正向遺傳學(xué)技術(shù)

正向遺傳學(xué)技術(shù)正向遺傳學(xué)傳統(tǒng)的遺傳學(xué)手段大致可以分為“正向遺傳學(xué)”（forwardgenetics）和“反向遺傳學(xué)”（reversegenetics）兩類(lèi)兩者之間正如字面上所說(shuō)是相反的，正向遺傳學(xué)是從表型變化研究基因變化，反向遺傳學(xué)則是從基因變化研究表型變化。正向遺傳學(xué)是指，通過(guò)生物個(gè)體或細(xì)胞的基因組的自發(fā)突變或人工誘變，尋找相關(guān)的表型或性狀改變，然后從這些特定性狀變化的個(gè)體或細(xì)胞中找到對(duì)應(yīng)的突變基因，并揭示其功能簡(jiǎn)單的說(shuō)，正向遺傳學(xué)是從表型變化研究基因變化優(yōu)點(diǎn)：可以通過(guò)突變現(xiàn)象來(lái)揭示基因功能缺點(diǎn)：在操作過(guò)程中需要進(jìn)行誘變篩選，并且要有很多的實(shí)驗(yàn)個(gè)體才能具有可信度，故技術(shù)周期長(zhǎng)；突變還存在有不定向性和低頻性，故得到預(yù)想中的實(shí)驗(yàn)個(gè)體很難；同時(shí)得到突變基因也很難。正向遺傳學(xué)技術(shù)流程第一步；誘變篩選，包括兩種一是大規(guī)模誘變篩選，二是插入誘變篩選。在果蠅的大規(guī)模誘變篩選中，常染色體隱性突變篩選引入平衡染色體大大簡(jiǎn)化了該過(guò)程，平衡染色體有三個(gè)特點(diǎn)；一是含有大規(guī)模的染色體易位，具有正常功能但不會(huì)與相應(yīng)染色體間進(jìn)行同源重組，從而保證了突變的遺傳穩(wěn)定性。二是該染色體上含有一個(gè)顯性標(biāo)記基因，以便鑒別含有該染色體的個(gè)體。三是在純合狀態(tài)下是致死的。用于進(jìn)行化學(xué)誘變的果蠅品系相應(yīng)染色體中帶有一個(gè)隱性標(biāo)記基因

其中平衡染色體上帶有一顯性標(biāo)記基因只是沒(méi)標(biāo)出來(lái)，并純合致死。它會(huì)抑制染色體間的重組。圖中T是代表溫度敏感致死基因，在29℃中培養(yǎng)胚胎會(huì)死。a代表隱性標(biāo)記基因，＊代表新的突變基因插入誘變篩選：利用轉(zhuǎn)座子或病毒載體做誘變劑。還是以果蠅為例，轉(zhuǎn)座子p因子存在于某些果蠅類(lèi)群中，它可以隨機(jī)插入基因組中，并且可以在基因組中移動(dòng)，完整的p因子包括轉(zhuǎn)座所需的特殊序列和一個(gè)轉(zhuǎn)座酶編碼基因。在插入誘變中采用的p因子是缺陷型的，缺乏有功能的轉(zhuǎn)座酶基因，這是為了避免p因子在突變體中隨機(jī)移動(dòng)以保證突變體的穩(wěn)定。p因子介導(dǎo)的誘變篩選是通過(guò)不同品系果蠅的雜交來(lái)實(shí)現(xiàn)的具體步驟如下一品系有缺陷型p因子，另一品系有轉(zhuǎn)座酶雜交后F1代生殖細(xì)胞中，轉(zhuǎn)座酶會(huì)誘導(dǎo)p因子在基因組中隨機(jī)轉(zhuǎn)座引起突變。F1與野生型雜交，F(xiàn)2就會(huì)含有雜合突變個(gè)體，同時(shí)p因子與轉(zhuǎn)座酶基因分離，從而保證后代突變穩(wěn)定性，之后近交獲得純合突變個(gè)體進(jìn)行研究，這一方法的缺點(diǎn)在于p因子的插入位點(diǎn)并不是完全隨機(jī)的，不具有普遍性。第二步；突變基因的克隆。得到所需的突變體后就需要對(duì)引起突變的目的基因進(jìn)行克隆，同時(shí)還要確定所得的基因就是要找的目的基因，當(dāng)它滿(mǎn)足以下三點(diǎn)才可以確定；一是在該突變體中要檢測(cè)到相應(yīng)的基因突變，并且該突變足以引起改基因的失活或功能異常。二是改基因的野生型能夠使突變體表型恢復(fù)。三是在野生型個(gè)體中，通過(guò)技術(shù)手段阻斷該基因的功能，該個(gè)體應(yīng)表現(xiàn)出與突變體一致的表型基因的克隆有兩種方式。一是；對(duì)與p因子或病毒載體引起的插入突變。這種克隆比較簡(jiǎn)單，可以用p因子序列作為探針，從該突變體的基因組文庫(kù)中篩選出含有p因子的克隆，從而確定p因子插入位點(diǎn)和被阻斷的基因，也可用pcr技術(shù)確定插入位點(diǎn)。二是；對(duì)于化學(xué)誘變劑或射線(xiàn)照射引起的突變這種就困難的多，多數(shù)情況下要采用定位克隆。它是根據(jù)目的基因在染色體上的位置進(jìn)行基因分離，通過(guò)分析突變位點(diǎn)與已知分子標(biāo)記的連鎖關(guān)系來(lái)確定突變基因的染色體位置，定位的精確程度是定位克隆成功的關(guān)鍵，它取決于已知染色體分子標(biāo)記的精確程度并需要足夠大的突變體類(lèi)群。定位克隆①以前是通過(guò)家系連鎖分析資料或染色體微小缺失(雜合性丟失)等數(shù)據(jù)，確定基因在染色體上的位置；現(xiàn)在是分子標(biāo)記檢測(cè)手段（簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)性SSLPs，限制片段長(zhǎng)多多態(tài)性RFLPs，單核苷酸多態(tài)性SNPs)的分析，可以將突變基因定位到幾百kb范圍內(nèi)，更加的精確。②過(guò)去通過(guò)染色體步移(chromosome

walking)、染色體區(qū)帶顯微切割等技術(shù)，獲得突變基因所在區(qū)段的DNA片段，現(xiàn)在隨著許多模式生物基因組測(cè)序的完成，相應(yīng)序列只需要進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索就可以獲得。這種方法非常的簡(jiǎn)單快捷。。③首先通過(guò)生物信息學(xué)等手段確定該片段可能含有的基因，并根據(jù)這些基因的可能功能及該突變體的表型初步判斷候選基因。④從這些片段中進(jìn)一步篩選目的基因，并作突變檢測(cè)驗(yàn)證和功能分析正向遺傳學(xué)技術(shù)的應(yīng)用在對(duì)斑馬魚(yú)造血系統(tǒng)進(jìn)行研究時(shí),其發(fā)育早期身體透明,有利于在體視鏡下直接觀察血液系統(tǒng)的發(fā)生發(fā)展：如血液的循環(huán)、心臟的跳動(dòng)、血細(xì)胞的數(shù)量等；并且血細(xì)胞的譜系及調(diào)節(jié)血細(xì)胞的基因與哺乳動(dòng)物高度保守；并且斑馬魚(yú)心血管系統(tǒng)早期發(fā)育與人類(lèi)極為相似,而血液和心血管系統(tǒng)有缺陷的突變體仍然可以存活數(shù)天,為該領(lǐng)域研究提供了極為有利的條件。鑒于這些優(yōu)點(diǎn),斑馬魚(yú)成為了造血系統(tǒng)研究的最佳模式生物,尤其特別適宜于N—乙基—N—亞硝基脲(N-e