酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

生物化學(xué)酶的動(dòng)力學(xué)張秀華酶化學(xué)之二1酶化學(xué)之二§6.4酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)§6.5酶的分離提純及活力測(cè)定§6.6重要的酶類§6.7酶在醫(yī)藥學(xué)上的應(yīng)用2重點(diǎn)掌握：酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)-米氏方程，溫度、pH、激活劑、抑制劑對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響；掌握三種可逆抑制作用的動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)；了解：過(guò)渡態(tài)底物類似物對(duì)酶的抑制作用以及多酶體系、別構(gòu)酶、共價(jià)調(diào)節(jié)酶、同工酶、固定化酶的概念。熟悉：酶的分離提純的一般方法；酶活力、比活力的概念及其測(cè)定方法?！灸康呐c要求】3Section4KineticsofEnzyme-CatalyzedReaction

第四節(jié)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)4

酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)(kineticsofenzyme-catalyzedreactions)是研究酶促反應(yīng)速度及其影響因素的科學(xué)。酶促反應(yīng)的影響因素：酶的濃度、底物的濃度、pH、溫度、抑制劑和激活劑等。在探討各種因素對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響時(shí)，通常測(cè)定其初始速度來(lái)代表酶促反應(yīng)速度，即底物轉(zhuǎn)化量<5%時(shí)的反應(yīng)速度。

5

1902年，Henri用蔗糖酶水解蔗糖的實(shí)驗(yàn)中觀察到：在蔗糖酶濃度一定的條件下測(cè)定底物（蔗糖）濃度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響,它們之間的關(guān)系呈現(xiàn)矩形雙曲線(rectangularhyperbola)。如下圖所示：一、底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響6在底物濃度很低時(shí)，反應(yīng)速度隨底物濃度的增加而急驟加快，兩者呈正比關(guān)系，表現(xiàn)為一級(jí)反應(yīng)。

7隨著底物濃度的升高，酶逐漸被底物飽和，反應(yīng)速度不再呈正比例加快，反應(yīng)速度增加的幅度不斷下降。該階段為混合級(jí)反應(yīng)。8如果繼續(xù)加大底物濃度，反應(yīng)速度不再增加，表現(xiàn)為零級(jí)反應(yīng)。此時(shí)，無(wú)論底物濃度增加多大，反應(yīng)速度也不再增加，說(shuō)明酶已被底物所飽和。9為解釋酶被底物飽和現(xiàn)象，德國(guó)化學(xué)家Michaelis和Menten做了大量的定量研究，積累了足夠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，提出了酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)方程：10為解釋酶被底物飽和現(xiàn)象，德國(guó)化學(xué)家Michaelis和Menten做了大量的定量研究，積累了足夠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，提出了酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)方程：11根據(jù)中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)：E+SESE+Pk2k1k3k4米氏方程是在三個(gè)假設(shè)的基礎(chǔ)上建立的：1.反應(yīng)初期，產(chǎn)物生成量極少，E+P→ES可忽略不計(jì)；2.[S]>>[E],[S]-[ES]≈[S]3.E與S迅速生成ES復(fù)合物，并達(dá)到平衡（穩(wěn)態(tài)）即[ES]的生成速度等于[ES]的分解速度；（一）米氏方程12

ES的形成速度＝k1[E][S]ES的分解速度＝（k2＋k3）[ES]

穩(wěn)態(tài)平衡下:[ES]的形成速度等于[ES]分解速度

k1[E][S]＝（k2＋k3）[ES]

即：[E][S]/[ES]=（k2＋k3）/k1=Km

[ES]=[E][S]/KmE+SESE+Pk2k1k3k413

[ES]=[E][S]/Km恒態(tài)時(shí)[E]=[E0]

－[ES]代入上式得：

[ES]=[E0]

[S]/(Km＋[S])

而酶促反應(yīng)的生成速度即是產(chǎn)物的生成速度：

V＝k3[ES]=k3[E0]

[S]/(Km＋[S])

＝Vmax[S]/(Km＋[S])其中Vmax＝k3[E0]

即為酶促反應(yīng)可達(dá)到的最大反應(yīng)速度（[s]很大，E全部轉(zhuǎn)為ES，[ES]=[E0],此時(shí)V=Vmax)

E+SESE+Pk2k1k3k414

Vmax指該酶促反應(yīng)的最大速度，[S]為底物濃度，Km是米氏常數(shù)，VO是在某一底物濃度時(shí)相應(yīng)的反應(yīng)速度。從米氏方程可知：15當(dāng)?shù)孜餄舛群艿蜁r(shí)[S]<<Km，則V≌Vmax[S]/Km，反應(yīng)速度與底物濃度呈正比16當(dāng)?shù)孜餄舛群芨邥r(shí)[S]>>Km，此時(shí)V≌Vmax

，反應(yīng)速度達(dá)最大速度，底物濃度再增高也不影響反應(yīng)速度。17當(dāng)=

Vmax／2時(shí)，Km=[S]。因此，Km等于酶促反應(yīng)速度達(dá)最大值一半時(shí)的底物濃度。──Vmax2Vmax[S]

Km+[S]

=(二）米氏常數(shù)（Km）的意義和應(yīng)用18Km可以反映酶與底物親和力的大?。?/p>

Km

值愈大，酶與底物的親和力愈??；Km值愈小，酶與底物親和力愈大。酶與底物親和力大，表示不需要很高的底物濃度，便可容易地達(dá)到最大反應(yīng)速度。(二）米氏常數(shù)（Km）的意義和應(yīng)用Km等于酶促反應(yīng)速度達(dá)最大值一半時(shí)的底物濃度19Km

值是酶的特征性常數(shù)：與酶的性質(zhì)，底物和酶促反應(yīng)條件（如溫度、pH、有無(wú)抑制劑等）有關(guān)，而與酶的濃度無(wú)關(guān)。酶的種類不同，Km值不同，同一種酶與不同底物作用時(shí)，Km

值也不同。各種酶的Km

值范圍很廣，大致在10-1～10-7M

之間。(二）米氏常數(shù)（Km）的意義和應(yīng)用20Km在實(shí)際應(yīng)用中的重要意義（1）判斷酶的最佳底物：如果一種酶作用于不同底物，就有幾個(gè)不同的Km值，其中Km最小對(duì)應(yīng)的底物就是酶的天然底物。如蔗糖酶既可催化蔗糖水解(Km=28mmol/L),也可催化棉子糖水解(Km=350mmol/L)，兩者相比，蔗糖為該酶的天然底物。21（3）判斷反應(yīng)方向或趨勢(shì)：催化正逆反應(yīng)的酶，其正逆兩向的反應(yīng)的Km不同，如果正逆反應(yīng)的底物濃度相當(dāng)，則反應(yīng)趨向于Km小對(duì)應(yīng)底物的反應(yīng)方向。（2）計(jì)算一定速度下的底物濃度：如某一反應(yīng)要求的反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度的99%，則[S]=99Km22（4）反應(yīng)激活劑或抑制劑的存在：酶不僅與底物結(jié)合，也可與其他配體結(jié)合（如激活劑、抑制劑）而影響Km值。因此，若發(fā)現(xiàn)某種酶在體外測(cè)定的Km值與體內(nèi)差別較大，可以預(yù)料體內(nèi)可能存在著天然激活劑降低了Km值或抑制劑提高了Km值。

同時(shí)也可用不同物質(zhì)對(duì)Km值的影響，識(shí)別生理上有重要意義的調(diào)節(jié)物。23（三）Km的求法24（三）Km的求法25雙倒數(shù)作圖法雙倒數(shù)方程直線斜率：Km/Vmax1/V的截距:1/Vmax1/[S]的截距：-1/K26二、pH的影響與最適pH大多數(shù)酶活性受pH影響顯著，在某一pH下表現(xiàn)最大活力，高于或低于此pH，酶活力顯著下降。酶表現(xiàn)最大活力的pH稱為酶的最適PH。典型的最適pH曲線是鐘罩型曲線，但有的酶速度-pH曲線并非一定呈鐘罩型。27大多數(shù)酶的最適pH在5～8之間，但也有例外，如胃蛋白酶的最適pH約1.5，肝精氨酸酶最適pH約為9.8。一些酶的最適pH1.528

pH對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響機(jī)理：1、pH影響酶和底物的解離:

酶活性基團(tuán)的解離和底物的解離狀態(tài)都受pH影響，在某一反應(yīng)pH下，二者的解離狀態(tài)最有利于它們的結(jié)合，酶促反應(yīng)表現(xiàn)出最大活力。2、pH影響酶分子的構(gòu)象：過(guò)高或過(guò)低pH都會(huì)影響酶分子活性中心的構(gòu)象，或引起酶的變性失活。29一般來(lái)說(shuō)，酶促反應(yīng)速度隨溫度的增高而加快。但當(dāng)溫度增加達(dá)到某一點(diǎn)后，由于酶蛋白的熱變性作用，反應(yīng)速度迅速下降，直到完全失活。三、溫度的影響與最適溫度30酶促反應(yīng)速度隨溫度升高而達(dá)到一最大值時(shí)對(duì)應(yīng)的溫度就稱為酶的最適溫度(optimumtempe-rature)。三、溫度的影響與最適溫度31溫度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響機(jī)理32最適溫度不是酶的特征常數(shù)，因?yàn)槊傅淖钸m溫度受酶的純度、底物、激活劑、抑制劑、酶反應(yīng)時(shí)間等因素的影響。因此，酶的最適溫度與其它反應(yīng)條件有關(guān)。三、溫度的影響與最適溫度33四、酶濃度對(duì)反應(yīng)速度的影響在一定溫度和pH下，酶促反應(yīng)在底物濃度大大超過(guò)酶濃度時(shí)，反應(yīng)初速度與酶的濃度呈正比，即ν=k[E]

。34五、激活劑的影響能提高酶的活性，促使酶促反應(yīng)速度加快的物質(zhì)稱為激活劑（activator）。酶的激活劑大多數(shù)是無(wú)機(jī)離子（K+、Mg2+、Mn2+、等）。能除去抑制劑的物質(zhì)也可以稱為激活劑，如乙二胺四乙酸（EDTA）（金屬螯合劑）能除去金屬雜質(zhì)。通常，酶對(duì)激活劑有一定的選擇性，且有一定的濃度要求，一種酶的激活劑對(duì)另一種酶來(lái)說(shuō)可能是抑制劑，當(dāng)激活劑的濃度超過(guò)一定的范圍時(shí)，它就成為抑制劑。

35六、抑制劑的影響凡能使酶的活性下降而不引起酶蛋白變性的物質(zhì)稱為酶的抑制劑(inhibitor)。抑制劑對(duì)酶有一定的選擇性，一種抑制劑只能引起某一類或幾類酶的抑制。使酶變性失活（稱為酶的鈍化）的因素如強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等，不屬于抑制劑。按照抑制劑的抑制作用，可將其分為不可逆抑制和可逆抑制兩大類。36抑制劑與酶分子的必需基團(tuán)共價(jià)結(jié)合引起酶活性喪失，不能采用透析、超濾等方法除去抑制劑而恢復(fù)酶活力。按其作用特點(diǎn)，又分專一性不可逆抑制及非專一性不可逆抑制兩種。（一）不可逆抑制371.非專一性不可逆抑制抑制劑與酶分子中一類或幾類基團(tuán)作用，不論是必需基團(tuán)與否，皆可共價(jià)結(jié)合，由于其中必需基團(tuán)也被抑制劑結(jié)合，從而導(dǎo)致酶的抑制失活。

381.非專一性不可逆抑制某些重金屬（Pb2+、Cu2+、Hg2+）能與酶分子的巰基進(jìn)行不可逆結(jié)合，許多以巰基作為必需基團(tuán)的酶(通稱巰基酶)，會(huì)因此而遭受抑制。用二巰基丙醇或二巰基丁二酸鈉等含巰基的化合物可使酶復(fù)活。

39該抑制劑專一地作用于酶的活性中心或其必需基團(tuán)，進(jìn)行共價(jià)結(jié)合，從而抑制酶的活性。2.專一性不可逆抑制

40有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑能專一作用于膽堿酯酶活性中心的絲氨酸殘基，不可逆地抑制酶活性，使其失去水解乙酰膽堿（Ach）的作用，造成Ach大量蓄積，使一些以乙酰膽堿為傳導(dǎo)介質(zhì)的神經(jīng)系統(tǒng)處于過(guò)度興奮狀態(tài)，引起神經(jīng)中毒癥狀。2.專一性不可逆抑制

41（二）可逆抑制作用抑制劑與酶以非共價(jià)鍵結(jié)合，用透析等物理方法除去抑制劑后，酶的活性能恢復(fù)，即抑制劑與酶的結(jié)合是可逆的。可逆抑制作用包括競(jìng)爭(zhēng)性抑制、反競(jìng)爭(zhēng)性抑制和非競(jìng)爭(zhēng)性抑制幾種類型。

421.競(jìng)爭(zhēng)性抑制(competitiveinhibition)抑制劑(I)和底物(S)對(duì)游離酶(E)的結(jié)合有競(jìng)爭(zhēng)作用，互相排斥，已結(jié)合底物的ES復(fù)合體，不能再結(jié)合I。同樣已結(jié)合抑制劑的EI復(fù)合體，不能再結(jié)合S。(1)含義和反應(yīng)式43競(jìng)爭(zhēng)性抑制44Km

（1+）＋〔S〕〔I〕KiVmax〔S〕Vi＝（2）競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的動(dòng)力學(xué)方程45

競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑雙倒數(shù)曲線，如下圖所示：46有I存在時(shí)，Km值增大Vmax值不變，Km/Vmax增大。Kmapp隨[I]濃度增大而增大。抑制程度取決于[I]與[S]，[I]越大，則抑制作用越大；但增加[S]可使抑制作用減弱甚至消除。（3）競(jìng)爭(zhēng)性抑制動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)47磺胺類藥物對(duì)二氫葉酸合成酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制

對(duì)氨基苯甲酸磺胺類+二氫蝶呤啶+對(duì)氨基苯甲酸谷氨酸FH2合成酶FH248

FH2能轉(zhuǎn)變?yōu)镕H4，它是細(xì)菌合成核酸不可缺少的輔酶。由于磺胺藥是FH2合成酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，進(jìn)而減少細(xì)菌體內(nèi)四氫葉酸的合成，使核酸合成障礙，從而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖。+二氫蝶呤啶+對(duì)氨基苯甲酸磺胺類谷氨酸FH2合成酶FH2磺胺類藥物對(duì)二氫葉酸合成酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制

49磺胺藥物的抑菌作用50I和S與E的結(jié)合互不相關(guān)，既不排斥，也不促進(jìn)。S可與E結(jié)合，也可與EI復(fù)合體結(jié)合；I可與E結(jié)合生成EI，也可與ES復(fù)合物結(jié)合生成ESI。一旦形成ESI復(fù)合物，再不能釋放形成產(chǎn)物P。2.非競(jìng)爭(zhēng)性抑制(non-competitiveinhibition)51非競(jìng)爭(zhēng)性抑制動(dòng)力學(xué)圖Vm[S]·v=(Km+[S])(1+[I]Ki）52非競(jìng)爭(zhēng)性抑制動(dòng)力學(xué)圖V1/Vmax1/Vmax（1+[I]/Ki)Vmax=appVmax1+[I]/Ki53Km不變，Vm減??；Km/Vmax增大。

隨[I]的增加而減?。灰种瞥潭扰c[I]成正比，而與[S]無(wú)關(guān)。非競(jìng)爭(zhēng)性抑制的動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)VmaxappVmax=appVmax1+[I]/Ki543.反競(jìng)爭(zhēng)性抑制（uncompetitiveinhibition)反競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑不能與游離酶結(jié)合,

而是與ES結(jié)合成EIS，并阻止產(chǎn)物生成，稱酶的反競(jìng)爭(zhēng)性抑制。55酶561Vi＝KmVmax1〔S〕+1Vmax〔I〕Ki(1+)Vi＝Vmax〔S〕〔S〕〔I〕Ki（1＋）Km＋反競(jìng)爭(zhēng)性抑制動(dòng)力學(xué)圖Km1-（1+Ki[I])57當(dāng)I存在時(shí)，Km和Vmax都減小，Km/Vmax不變；表觀Km和Vmax都隨[I]的增加而減小。抑制程度與[I]、[S]均成正比。反競(jìng)爭(zhēng)性抑制的特點(diǎn)Vmax=appVmax1+[I]/KiKm=appKm1+[I]/Ki5859某種類似于一個(gè)酶促反應(yīng)中底物的過(guò)渡態(tài)的物質(zhì)是酶的有效抑制劑，這種物質(zhì)稱為過(guò)渡態(tài)類似物。酶的自殺底物是一類酶的天然底物的衍生物或類似物。（三）過(guò)渡態(tài)類似物與自殺底物60在自殺S的結(jié)構(gòu)中含有一種化學(xué)活性基團(tuán)，當(dāng)E把它們作為底物來(lái)結(jié)合時(shí)，其潛在的化學(xué)基團(tuán)能被解開(kāi)或激活，并與酶的活性部位發(fā)生共價(jià)結(jié)合，使結(jié)合物停留在某種狀態(tài)，從而不能分解成產(chǎn)物，酶因而致“死”，此過(guò)程稱為酶的自殺，這類底物稱為自殺底物(suicidesubstrate)。（三）過(guò)渡態(tài)類似物與自殺底物61第五節(jié)酶的分離、提純和活性測(cè)定Section5theseparation,purificationandmeasurationofactivityofenzyme62

一、酶的分離提純胞外酶：水解酶類，易收集，不必破碎細(xì)胞，緩沖液或水浸泡細(xì)胞或發(fā)酵液離心得到上清液即為含酶液。

胞內(nèi)酶：除水解酶類外的其它酶類，需破碎細(xì)胞，不同的酶分布部位不同，最好先將酶存在的細(xì)胞器分離后再破碎該細(xì)胞器，然后將酶用適當(dāng)?shù)木彌_溶液或水抽提。酶在細(xì)胞中的分布：63分離提純的原則選擇酶含量豐富的材料避免蛋白質(zhì)變性：避免強(qiáng)酸、強(qiáng)堿，低溫每一步驟，都要測(cè)定酶的總活力和比活力64每一步都要測(cè)定酶的純度(比活力)并計(jì)算純化倍數(shù)和產(chǎn)率以決定該步驟的效益和取舍。酶的比活力(純度)=活力單位數(shù)/毫克蛋白純化倍數(shù)=每次比活力/第一次比活力產(chǎn)率=(每次總活力/第一次總活力)×100%純化分離提純的步驟選材-破碎細(xì)胞-抽提-純化-保存65二、酶的活力測(cè)定(定量)

酶的活力:一般把酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力稱為酶活力。

酶的活力大小的表示：在一定條件下E所催化的某一化學(xué)反應(yīng)的速度，一定量的酶制劑催化某一化學(xué)反應(yīng)速度快，活力大；反之，活力小。66酶活力單位:最適條件下,單位時(shí)間內(nèi),酶催化底物的減少量或產(chǎn)物的生成量。

1961年國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)統(tǒng)一規(guī)定1個(gè)酶活力國(guó)際單位（1U）:特定條件下,1分鐘內(nèi)生成1微摩爾/升產(chǎn)物的酶量(或轉(zhuǎn)化1微摩爾底物的酶量)。

1972年國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)又推薦一種新單位，即Katal(Kat)單位：最適條件下,每秒鐘可使1mol/L底物轉(zhuǎn)化的酶量。即1Kat=6×107IU67第六節(jié)重要的酶類一、寡聚酶(oligomericenzyme)含有2個(gè)以上的亞基，分子量大（35000以上）?？煞譃楹嗤瑏喕墓丫勖负秃煌瑏喕墓丫勖浮：煌瑏喕墓丫勖傅牟煌瑏喕鶊?zhí)行不同的功能。催化功能和底物載體的功能。68二、同工酶(isoenzyme)概念：

催化相同的化學(xué)反應(yīng)，但分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)乃至免疫學(xué)性質(zhì)不同的一組酶。

存在于同一種屬或不同種屬，同一個(gè)體的不同組織、同一細(xì)胞的不同亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中。乳酸脫氫酶（LDH）是研究的最多的同工酶，具有多種分子組成形式：LDH5（M4）、LDH4（M3H）、LDH3（M2H2）、LDH2（MH3）、LDH1（H4）。69乳酸脫氫酶同工酶形成示意圖多肽亞基mRNA四聚體結(jié)構(gòu)基因ab乳酸脫氫酶同工酶電泳圖譜+–H4MH3M2H2M3HM4點(diǎn)樣線70不同組織中LDH同工酶的電泳圖譜LDH1(H4)LDH2(H3M)LDH3(H2M2)LDH4(HM3)LDH5(M4)心肌腎肝骨骼肌血清-+原點(diǎn)71四、調(diào)節(jié)酶

該類酶分子中有活性區(qū)和調(diào)節(jié)區(qū)，其催化活力可因與調(diào)節(jié)劑的結(jié)合而改變，有調(diào)節(jié)代謝反應(yīng)的能力。分為共價(jià)調(diào)節(jié)和變構(gòu)調(diào)節(jié)。72（一）共價(jià)調(diào)節(jié)酶調(diào)節(jié)劑通過(guò)共價(jià)鍵與酶分子結(jié)合,以增減酶分子上的基團(tuán)來(lái)改變酶的活性(高/低,有/無(wú))。

常見(jiàn)類型磷酸化與脫磷酸化（最常見(jiàn)）乙?；兔撘阴；谆兔摷谆佘栈兔撓佘栈璖H與－S－S互變73變構(gòu)酶又稱為別構(gòu)酶，分子中除活性中心外,還有別構(gòu)中心(結(jié)合調(diào)節(jié)物或稱效應(yīng)劑)。變構(gòu)效應(yīng):調(diào)節(jié)物與別構(gòu)中心結(jié)合引起酶蛋白構(gòu)象變化,使酶活性中心對(duì)底物的結(jié)合和催化作用受影響(改變酶活性),從而調(diào)節(jié)酶促反應(yīng)速度。（二）變構(gòu)酶74變構(gòu)劑：凡能使酶分子發(fā)生別構(gòu)作用的物質(zhì)。變構(gòu)激活劑:酶產(chǎn)生變構(gòu)效應(yīng)后，導(dǎo)致酶激