子的電子狀態(tài)。大多數(shù)有機(jī)物分子的基態(tài)是單重態(tài)。當(dāng)處于基態(tài)的一對(duì)電子中的一個(gè)被激發(fā)到較高能級(jí)，其自旋方向沒有改變，分子仍處于單重態(tài)。三重態(tài):

有兩個(gè)電子的自旋不配對(duì)而平行的狀態(tài)。激發(fā)三重態(tài)能量較激發(fā)單重態(tài)低。分子熒光和磷光光譜分析法6☆振動(dòng)弛豫：激發(fā)態(tài)分子由同一電子能級(jí)中的較高振動(dòng)能級(jí)轉(zhuǎn)至較低振動(dòng)能級(jí)的過程，其效率較高，10-14～10-12s內(nèi)完成。☆內(nèi)轉(zhuǎn)換：電子在相同多重態(tài)的兩個(gè)能級(jí)間，由高能級(jí)回到低能級(jí)的過程?！钕甸g竄越：不同多重態(tài)間進(jìn)行的躍遷,激發(fā)態(tài)分子的電子自旋發(fā)生倒轉(zhuǎn):S1→T1。在10-2～10-6s內(nèi)完成。無輻射躍遷過程：

激發(fā)態(tài)分子的失活:激發(fā)態(tài)分子不穩(wěn)定，要以輻射或無輻射躍遷的方式回到基態(tài)。7輻射躍遷:

熒光Fluorescence：

受光激發(fā)的分子從第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)回到基態(tài)所發(fā)出的輻射。壽命10-8~10-10s，是相同多重態(tài)之間的躍遷，躍遷幾率、速度較大。

磷光Phosphorescence：受光激發(fā)的分子從第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)回到基態(tài)所發(fā)出的輻射。由于磷光的產(chǎn)生伴隨自旋多重態(tài)的改變，輻射幾率、速度遠(yuǎn)小于熒光，壽命長（10-4~10s）,能量更低！89Relative

position

of

absorption,

fluorescence

andphosphorescence

bands

of

chrysene（1,2-苯并菲）121011激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系

a.Stokes位移激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值。發(fā)射光譜的波長比激發(fā)光譜的長，振動(dòng)弛豫消耗了能量。

b.發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級(jí)，吸收不同波長的能量，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長一定的熒光。

c.

鏡像規(guī)則通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對(duì)稱關(guān)系。鏡像規(guī)則的解釋

基態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布類似；

基態(tài)上的零振動(dòng)能級(jí)與第一激發(fā)態(tài)的二振動(dòng)能級(jí)之間的躍遷幾率最大，相反躍遷也然。

13200250300350400450500熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜nm蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜14①共軛效應(yīng)

產(chǎn)生熒光的有機(jī)物質(zhì)，都含有共軛雙鍵體系，通常>1個(gè)苯環(huán)。共軛體系越大，離域大π鍵的電子越容易激發(fā)，熒光與磷光越容易產(chǎn)生?；衔锉捷凛於∈∥焓ˇ薳xmax(nm)205286365390580λemmax

(nm)278321400480640相對(duì)熒光強(qiáng)度1129466062熒光\磷光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系

15

有剛性結(jié)構(gòu)的分子容易發(fā)熒光，熒光物質(zhì)的剛性和平面性增加，有利于熒光發(fā)射。②剛性平面結(jié)構(gòu)

芴

100

聯(lián)苯

2016不產(chǎn)生熒光產(chǎn)生熒光熒光黃產(chǎn)生熒光不產(chǎn)生熒光酚酞偶氮菲偶氮苯17③躍遷的類型對(duì)于有機(jī)熒光物質(zhì):π*→π

n→π*εmax＜

100平均壽命10-5~10-7secπ→π*

εmax≥104平均壽命10-7~10-9seckS→T小π*→n

π*→π是有機(jī)化合物產(chǎn)生熒光的主要躍遷類型。181）給電子取代基加強(qiáng)熒光④取代基的影響—NH2，—NHR，—NR2，—OH，—OR，—CN產(chǎn)生p→π共軛化合物苯苯酚苯胺苯基氰苯甲醚λemmax(nm)278~310285~365310~405280~390285~345相對(duì)熒光強(qiáng)度1018202020192）得電子取代基減弱熒光、加強(qiáng)磷光—C=0，—COOH，—NO2等，不產(chǎn)生p→π共軛硝基苯：不產(chǎn)生熒光、弱磷光二苯甲酮：弱熒光、強(qiáng)磷光S1→T1的系間竄躍產(chǎn)率接近120強(qiáng)熒光有機(jī)化合物具備以下特征:①具有大的共軛π鍵結(jié)構(gòu)；②具有剛性的平面結(jié)構(gòu)；③具有最低的單重激發(fā)態(tài)S1為π*→π型；④取代基團(tuán)為給電子取代基。21熒光壽命和量子產(chǎn)率熒光壽命(lifetime)：去掉激發(fā)光后，分子的熒光強(qiáng)度降到激發(fā)時(shí)最大熒光強(qiáng)度的1/e(備注：e為自然對(duì)數(shù)的底數(shù)，其值約為2.718)所需要的時(shí)間，稱為熒光壽命.熒光分子處于S1激發(fā)態(tài)的平均壽命，可用下式表示：τ

f=1/（kf+ΣK）（典型的熒光壽命在10-8~10-10s）kf表示熒光發(fā)射過程的速率常數(shù)；ΣK代表各種分子內(nèi)的非輻射衰變過程的速率常數(shù)的總和。熒光量子產(chǎn)率(Quantumyield)：熒光物質(zhì)吸光后所發(fā)射的熒光的光子數(shù)與所吸收的激發(fā)光的光子數(shù)之比值。由于激發(fā)態(tài)分子的衰變過程包含輻射躍遷和非輻射躍遷，故熒光量子產(chǎn)率可表示為

?f=kf/(kf+ΣK)1、溫度：低溫，φf↑。原因：溫度T↑，分子運(yùn)動(dòng)加快，磁撞幾率↑無輻射躍遷↑2、溶劑：除一般溶劑效應(yīng)外，溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成都將使化合物的熒光發(fā)生變化①溶劑介電常數(shù)↑，極性↑，n→π*,ΔE↑,φf↓，λ↓π→π*ΔE↓,φf↑，λ↑②溶劑含重原子或溶解氧（CBr4等)，體系間跨越↑。使φf↓，甚至熄滅。③溶劑粘度σ↑，φf↑，F(xiàn)↑影響熒光的環(huán)境因素243、pH影響對(duì)酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴(yán)格控制；4、熒光猝滅的影響熒光物質(zhì)與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子相互作用引起熒光強(qiáng)度降低或猝滅的現(xiàn)象。引起熒光猝滅的物質(zhì)為熒光猝滅劑常見的猝滅劑有：鹵素離子、重金屬離子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物。給電子基團(tuán)255、散射光的干擾散射光:當(dāng)一束平行光照射在液體樣品上，大部分光線透過溶液，小部分光線由于光子和物質(zhì)分子相碰撞，使光子的運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生改變而向不同角度散射，這種光稱為散射光。瑞利光:光子和物質(zhì)發(fā)生彈性磁撞時(shí)，不發(fā)生能量交換，僅光子方向改變，這種散射光稱為瑞利光。其波長與入射光相同。拉曼光:光子和物質(zhì)發(fā)生非彈性磁撞，光子改變方向同時(shí)，與物質(zhì)有能量交換，散射光波長有所改變，增大或減小，這種散射光為拉曼光。波長增大的拉曼光對(duì)熒光測(cè)定有干擾26硫酸奎寧在不同激發(fā)波長下的熒光(a)與散射光譜(b)熒光光譜散射光譜瑞利光320nm拉曼光360nm拉曼光400nm熒光448nm激發(fā)320nm激發(fā)350nm瑞利光350nm27熒光定量分析2、熒光強(qiáng)度與濃度關(guān)系：（稀溶液）熒光強(qiáng)度F與溶液吸收光能的程度以及溶液中熒光物質(zhì)的量子效率有關(guān)。若熒光物質(zhì)濃度很小，滿足εbc<0.05時(shí)，熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)濃度成正比

F=k(I0-I)=KC1、熒光測(cè)定方向：激發(fā)光源垂直方向，避免透射光干擾。受激后，可在各個(gè)方向發(fā)射熒光，在透過光的方向不易測(cè)定F。返回28Instrumentation23Perkin-

-Elmer

204特殊點(diǎn)：有兩個(gè)單色器，光源與檢測(cè)器通常成直角。29A.Light

Sources

1.

Xenonarclamps

They

give

broad

continuum

spectra

in

UV/Vis

region

(200-1000

nm,

λmax

at

~

500

nm)

Very

high

radiation

power2.Low-pressureMercuryarclamps

They

have

greater

excitation

energy

at

selected

wavelengths

in

UV

region

(254,

302,

313,

546,

578,

691,

and

773

nm).3.

Laser

=

Light

Amplification

by

Stimulated

Emission

of

Radiation

i)

high

intensity

ii)

spectrally

pure

(monochromatic,

minimiz