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文檔簡介
生物化學酶的動力學張秀華酶化學之二1酶化學之二§6.4酶促反應動力學§6.5酶的分離提純及活力測定§6.6重要的酶類§6.7酶在醫(yī)藥學上的應用2重點掌握:酶促反應動力學-米氏方程,溫度、pH、激活劑、抑制劑對酶促反應速度的影響;掌握三種可逆抑制作用的動力學特點;了解:過渡態(tài)底物類似物對酶的抑制作用以及多酶體系、別構酶、共價調節(jié)酶、同工酶、固定化酶的概念。熟悉:酶的分離提純的一般方法;酶活力、比活力的概念及其測定方法。【目的與要求】3Section4KineticsofEnzyme-CatalyzedReaction
第四節(jié)酶促反應動力學4
酶促反應動力學(kineticsofenzyme-catalyzedreactions)是研究酶促反應速度及其影響因素的科學。酶促反應的影響因素:酶的濃度、底物的濃度、pH、溫度、抑制劑和激活劑等。在探討各種因素對酶促反應速度的影響時,通常測定其初始速度來代表酶促反應速度,即底物轉化量<5%時的反應速度。
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1902年,Henri用蔗糖酶水解蔗糖的實驗中觀察到:在蔗糖酶濃度一定的條件下測定底物(蔗糖)濃度對酶反應速度的影響,它們之間的關系呈現(xiàn)矩形雙曲線(rectangularhyperbola)。如下圖所示:一、底物濃度對酶反應速度的影響6在底物濃度很低時,反應速度隨底物濃度的增加而急驟加快,兩者呈正比關系,表現(xiàn)為一級反應。
7隨著底物濃度的升高,酶逐漸被底物飽和,反應速度不再呈正比例加快,反應速度增加的幅度不斷下降。該階段為混合級反應。8如果繼續(xù)加大底物濃度,反應速度不再增加,表現(xiàn)為零級反應。此時,無論底物濃度增加多大,反應速度也不再增加,說明酶已被底物所飽和。9為解釋酶被底物飽和現(xiàn)象,德國化學家Michaelis和Menten做了大量的定量研究,積累了足夠的實驗數(shù)據(jù),提出了酶促反應的動力學方程:10為解釋酶被底物飽和現(xiàn)象,德國化學家Michaelis和Menten做了大量的定量研究,積累了足夠的實驗數(shù)據(jù),提出了酶促反應的動力學方程:11根據(jù)中間產(chǎn)物學說:E+SESE+Pk2k1k3k4米氏方程是在三個假設的基礎上建立的:1.反應初期,產(chǎn)物生成量極少,E+P→ES可忽略不計;2.[S]>>[E],[S]-[ES]≈[S]3.E與S迅速生成ES復合物,并達到平衡(穩(wěn)態(tài))即[ES]的生成速度等于[ES]的分解速度;(一)米氏方程12
ES的形成速度=k1[E][S]ES的分解速度=(k2+k3)[ES]
穩(wěn)態(tài)平衡下:[ES]的形成速度等于[ES]分解速度
k1[E][S]=(k2+k3)[ES]
即:[E][S]/[ES]=(k2+k3)/k1=Km
[ES]=[E][S]/KmE+SESE+Pk2k1k3k413
[ES]=[E][S]/Km恒態(tài)時[E]=[E0]
-[ES]代入上式得:
[ES]=[E0]
[S]/(Km+[S])
而酶促反應的生成速度即是產(chǎn)物的生成速度:
V=k3[ES]=k3[E0]
[S]/(Km+[S])
=Vmax[S]/(Km+[S])其中Vmax=k3[E0]
即為酶促反應可達到的最大反應速度([s]很大,E全部轉為ES,[ES]=[E0],此時V=Vmax)
E+SESE+Pk2k1k3k414
Vmax指該酶促反應的最大速度,[S]為底物濃度,Km是米氏常數(shù),VO是在某一底物濃度時相應的反應速度。從米氏方程可知:15當?shù)孜餄舛群艿蜁r[S]<<Km,則V≌Vmax[S]/Km,反應速度與底物濃度呈正比16當?shù)孜餄舛群芨邥r[S]>>Km,此時V≌Vmax
,反應速度達最大速度,底物濃度再增高也不影響反應速度。17當=
Vmax/2時,Km=[S]。因此,Km等于酶促反應速度達最大值一半時的底物濃度。──Vmax2Vmax[S]
Km+[S]
=(二)米氏常數(shù)(Km)的意義和應用18Km可以反映酶與底物親和力的大?。?/p>
Km
值愈大,酶與底物的親和力愈?。籏m值愈小,酶與底物親和力愈大。酶與底物親和力大,表示不需要很高的底物濃度,便可容易地達到最大反應速度。(二)米氏常數(shù)(Km)的意義和應用Km等于酶促反應速度達最大值一半時的底物濃度19Km
值是酶的特征性常數(shù):與酶的性質,底物和酶促反應條件(如溫度、pH、有無抑制劑等)有關,而與酶的濃度無關。酶的種類不同,Km值不同,同一種酶與不同底物作用時,Km
值也不同。各種酶的Km
值范圍很廣,大致在10-1~10-7M
之間。(二)米氏常數(shù)(Km)的意義和應用20Km在實際應用中的重要意義(1)判斷酶的最佳底物:如果一種酶作用于不同底物,就有幾個不同的Km值,其中Km最小對應的底物就是酶的天然底物。如蔗糖酶既可催化蔗糖水解(Km=28mmol/L),也可催化棉子糖水解(Km=350mmol/L),兩者相比,蔗糖為該酶的天然底物。21(3)判斷反應方向或趨勢:催化正逆反應的酶,其正逆兩向的反應的Km不同,如果正逆反應的底物濃度相當,則反應趨向于Km小對應底物的反應方向。(2)計算一定速度下的底物濃度:如某一反應要求的反應速度達到最大反應速度的99%,則[S]=99Km22(4)反應激活劑或抑制劑的存在:酶不僅與底物結合,也可與其他配體結合(如激活劑、抑制劑)而影響Km值。因此,若發(fā)現(xiàn)某種酶在體外測定的Km值與體內(nèi)差別較大,可以預料體內(nèi)可能存在著天然激活劑降低了Km值或抑制劑提高了Km值。
同時也可用不同物質對Km值的影響,識別生理上有重要意義的調節(jié)物。23(三)Km的求法24(三)Km的求法25雙倒數(shù)作圖法雙倒數(shù)方程直線斜率:Km/Vmax1/V的截距:1/Vmax1/[S]的截距:-1/K26二、pH的影響與最適pH大多數(shù)酶活性受pH影響顯著,在某一pH下表現(xiàn)最大活力,高于或低于此pH,酶活力顯著下降。酶表現(xiàn)最大活力的pH稱為酶的最適PH。典型的最適pH曲線是鐘罩型曲線,但有的酶速度-pH曲線并非一定呈鐘罩型。27大多數(shù)酶的最適pH在5~8之間,但也有例外,如胃蛋白酶的最適pH約1.5,肝精氨酸酶最適pH約為9.8。一些酶的最適pH1.528
pH對酶促反應速度的影響機理:1、pH影響酶和底物的解離:
酶活性基團的解離和底物的解離狀態(tài)都受pH影響,在某一反應pH下,二者的解離狀態(tài)最有利于它們的結合,酶促反應表現(xiàn)出最大活力。2、pH影響酶分子的構象:過高或過低pH都會影響酶分子活性中心的構象,或引起酶的變性失活。29一般來說,酶促反應速度隨溫度的增高而加快。但當溫度增加達到某一點后,由于酶蛋白的熱變性作用,反應速度迅速下降,直到完全失活。三、溫度的影響與最適溫度30酶促反應速度隨溫度升高而達到一最大值時對應的溫度就稱為酶的最適溫度(optimumtempe-rature)。三、溫度的影響與最適溫度31溫度對酶促反應速度的影響機理32最適溫度不是酶的特征常數(shù),因為酶的最適溫度受酶的純度、底物、激活劑、抑制劑、酶反應時間等因素的影響。因此,酶的最適溫度與其它反應條件有關。三、溫度的影響與最適溫度33四、酶濃度對反應速度的影響在一定溫度和pH下,酶促反應在底物濃度大大超過酶濃度時,反應初速度與酶的濃度呈正比,即ν=k[E]
。34五、激活劑的影響能提高酶的活性,促使酶促反應速度加快的物質稱為激活劑(activator)。酶的激活劑大多數(shù)是無機離子(K+、Mg2+、Mn2+、等)。能除去抑制劑的物質也可以稱為激活劑,如乙二胺四乙酸(EDTA)(金屬螯合劑)能除去金屬雜質。通常,酶對激活劑有一定的選擇性,且有一定的濃度要求,一種酶的激活劑對另一種酶來說可能是抑制劑,當激活劑的濃度超過一定的范圍時,它就成為抑制劑。
35六、抑制劑的影響凡能使酶的活性下降而不引起酶蛋白變性的物質稱為酶的抑制劑(inhibitor)。抑制劑對酶有一定的選擇性,一種抑制劑只能引起某一類或幾類酶的抑制。使酶變性失活(稱為酶的鈍化)的因素如強酸、強堿等,不屬于抑制劑。按照抑制劑的抑制作用,可將其分為不可逆抑制和可逆抑制兩大類。36抑制劑與酶分子的必需基團共價結合引起酶活性喪失,不能采用透析、超濾等方法除去抑制劑而恢復酶活力。按其作用特點,又分專一性不可逆抑制及非專一性不可逆抑制兩種。(一)不可逆抑制371.非專一性不可逆抑制抑制劑與酶分子中一類或幾類基團作用,不論是必需基團與否,皆可共價結合,由于其中必需基團也被抑制劑結合,從而導致酶的抑制失活。
381.非專一性不可逆抑制某些重金屬(Pb2+、Cu2+、Hg2+)能與酶分子的巰基進行不可逆結合,許多以巰基作為必需基團的酶(通稱巰基酶),會因此而遭受抑制。用二巰基丙醇或二巰基丁二酸鈉等含巰基的化合物可使酶復活。
39該抑制劑專一地作用于酶的活性中心或其必需基團,進行共價結合,從而抑制酶的活性。2.專一性不可逆抑制
40有機磷殺蟲劑能專一作用于膽堿酯酶活性中心的絲氨酸殘基,不可逆地抑制酶活性,使其失去水解乙酰膽堿(Ach)的作用,造成Ach大量蓄積,使一些以乙酰膽堿為傳導介質的神經(jīng)系統(tǒng)處于過度興奮狀態(tài),引起神經(jīng)中毒癥狀。2.專一性不可逆抑制
41(二)可逆抑制作用抑制劑與酶以非共價鍵結合,用透析等物理方法除去抑制劑后,酶的活性能恢復,即抑制劑與酶的結合是可逆的??赡嬉种谱饔冒ǜ偁幮砸种?、反競爭性抑制和非競爭性抑制幾種類型。
421.競爭性抑制(competitiveinhibition)抑制劑(I)和底物(S)對游離酶(E)的結合有競爭作用,互相排斥,已結合底物的ES復合體,不能再結合I。同樣已結合抑制劑的EI復合體,不能再結合S。(1)含義和反應式43競爭性抑制44Km
(1+)+〔S〕〔I〕KiVmax〔S〕Vi=(2)競爭性抑制劑的動力學方程45
競爭性抑制劑雙倒數(shù)曲線,如下圖所示:46有I存在時,Km值增大Vmax值不變,Km/Vmax增大。Kmapp隨[I]濃度增大而增大。抑制程度取決于[I]與[S],[I]越大,則抑制作用越大;但增加[S]可使抑制作用減弱甚至消除。(3)競爭性抑制動力學特點47磺胺類藥物對二氫葉酸合成酶的競爭性抑制
對氨基苯甲酸磺胺類+二氫蝶呤啶+對氨基苯甲酸谷氨酸FH2合成酶FH248
FH2能轉變?yōu)镕H4,它是細菌合成核酸不可缺少的輔酶。由于磺胺藥是FH2合成酶的競爭性抑制劑,進而減少細菌體內(nèi)四氫葉酸的合成,使核酸合成障礙,從而抑制細菌的生長和繁殖。+二氫蝶呤啶+對氨基苯甲酸磺胺類谷氨酸FH2合成酶FH2磺胺類藥物對二氫葉酸合成酶的競爭性抑制
49磺胺藥物的抑菌作用50I和S與E的結合互不相關,既不排斥,也不促進。S可與E結合,也可與EI復合體結合;I可與E結合生成EI,也可與ES復合物結合生成ESI。一旦形成ESI復合物,再不能釋放形成產(chǎn)物P。2.非競爭性抑制(non-competitiveinhibition)51非競爭性抑制動力學圖Vm[S]·v=(Km+[S])(1+[I]Ki)52非競爭性抑制動力學圖V1/Vmax1/Vmax(1+[I]/Ki)Vmax=appVmax1+[I]/Ki53Km不變,Vm減??;Km/Vmax增大。
隨[I]的增加而減?。灰种瞥潭扰c[I]成正比,而與[S]無關。非競爭性抑制的動力學特點VmaxappVmax=appVmax1+[I]/Ki543.反競爭性抑制(uncompetitiveinhibition)反競爭性抑制劑不能與游離酶結合,
而是與ES結合成EIS,并阻止產(chǎn)物生成,稱酶的反競爭性抑制。55酶561Vi=KmVmax1〔S〕+1Vmax〔I〕Ki(1+)Vi=Vmax〔S〕〔S〕〔I〕Ki(1+)Km+反競爭性抑制動力學圖Km1-(1+Ki[I])57當I存在時,Km和Vmax都減小,Km/Vmax不變;表觀Km和Vmax都隨[I]的增加而減小。抑制程度與[I]、[S]均成正比。反競爭性抑制的特點Vmax=appVmax1+[I]/KiKm=appKm1+[I]/Ki5859某種類似于一個酶促反應中底物的過渡態(tài)的物質是酶的有效抑制劑,這種物質稱為過渡態(tài)類似物。酶的自殺底物是一類酶的天然底物的衍生物或類似物。(三)過渡態(tài)類似物與自殺底物60在自殺S的結構中含有一種化學活性基團,當E把它們作為底物來結合時,其潛在的化學基團能被解開或激活,并與酶的活性部位發(fā)生共價結合,使結合物停留在某種狀態(tài),從而不能分解成產(chǎn)物,酶因而致“死”,此過程稱為酶的自殺,這類底物稱為自殺底物(suicidesubstrate)。(三)過渡態(tài)類似物與自殺底物61第五節(jié)酶的分離、提純和活性測定Section5theseparation,purificationandmeasurationofactivityofenzyme62
一、酶的分離提純胞外酶:水解酶類,易收集,不必破碎細胞,緩沖液或水浸泡細胞或發(fā)酵液離心得到上清液即為含酶液。
胞內(nèi)酶:除水解酶類外的其它酶類,需破碎細胞,不同的酶分布部位不同,最好先將酶存在的細胞器分離后再破碎該細胞器,然后將酶用適當?shù)木彌_溶液或水抽提。酶在細胞中的分布:63分離提純的原則選擇酶含量豐富的材料避免蛋白質變性:避免強酸、強堿,低溫每一步驟,都要測定酶的總活力和比活力64每一步都要測定酶的純度(比活力)并計算純化倍數(shù)和產(chǎn)率以決定該步驟的效益和取舍。酶的比活力(純度)=活力單位數(shù)/毫克蛋白純化倍數(shù)=每次比活力/第一次比活力產(chǎn)率=(每次總活力/第一次總活力)×100%純化分離提純的步驟選材-破碎細胞-抽提-純化-保存65二、酶的活力測定(定量)
酶的活力:一般把酶催化一定化學反應的能力稱為酶活力。
酶的活力大小的表示:在一定條件下E所催化的某一化學反應的速度,一定量的酶制劑催化某一化學反應速度快,活力大;反之,活力小。66酶活力單位:最適條件下,單位時間內(nèi),酶催化底物的減少量或產(chǎn)物的生成量。
1961年國際酶學委員會統(tǒng)一規(guī)定1個酶活力國際單位(1U):特定條件下,1分鐘內(nèi)生成1微摩爾/升產(chǎn)物的酶量(或轉化1微摩爾底物的酶量)。
1972年國際酶學委員會又推薦一種新單位,即Katal(Kat)單位:最適條件下,每秒鐘可使1mol/L底物轉化的酶量。即1Kat=6×107IU67第六節(jié)重要的酶類一、寡聚酶(oligomericenzyme)含有2個以上的亞基,分子量大(35000以上)。可分為含相同亞基的寡聚酶和含不同亞基的寡聚酶。含不同亞基的寡聚酶的不同亞基執(zhí)行不同的功能。催化功能和底物載體的功能。68二、同工酶(isoenzyme)概念:
催化相同的化學反應,但分子結構、理化性質乃至免疫學性質不同的一組酶。
存在于同一種屬或不同種屬,同一個體的不同組織、同一細胞的不同亞細胞結構中。乳酸脫氫酶(LDH)是研究的最多的同工酶,具有多種分子組成形式:LDH5(M4)、LDH4(M3H)、LDH3(M2H2)、LDH2(MH3)、LDH1(H4)。69乳酸脫氫酶同工酶形成示意圖多肽亞基mRNA四聚體結構基因ab乳酸脫氫酶同工酶電泳圖譜+–H4MH3M2H2M3HM4點樣線70不同組織中LDH同工酶的電泳圖譜LDH1(H4)LDH2(H3M)LDH3(H2M2)LDH4(HM3)LDH5(M4)心肌腎肝骨骼肌血清-+原點71四、調節(jié)酶
該類酶分子中有活性區(qū)和調節(jié)區(qū),其催化活力可因與調節(jié)劑的結合而改變,有調節(jié)代謝反應的能力。分為共價調節(jié)和變構調節(jié)。72(一)共價調節(jié)酶調節(jié)劑通過共價鍵與酶分子結合,以增減酶分子上的基團來改變酶的活性(高/低,有/無)。
常見類型磷酸化與脫磷酸化(最常見)乙酰化和脫乙?;谆兔摷谆佘栈兔撓佘栈璖H與-S-S互變73變構酶又稱為別構酶,分子中除活性中心外,還有別構中心(結合調節(jié)物或稱效應劑)。變構效應:調節(jié)物與別構中心結合引起酶蛋白構象變化,使酶活性中心對底物的結合和催化作用受影響(改變酶活性),從而調節(jié)酶促反應速度。(二)變構酶74變構劑:凡能使酶分子發(fā)生別構作用的物質。變構激活劑:酶產(chǎn)生變構效應后,導致酶激
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