現(xiàn)代生化技術(shù)

第十二章酶技術(shù)專業(yè)：發(fā)酵工程第一節(jié)酶生物合成的調(diào)節(jié)技術(shù)操縱子學(xué)說（雅格和莫諾德，1960年）酶的生物合成是在基因的控制之下進行的。這些基因包括調(diào)節(jié)基因（regulatorgene）、啟動基因（promotergene）、操縱基因（operatorgene）和結(jié)構(gòu)基因（structuralgene）。他們在DNA分子中按一定的次序排列，啟動基因、操縱基因和結(jié)構(gòu)基因一起被稱作操縱子（operon）。調(diào)節(jié)基因：可以產(chǎn)生一種阻遏蛋白。啟動基因：決定酶的合成能否進行。操縱基因：可以與調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的阻遏蛋白結(jié)合，從而操縱酶生物合成的時機和合成速率。結(jié)構(gòu)基因：決定合成某一種蛋白質(zhì)或RNA分子結(jié)構(gòu)相應(yīng)的一段DNA。（一）酶合成的誘導(dǎo)通過添加某種物質(zhì)，可使酶的合成開始或加速進行，這種作用稱為誘導(dǎo)作用。能夠引起誘導(dǎo)作用的物質(zhì)稱為誘導(dǎo)物。如：乳糖酶的誘導(dǎo)一、酶合成的調(diào)節(jié)機制1誘導(dǎo)物的選擇誘導(dǎo)物可分為三類(1)酶的作用底物如：大腸桿菌生產(chǎn)β-半乳糖苷酶(2)酶的反應(yīng)產(chǎn)物如：纖維二糖對纖維素酶有誘導(dǎo)能力(3)酶的底物類似物(最有效的誘導(dǎo)物)如：異丙基-β-D-硫代半乳糖苷對β-半乳糖苷酶的誘導(dǎo)2酶誘導(dǎo)合成的條件(1)基因必須完整。酶的合成是在基因的控制下進行的，若基因受到破壞或變異，酶的合成將受影響。①若酶所對應(yīng)的結(jié)構(gòu)基因改變，該酶將無法合成。②若同一操縱子中，第一位的結(jié)構(gòu)基因受破壞，則第二位及其以后的各個結(jié)構(gòu)基因及時完好，也無法合成相應(yīng)的酶。③若操縱基因變異，將出現(xiàn)兩種相反的情況：一是操縱基因變異后，阻抑蛋白不能與之結(jié)合，那么將不受誘導(dǎo)物或阻遏物的影響，酶都可以合成；二是操縱基因變異后，與阻抑蛋白牢固結(jié)合，是否有誘導(dǎo)物，酶均無法合成。④若調(diào)節(jié)基因變異，不能合成相應(yīng)的阻抑蛋白，那么也不受誘導(dǎo)物或阻遏物的影響。(2)阻抑蛋白本來與操作基因的親和力強，兩者原來結(jié)合在一起，使酶不能合成。當(dāng)添加誘導(dǎo)物時，誘導(dǎo)物與阻抑蛋白結(jié)合，使其與操作基因分離，才能進行酶的合成。(3)在添加誘導(dǎo)物時，細胞處于環(huán)境中，不能有高濃度的分解代謝阻遏物或其他強阻遏物存在，否則將無法誘導(dǎo)。（如乳糖和葡糖糖）3酶誘導(dǎo)合成的檢測

(1)胞外酶：在誘導(dǎo)一定時間后，每隔一定的時間取一定量的培養(yǎng)基連同細胞一起測定酶活力，同時測定細胞的量。計算單位細胞量的酶活力，再與不添加誘導(dǎo)物的數(shù)值對照，可知誘導(dǎo)效果如何。(2)胞內(nèi)酶：在添加誘導(dǎo)物后，每隔一定的時間取一定量的細胞，破碎，測定酶活力，算出單位細胞量的酶活力。與不添加誘導(dǎo)物的數(shù)值對照，可知誘導(dǎo)效果如何。二、酶生物合成的阻遏1阻遏作用的分類酶生物合成的阻遏作用有產(chǎn)物阻遏和分解代謝阻遏（1）產(chǎn)物阻遏作用產(chǎn)物阻遏是由于產(chǎn)物與阻遏蛋白結(jié)合后，使原來不與操作基因結(jié)合的阻遏蛋白變構(gòu)，而與操縱基因結(jié)合在一起，使酶的合成受阻。如：色氨酸操縱子酶阻遏（圖）(2)分解代謝物阻遏作用分解代謝物阻遏作用是指某些物質(zhì)(主要是指容易利用的碳源)經(jīng)過分解代謝產(chǎn)生的分解代謝物阻遏某些酶(主要是誘導(dǎo)酶)生物合成的現(xiàn)象。分解代謝物阻遏作用與環(huán)腺苷酸（cAMP）的濃度有關(guān)。如下圖2酶合成的阻遏與解除阻遏作用(1)使酶的合成受阻在細胞進行酶合成的過程中，添加一定量的阻遏物，如：末端產(chǎn)物、反應(yīng)產(chǎn)物或葡萄糖等容易利用的碳源。(2)使酶合成的阻遏作用解除必須除去阻遏物，控制阻遏物的含量或添加cAMP.3酶阻遏作用與解除阻遏合成的檢測方法一：在酶合成的過程中，添加不同量的阻遏物，然后每隔一段時間，取樣分析酶活力和細胞量，與空白試驗進行對照，即可檢測該物質(zhì)的阻遏效果。方法二：將細胞從含有阻遏物的培養(yǎng)基中取出，洗凈后，重新在含有阻遏物和不含阻遏物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再比較兩者的酶活力和細胞量，亦可檢測阻遏物的阻遏效果，并看到解除阻遏合成。第二節(jié)酶反應(yīng)動力學(xué)的研究一、酶反應(yīng)初速度的測定酶催化反應(yīng)速度：用單位時間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來表示。一般多采用單位時間內(nèi)產(chǎn)物的增加量來表示。測定酶反應(yīng)速度的步驟：(1)根據(jù)酶的催化專一性，選擇適宜的底物；(2)根據(jù)文獻資料或初步試驗結(jié)果，確定酶反應(yīng)的溫度和pH條件，溫度亦可選在25℃(3)在一定條件下，將一定量的酶液加到底物中，開始反應(yīng)，記錄時間。(4)每隔一定時間，取出適量的反應(yīng)液測定產(chǎn)物生成量或底物減少量。時間間隔開始階段可以短些，后期可間隔長些。(5)以反應(yīng)時間為橫坐標(biāo)，產(chǎn)物生成量或底物減少量為縱坐標(biāo)作出酶反應(yīng)過程曲線。AOBC時間產(chǎn)物生成量反應(yīng)初期直線斜率即酶反應(yīng)初速度酶反應(yīng)過程曲線二底物濃度對反應(yīng)速度的影響VVmVm/2Km[s]酶濃度一定時底物濃度對反應(yīng)速率的影響Km和vmax的測定如果根據(jù)上圖求出Km和vmax，常常要測定許多不同底物濃度下的反應(yīng)速度才能確定。為了方便起見，常常采用其他圖解法求得Km和vmax。常用的有雙倒數(shù)作圖法和但倒數(shù)作圖法等。

單倒數(shù)作圖法

縱軸截距：橫軸截距：斜率：伊蒂-霍夫斯第法

縱軸截距：橫軸截距：斜率：三最適溫度、熱穩(wěn)定性和活化能的測定1最適溫度測定任何酶反應(yīng)都有一個最適溫度范圍。在測定時，只要把其他的反應(yīng)條件固定，只改變反應(yīng)溫度，通過測定不同溫度下的反應(yīng)速度，以溫度為橫軸，以酶反應(yīng)速度為縱軸繪圖，就可以得出反應(yīng)最適溫度。如圖：

2熱穩(wěn)定性測定時間方法一：在底物濃度、酶濃度、pH等條件不變的條件下，在不同的溫度下（一般選用40℃以上的溫度），測定相同時間內(nèi)酶反應(yīng)速度，計算出不同溫度下相對酶反應(yīng)速度。方法二：在底物濃度、酶濃度、pH等條件不變的條件下，測定在某一較高溫度下不同時間的酶反應(yīng)速度，以反應(yīng)時間為橫坐標(biāo)，反應(yīng)速度為縱坐標(biāo)，繪出曲線。如圖3活化能測定斜率=-0.219Ea1/TlgK取對數(shù)積分、化為常用對數(shù)式中：Ea—活化能K1、K2——分別為溫度為T1、T2時測得的酶反應(yīng)速度常數(shù)阿累尼烏斯方程pH值四最適pH值的測定一種酶表現(xiàn)出最高催化活性時的pH值稱為該酶的最適pH值。通過測定不同pH條件下酶的催化反應(yīng)速度，就可以找出其最適pH值。五酶的激活與抑制添加某種物質(zhì)后，使酶的催化活性增強的現(xiàn)象，稱為酶的激活作用。起激活作用的物質(zhì)稱為激活劑。凡是使酶的催化活性減低的現(xiàn)象稱為酶的抑制作用。起抑制作用的物質(zhì)稱為抑制劑。酶的抑制作用競爭性抑制非競爭性抑制反競爭性抑制根據(jù)抑制劑[I]與酶[E]的結(jié)合方式，可以分成三種酶抑制作用的類型KI—抑制劑的解離常數(shù)（mol/l）可以看出，競爭性抑制動力學(xué)的主要特點是米氏常數(shù)值Km的改變，Vmax不受競爭性抑制劑的影響。根據(jù)穩(wěn)態(tài)學(xué)說競爭性抑制曲線：抑制劑濃度[I]增加時，