分子生物學學生實驗

實驗一基因組DNA的抽提試劑：20×SSC、蛋白酶K（20mg/mL）、10%SDS、0.5MEDTA(2Na)ddH2O、液N、飽和酚、氯仿、異戊醇、正丁醇、無水乙醇、3M

NaAc、TE儀器及耗材：移液器、Tip頭、冷藏盒、液N罐、研缽、冰箱、棉手套、15mL

離心管（半透明）、1.5mL離心管、高速冷凍離心機、恒溫水浴鍋、藥匙、長頸玻璃吸管、移液管、酒精燈、pH計、廢液缸、滅菌鍋材料：家蠶后部絲腺和家蠶個體實驗流程1材料磨至粉末3.5mL酶解緩沖液液N50℃4h以上10mL酶解緩沖液20mg/mL蛋白酶K0.1mL10%SDS0.5mL0.5MEDTA1.0mLddH2O8.4mL實驗流程23.5mL酶解緩沖液加入3.5mL飽和酚混勻30min12000r/m×10min4℃4℃去沉淀加入3.5mL飽和酚和氯仿（1：1）30min混勻12000r/m×10min取上清等體積正丁醇混勻5min4000r/m×5min30min4℃AB重復A-B去上清終體積1mL以下0.1mL

NaAc、2.5mL

乙醇鉤出DNA溶于TE實驗二基因組DNA的RNase處理試劑：RNase

（10mg/mL）、ddH2O、飽和酚、氯仿、異戊醇、正丁醇、無水乙醇、3MNaAc、TE儀器及耗材：移液器、Tip頭、冷藏盒、冰箱、1.5mL離心管、高速冷凍離心機、恒溫水浴鍋、長頸玻璃吸管、移液管、酒精燈、廢液缸、滅菌鍋材料：新抽提的家蠶基因組DNA實驗流程0.5mL基因組DNA加入1μLRNase37℃1h12000r/m×10min去下層加入等體積酚和氯仿（1：1）12000r/m×10min等體積正丁醇4000r/m×5min取上清終體積0.1mL以下10μLNaAc、0.25mL

乙醇析出DNA等體積酚混勻30min4℃等體積酚混勻30min12000r/m×10min4℃去下層混勻30min12000r/m×10min4℃混勻30min70%乙醇洗鹽2次溶于TE實驗三DNA的濃度測定試劑：ddH2O、TE儀器及耗材：紫外分光光度計、Tip頭、冷藏盒、冰箱、1.5mL離心管、廢液缸、吸水紙材料：RNase處理過的家蠶基因組DNA實驗流程DNA樣品的濃度（μg/μl）＝

OD260×稀釋倍數(shù)（100）×50/1000(OD260＝1時，dsDNA濃度約為50μg/mL)2.0μL基因組DNA198μLTE混勻測OD260、OD280計算DNA濃度、分析DNA純度（OD260/OD280）計算公式：實驗四DNA的凝膠電泳檢測試劑：瓊脂糖、TBE、EB（1mg/mL)、ddH2O、DNA上樣緩沖液、

DNA標準分子量儀器及耗材：電泳儀及電泳槽、制膠槽、微波爐、三角瓶、Tip頭、冷藏盒、冰箱、1.5mL離心管、廢液缸、吸水紙、凝膠成像系統(tǒng)、水平儀。材料：RNase處理過的家蠶基因組DNA實驗流程稱取0.4g瓊脂糖250mL三角瓶40mL1×TBE微波爐加熱至完全溶化冷卻至60℃以下加入EB終濃度為0.5μg/mL倒入制膠槽室溫靜至40min

DNA（2-8μL）上樣緩沖液2μL混和后上樣電泳40-60min

拍照片實驗五DNA目的片段的PCR擴增試劑：引物、dNTP、TagDNA聚合酶、10×PCRbuffer、瓊脂糖、

TBE、EB（1mg/mL)、ddH2O、DNA上樣緩沖液、

DNA標準分子量儀器及耗材：PCR儀、電泳儀及電泳槽、制膠槽、微波爐、三角瓶、

Tip頭、冷藏盒、冰箱、1.5mL離心管、廢液缸、吸水紙、凝膠成像系統(tǒng)、水平儀。材料：RNase處理過的家蠶基因組DNA實驗流程PCR試劑完全溶化做1%瓊脂糖膠

PCR產(chǎn)物8μL上樣緩沖液2μL混和后上樣電泳40-60min

拍照片25μLP10.5μLP20.5μLdNTP2μL10×PCRbuffer2.5μLDNA1μLTagDNA聚合酶0.5μLddH2O18μL

PCR反應GenomeP1:5′-CAGGTGTATCGTAAATAGGATGTAA-3′，GenomeM1:5′-TTTCCATATTCACGGTTTCTGT-3′。PCR反應條件為：94℃預變性2min,然后94℃30sec52.5℃30sec，72℃45sec32個循環(huán)，最后72℃延伸10min。實驗六LB培養(yǎng)基的配制試劑：胰蛋白棟、酵母抽提物、NaCl、NaOH、ddH2O、Amp儀器及耗材：9cm培養(yǎng)皿、試管、磁力攪拌器、玻璃棒、三角瓶、

Tip頭、冷藏盒、冰箱、1.5mL離心管、廢液缸、吸水紙、超凈工作臺、滅菌鍋。配制方法LB液體培養(yǎng)基胰蛋白棟10g酵母抽提物5gNaCl10g1MNaOH調(diào)pH至7，加水至1000mL滅菌分裝（3mL)LB固體培養(yǎng)基：在LB液體中加入1.4%瓊脂粉，滅菌備用（需要時加Amp等）。實驗七感受態(tài)細胞的制備試劑：TG1或DH5α、LB培養(yǎng)基、75mmol/LCaCl2、無菌甘油儀器及耗材：試管、恒溫搖床、移液器、Tip頭、分光光度計（測

OD550）、冰盒、冰箱、離心機實驗流程培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管冰上放置10min5000r/min×10min4℃棄上清菌液一半體積的Cacl2冰上放置30min3000r/min×10min4℃棄上清200μLCacl2冰上放置4h感受態(tài)細胞注：也可加入總體積15%甘油，制備甘油菌，-70℃可保存6個月實驗八PCR產(chǎn)物的回收與連接反應試劑：膠回收試劑盒、電泳一套試劑、T載體、T4連接酶及緩沖液、ddH2O儀器及耗材：移液器、Tip頭、冰盒、冰箱、離心機、金屬浴、電泳一套、天秤、解剖刀（切膠用）實驗流程PCR產(chǎn)物電泳切膠DNA回收電泳檢驗（可?。┻B接反應T4DNA10×Buffer1μLT載體1μLddH2O5μLT4DNA連接酶1μL回收DNA2μL（0.4μg)連接過夜16℃實驗九

轉(zhuǎn)化與涂平板試劑：連接產(chǎn)物、感受態(tài)細胞、LB培養(yǎng)基（液體和固體

Amp+100μg/mL)、

X-gal(48mg/mL)、IPTG(96mg/mL)。儀器及耗材：移液器、Tip頭、冰盒、冰箱、離心機、水浴、涂菌環(huán)、酒精燈、培養(yǎng)箱實驗流程連接產(chǎn)物200μL感受態(tài)42℃90min1mL37℃預熱LB加入5μLX-gal、5μLIPTG留下200μL加入冰浴30min冰浴2min37℃60min振蕩培養(yǎng)4℃4000r/min5min涂Amp+平板37℃正面向上培養(yǎng)30min37℃倒置培養(yǎng)過夜

是根據(jù)載體的遺傳特征篩選重組子，如α-互補、抗生素基因等?，F(xiàn)在使用的載體都帶有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和前146個氨基酸的編碼信息。在這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點（MCS），它并不破壞讀框，但可使少數(shù)幾個氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能，這種載體適用于可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細胞。因此，宿主和質(zhì)粒編碼的片段雖都沒有酶活性，但它們同時存在時，可形成具有酶學活性的蛋白質(zhì)。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區(qū)段的宿主細胞與帶有完整近操縱基因區(qū)段的質(zhì)粒之間實現(xiàn)了互補，稱為α-互補。由α-互補而產(chǎn)生的LacZ+細菌在誘導劑IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時產(chǎn)生藍色菌落，因而易于識別。然而，當外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點后，會導致讀碼框改變，表達蛋白失活，使得帶有重組質(zhì)粒的細菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，又稱為藍白斑篩選。藍白斑篩選原理實驗十

質(zhì)粒DNA的提取試劑：LB培養(yǎng)基、Amp+、溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、無水乙醇、

3MNaAc、TE。儀器及耗材：移液器、Tip頭、冰盒、冰箱、離心機、水浴、酒精燈、培養(yǎng)箱、搖床。實驗流程取1.5mL菌液1.5mLEP管棄上清100μL溶液Ⅰ12000r/min10min加入4℃4000r/min1min200μL溶液Ⅱ取上清至新管室溫10min2倍體積的無水乙醇、1/10體積的NaAc離心室溫5min150μL溶液Ⅲ室溫3min-20℃30min12000r/min10min棄上清70%乙醇1mL洗鹽沉淀溶于50μLTE實驗十

質(zhì)粒DNA的酶切鑒定試劑：pst

Ⅰ及Buffer、標準分子量、電泳試劑一套儀器及耗材：金屬浴、移液器、Tip頭、冰盒、冰箱、電泳一套。實驗流程質(zhì)粒DNA1-2μLpst

Ⅰ1μL10×Buffer2μLH2O15-16μL10μL電泳檢測分析外源DNA片段的大小pUCm-T載體的圖譜實驗十一

動物組織總RNA的抽提試劑：氯仿、異丙醇、DEPC乙醇、Trizol試劑、液N儀器及耗材：超凈工作臺、研缽（DEPC處理）、移液器、Tip頭（RNasefree)、Ep管（RNasefree)、冰盒、冰箱、離心機。實驗流程組織塊研缽加入Trizol1mL12000r/min15min快速研磨至粉末移入Ep管取上清至新管完全溶化加入與上清等體積的異丙醇超凈臺室溫5min200μL氯仿室溫5min12000r/min10min棄上清75%乙醇1mL洗沉淀溶于100μLDEPC水中振蕩混勻4℃室溫10min4℃實驗十二

RNA濃度的測定與反轉(zhuǎn)錄試劑：模板RNA、Oligo(dt)primer(50μM)、RNasefreedH2O、

DEPC乙醇、5×M-MLVbuffer、dNTPMixture(各10mM）、

RNaseInhibitor(40U/μl)、RTaseM-MLV(RNaseH-)(200U/μl)儀器及耗材：超凈工作臺、金屬浴、移液器、Tip頭（RNasefree)、Ep管（RNasefree)、冰盒、冰箱、離心機。實驗流程RNA樣品稀釋50倍測定OD260值紫外分光光度計計算RNA濃度冰上2min后加入70℃10minOligo(dt)primer(50μM)1μlRNA1μgRNasefreedH2Oupto6μl5×M-MLVbuffer2μldNTPMixture(各10mM)0.5μlRNaseInhibitor(40U/μl)0.25μlRTaseM-MLV(RNaseH-)(200U/μl)0.25-1μlRNasefreedH2Oupto10μl42℃60min70℃15min-70℃保存RNA量（μg/mL

）=OD260×稀釋倍數(shù)×40μg/mLRNA量的計算公式：實驗十三

PCR檢測(A3)cDNA質(zhì)量試劑：A3引物、dNTP、TagDNA聚合酶、10×PCRbuffer、瓊脂糖、

TBE、EB（1mg/mL)、ddH2O、DNA上樣緩沖液、

DNA標準分子量儀器及耗材：PCR儀、電泳儀及電泳槽、制膠槽、微波爐、三角瓶、

Tip頭、冷藏盒、冰箱、1.5mL離心管、廢液缸、吸水紙、凝膠成像系統(tǒng)、水平儀。材料：RNase處理過的家蠶基因組DNA實驗流程PCR試劑完全溶化做1%瓊脂糖膠

PCR產(chǎn)物8μL上樣緩沖液2μL混和后上樣電泳40-60min

拍照片25μLP10.5μLP20.5μLdNTP2μL10×PCRbuffer2.5μLDNA1μLTagDNA聚合酶0.5μLddH2O18μL

PCR反應Actin-3P1AACACCCCGTCCTGCTCACTGActin-3P2GGGCGAGACGTGTGATTTCCT94℃預變性2min，然后94℃30sec，60℃30sec，72℃30sec22個循環(huán)，最后72℃延伸10min；PCR引物PCR程序?qū)嶒炇腟DS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）測定蛋白質(zhì)分子量一.實驗目的學習SDS測定蛋白質(zhì)分子量的原理。掌握垂直板電泳的操作方法。運用SDS測定蛋白質(zhì)分子量及染色鑒定。

二.實驗原理帶電質(zhì)點在電場中向帶有異相電荷的電極移動，這種現(xiàn)象稱為電泳。電泳分類：移動界面電泳、區(qū)帶電泳、穩(wěn)態(tài)電泳。區(qū)帶電泳是在半固相或膠狀介質(zhì)上加一個點或一薄層樣品溶液，然后加電場，分子在支持介質(zhì)上或支持介質(zhì)中遷移。支持介質(zhì)的作用主要是為了防止機械干擾和由于溫度變化以及大分子溶液的高密度而產(chǎn)生的對流。區(qū)帶電泳使用不同的支持介質(zhì)，早期有濾紙、玻璃珠、淀粉粒、纖維素粉、海砂、海綿、聚氯乙烯樹脂；以后有淀粉凝膠、瓊脂凝膠、醋酸纖維素膜，現(xiàn)在則多用聚丙烯酰胺（PAGE）和瓊脂糖凝膠。PAGE根據(jù)其有無濃縮效應，分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類，連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應。不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分，pH，凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應，分子篩效應，還具有濃縮效應，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進SDS（十二烷基磺酸鈉），SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)，強還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強還原劑的SDS溶液中，與SDS分子按比例結(jié)合，形成帶負電荷的SDS-蛋白質(zhì)復合物，這種復合物由于結(jié)合大量的SDS，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)形成僅保持原有分子大小為特征的負離子團塊，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異，由于SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合是按重量成比例的，因此在進行電泳時，蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決于分子大小。當分子量在15KD到200KD之間時，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標準蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標準曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標準曲線上求得分子量。SDS電泳的成功關鍵之一是電泳過程中，待別是樣品制備過程中蛋白質(zhì)與SDS的結(jié)合程度。影響它們結(jié)合的因素主要有三個：1、溶液中SDS單體的濃度，當單體濃度大于1mmol/L時大多數(shù)蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合的重量比為1:1.4，如果單休濃度降到0.5mmol/L以下時，兩者的結(jié)合比僅為1:0.4這樣就不能消除蛋白質(zhì)原有的電荷差別，為保證蛋白質(zhì)與SDS的充分結(jié)合，它們的重量比應該為1:4或1:32、樣品緩沖液的離子強度。SDS電泳的樣品緩沖液離子強度較低，通常是10～100mmol/L3、二硫鍵是否完全被還原采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測蛋白質(zhì)分子量時，只有完全打開二硫鍵，蛋白質(zhì)分子才能被解聚，SDS才能定量地結(jié)合到亞基上而給出相對遷移率和分子量對數(shù)的線性關系。因此在用SDS處理樣品同時往往用巰基乙醇處理，巰基乙醇是一種強還原劑，它使被還原的二硫鍵不易再氧化，從而使很多不溶性蛋白質(zhì)溶解而與SDS定量結(jié)合。有許多蛋白質(zhì)是由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（如胰凝乳蛋白酶）組成的，它們在SDS和巰基乙醇作用下，解離成亞基或單條肽鏈，因此這一類蛋白質(zhì)，測定時只是它們的亞基或單條肽鏈的MW。已發(fā)現(xiàn)有些蛋白質(zhì)不能用SDS測定分子量。如電荷異常或構(gòu)象異常的蛋白質(zhì)，帶有較大輔基的蛋白質(zhì)（某些糖蛋白）以及一些結(jié)構(gòu)蛋白，如膠原蛋白等。采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測蛋白質(zhì)分子量時，往往采取2種以上測定方法結(jié)合使用。目前其他常用測定相對分子量的方法有：聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)的相對分子量（有濃縮樣品特點，可分次加樣；不需解離亞基，適宜測定球蛋白，而對纖維蛋白有誤差。電泳需2000伏特小時）凝膠層析法測定蛋白質(zhì)相對分子量（特點方法簡單，樣品用量少，而且有時不需純物質(zhì)，一般不引起生物活性物質(zhì)的變化。局限性是pH6-8的范圍內(nèi)，線性關系比較好，但在極端pH時，蛋白質(zhì)有可能因變性而偏離。）

三.實驗試劑和器材1.材料：

低分子量標準蛋白試劑盒:

低分子量標準蛋白：兔磷酸化酶BMW=97,400

牛血清白蛋白MW=66,200

兔肌動蛋白MW=43,000

牛碳酸酐酶MW=31,000

胰蛋白酶抑制劑MW=20,100

雞蛋清溶菌酶MW=14,400

開封后溶于200μl蒸餾水，置-20℃保存，使用前室溫融化，沸水浴中加熱3-5分鐘后上樣。

樣品1：稱3mg樣品1，加2ml蒸餾水溶解。

2.實驗試劑

(1)30%丙烯酰胺（Acr）：稱Acr30g，甲叉雙丙烯酰胺

（Bis）0.8g，加蒸餾水至100ml，過濾后置棕色瓶中，

4℃貯存可用1-2月。

（2）10%SDS（十二烷基磺酸鈉）

（3）1.5mol/LpH8.8Tris-HCl緩沖液：稱取Tris18.2g，

加入50ml水，用1mol/L鹽酸調(diào)pH8.8，最后用蒸餾

水定容至100ml。

（4）1.0mol/LpH6.8Tris-HCl緩沖液：稱取Tris12.1g，加

入50ml水，用1mol/L鹽酸調(diào)pH6.8，最后用蒸餾水

定容至100ml。

（5）0.05mol/LpH8.0Tris-HCl緩沖液：稱取Tris0.6g，加

入50ml水，用1mol/L鹽酸調(diào)pH8.0，最后用蒸餾水定

容至100ml。

（7）10%過硫酸銨(AP)

（8）TEMED（四甲基乙二胺）

（9）樣品溶解液：SDS（100mg）+巰基乙醇（0.1ml）+

溴酚藍（2mg）+甘油（2g）+0.05mol/LpH8.0Tris-

HCl（2ml），最后定容至10ml。

（10）固定液：取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混勻。

（11）染色液：稱取考馬斯亮藍R2500.125g，加上述固定液

250ml，過濾后備用。

（12）脫色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸餾水定容至1000ml。

（13）電極緩沖液（內(nèi)含0.1%SDS，0.05mol/LTris-0.384mol/L甘氨酸緩沖液pH8.3）：稱Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸餾水使其溶解后定容至1000ml。

3.