分子腫瘤概論和生物學行為介紹

1、 分子腫瘤概論和生物學行為介紹一、有關腫瘤的基本概念（復習）腫瘤（tumor, neoplasm) 基因水平 調(diào)控失常 異常增生 新生物腫瘤生物學行為-浸潤、轉移能力 浸潤 (invasion)：起源處遷移 侵入周圍鄰近組織轉移(metastasis)：從原發(fā)部位血管、淋巴管、體腔它處繼續(xù)生長與原發(fā)瘤同樣類型腫瘤 （轉移瘤或繼發(fā)瘤） 轉移的途徑浸潤生長是惡性腫瘤生長的特點，也是腫瘤轉移過程必經(jīng)的第一步。腫瘤的組織結構 實質(zhì) （parenchyma)間質(zhì) （mesenchyma, stroma) 腫瘤間質(zhì)的主要成分1 血管毛細血管，小動、靜脈血竇樣血管血管球樣增生血管內(nèi)皮增生腫脹新的腫瘤血供模式

2、-血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry，VM)1999年，美國學者Maniotis等一種完全不同于經(jīng)典血管生成的微循環(huán)模式-管壁主要由基底膜(PAS陽性)圍成，外襯以腫瘤細胞-腔內(nèi)有血漿和紅細胞流動, 管道與內(nèi)皮性血管相多存在于高度惡性腫瘤2 結締組織間質(zhì) （1）纖維和基質(zhì) 膠原纖維 常規(guī) HE - 紅 特殊化學染色 VG 改良法- 紅 Masson- 蘭色 構成成分 I II III型膠原原纖維 又由相應原纖維分子構成 免疫組化或分子生物學方法可區(qū)別網(wǎng)狀纖維 銀染-黑色，故也稱嗜銀纖維。 PAS -強陽性 成分 膠原蛋白為主要成分 細胞間質(zhì)網(wǎng)狀纖維- 型膠原蛋白 基底膜網(wǎng)狀

3、纖維- 型膠原蛋白-層黏連蛋白（laminin） 纖維黏連蛋白 Fibronectin（FN） 作用 A. 連接基質(zhì)中各種成分 B. 介導細胞外基質(zhì)成分與細胞表面連接黏蛋白 又稱蛋白多糖（proteoglycan） 如透明質(zhì)酸，硫酸肝素等 骨黏素 （osteonectin） （2）基底膜 (basement membrane , BM) 多種成分 與腫瘤浸潤關系密切 型膠原 層黏連蛋白 （laminin ,LM） （3）細胞成分 固有的細胞成分 -成纖維細胞和纖維細胞-肌成纖維細胞 -間充質(zhì)細胞 -巨噬細胞-樹突狀細胞 反應性細胞成分 各種細胞浸潤 - 淋巴細胞 最常見 -漿細胞 -巨噬細胞

4、都屬免疫活性細胞 二、腫瘤浸潤、轉移的分子機制（一）腫瘤細胞的浸潤轉移 1.腫瘤細胞增殖和擴展 浸潤轉移的前提和基礎 2.腫瘤血管生成(tumor angiogenesis) 腫瘤浸潤轉移的必要條件3.腫瘤細胞分離脫落，與細胞外基質(zhì)黏附 （1）瘤細胞表面負電荷增加 （2）瘤細胞黏附力的改變 瘤細胞自身結構異常 瘤細胞同質(zhì)黏附力下降 指同種瘤細胞之間的黏附力 瘤細胞異質(zhì)黏附力增加 指腫瘤細胞與其它不同細胞及間質(zhì)的黏附力細胞表面的黏附分子介導 通過配-受體之間的識別和結合實現(xiàn) （3）腫瘤黏附因子(adhesion molecules) 細胞表面結構 鈣黏蛋白(cadherin) 又稱為鈣連接素，鈣

5、黏素 據(jù)分布不同 E-鈣黏蛋白 P-鈣黏蛋白 N-鈣黏蛋白 H-cad 整合素(integrin)-細胞表面糖蛋白 ，約有20 多個亞型 -各種腫瘤細胞表面整合素種類不同-腫瘤生長各個階段表達水平也不同 作用 a.介導細胞與細胞外基質(zhì)的黏附 b.參與不同細胞之間的黏附連接 C.扮演細胞信號傳遞的角色 免疫球蛋白超基因家族(immunoglobulin superfamily) 主要參與細胞與細胞間的連接 ICAM-1 （細胞間黏附分子-1） VCAM-1 （血管黏附因子） NCAM （神經(jīng)細胞黏附因子） 其它 包括CEA 、DCC選擇素(selectin) 內(nèi)源性植物凝血素（凝集素） 作用 介

6、導內(nèi)皮細胞、血小板與瘤細胞黏附 選擇素家族包括： P-selectin E-selectin L-selectin CD44 及其它 CD 44(透明質(zhì)酸受體) 路易斯寡糖（SLEX，,s-LewisX ） 跨膜超級家族基因蛋白（TM4ST） 4.瘤細胞的遷移(migration)及化學趨向性 (1)瘤細胞的運動 黏附；肌動蛋白、微管、中間絲 (2)瘤細胞運動的調(diào)節(jié)據(jù)其作用，大致可分為兩大類：既影響運動又影響生長的因子僅影響運動的因子腫瘤細胞運動和增殖 AMF (自分泌運動因子) 1986年Liotta 等首先發(fā)現(xiàn)并命名 它源于腫瘤細胞本身且作用于腫瘤細胞. HGF/SF（肝細胞生長因子/分散

7、因子) 生物學作用存在多態(tài)性 HGF 和AMF是近期發(fā)現(xiàn)的最強大的動力因子 (3)瘤細胞的化學趨向性 21KD 的蛋白質(zhì) 骨吸收因子 5.細胞外基質(zhì)的降解(1)腫瘤浸潤細胞外基質(zhì)的步驟 Liotta 1986年提出 第一步 黏附于基底膜或其他間質(zhì)成分 第二步 分泌蛋白酶并激活, 降解瘤細胞 鄰近的細胞外基質(zhì) 第三步 進入受蛋白酶降解的基質(zhì)區(qū)域內(nèi) (2)腫瘤細胞產(chǎn)生的蛋白水解酶絲氨酸蛋白酶類及其抑制因子纖溶酶 (纖維蛋白溶解酶) 纖溶酶原 a. 降解基質(zhì) b. 激活膠原酶 膠原降解尿激酶型纖溶酶原激活劑(urokinase-type plasminogen activator , u-PA）系統(tǒng)

8、 Au-PA： 介導細胞周圍基質(zhì)蛋白的降解 Bu-PA 受體（u-PAR）及纖溶酶原受體 活化u-PA 原酶形式的u-PA纖溶酶原+纖溶酶原受體 纖溶酶uPA與u-PAR還能激活信號傳導系統(tǒng)，CPAI （PA 抑制劑） PAI1 是u-PA 的主要抑制劑 PAI2 不同腫瘤表達意義不一 PAI3 功能不清基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMP） 需鈣、鋅離子作輔助因子 MMP 分類 膠原酶：如間質(zhì)膠原酶 （Collagenase） 明膠酶：如明膠酶A (gelatinase A) 間質(zhì)溶素：如間質(zhì)溶素1 、2 膜型基質(zhì)金屬蛋白酶：、型 可分別降解ECM中各

9、種不同成分 ECM降解的主要蛋白水解酶類金屬蛋白酶抑制物 TIMP-1 ，TIMP-2 浸潤與否取決于MMP與TIMP的對比 胱氨酸蛋白酶類 Cathepsin B 作用 降解ECM中各種膠原、LM、 FN、黏蛋白 激活間質(zhì)膠原酶和IV型膠原酶天（門）冬氨酸蛋白酶 包括組織蛋白酶D,E ( cathepsin D, E ) CD ： 在腫瘤浸潤轉移中的作用 CD 表達的調(diào)節(jié) 不同組織調(diào)節(jié)因素不完全一致 CE 在腫瘤 6.瘤細胞以主動方式入循環(huán)管道并形成栓子 微小淋巴管、微小靜脈壁 縫隙瘤細胞存在形式 單個 成團 同類癌栓 異類癌栓 黏附分子對其發(fā)揮調(diào)節(jié)作用 7.在特定器官的毛細血管滯留并黏著，

10、再次穿過血管壁并定居、增殖 器關特異性（選擇性）機制 (1) 黏附分子的作用 (2) 化學趨化因子 (3) 微環(huán)境不適合 (4) 與免疫狀態(tài)有關 （二）機體免疫狀態(tài)與腫瘤浸潤轉移 參與控制轉移的免疫細胞主要有 NK 細胞 巨噬細胞 T 淋巴細胞 （三）腫瘤浸潤轉移相關基因 轉移相關基因（四）腫瘤表觀遺傳改變與腫瘤浸潤轉移表觀遺傳學(Epigenetics) -與遺傳學(genetic)相對應的概念-表型狀態(tài)改變，基因型不改變 -沒有DNA序列變化的情況下， 可遺傳的基因表達改變，導致的基因產(chǎn)物的變化。 DNA的“后天性”修飾（如甲基化修飾）、組蛋白的各種修飾等（五）腫瘤干細胞(tumor st

11、em cell, TSC) 2001年由Reya等提出 2006年美國癌癥研究協(xié)會（AACR）定義 存在于腫瘤組織中具有無限自我更新能力并能產(chǎn)生不同分化程度的腫瘤細胞的細胞 特征 (1) 無限增殖和多向分化 (2)存在自我更新的信號傳導途徑 (3)具不同表型，異質(zhì)性，對放化療不敏感 (4)具有端粒酶活性 (5)能轉移到各種不同的組織 （六）腫瘤微環(huán)境與腫瘤浸潤轉移 腫瘤細胞間質(zhì)細胞 細胞外基質(zhì)間質(zhì)細胞所分泌的活性介質(zhì)（細胞因子） 共同構成的局部內(nèi)環(huán)境 微環(huán)境改變腫瘤細胞-自分泌和旁分泌 全身和局部組織-代謝、分泌、免疫 結果： 限制或促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展 三.腫瘤學研究中常用的分子生物學基本技

12、術及其應用(一)基因擴增的檢測1.過量的蛋白表達-免疫組化（熒光）定位 -ELISA和Western blot 定量抗原抗體標記標記抗原標記標記抗原標記標記抗原標記2.基因拷貝數(shù)的增加、轉錄產(chǎn)物mRNA的增加 - 核酸分子生物學方法進行檢測核酸變性、復性基本性質(zhì)常用方法 (1)核酸分子雜交（nucleic acid molecular hybridisation）技術最常用的基本技術基本原理： -標記的已知堿基序列（DNA或RNA單鏈片段）（探針probe ） （同位素P32 I125 非同位素 生物素 地高辛 熒光素） -檢測靶核酸（待測核酸）中是否存在與之 同源的序列 1.原位雜交 （IS

13、H）2.熒光原位雜交 （FISH），3.雙色（多色）銀染原位雜交（DSISH）3.Southern blot (DNA 雜交)4.Northern blot (RNA 雜交)（2）聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction , PCR）技術 又稱體外基因擴增利用DNA變性和復性原理體外進行特定的DNA 片段高效擴增 獲得或放大特異基因信號的重要手段擴增產(chǎn)物的檢測 凝膠電泳分析 瓊脂糖凝膠電泳 (最常用) 聚丙烯酰胺凝膠電泳 單一條帶 Real-time PCR 原位PCR RT-PCR3.基因芯片技術(二)基因突變的檢測方法1.聚合酶鏈反應-單鏈構象多態(tài)性分析（Singl

14、e strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products , PCR-SSCP）長度相同，但堿基序列不同的單鏈DNA 構象不同在非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳遷移率（泳動率）不同基本方法 作PCR 將產(chǎn)物變性而成為單鏈 進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 顯示結果 可用同位素/熒光素標記 非同位素標記 限制性片段長度多態(tài)性（restrection fragment length polymorphisms , RFLP）分析技術基本原理 -序列中一個堿基發(fā)生改變 -使原來的內(nèi)切酶位點消失或產(chǎn)生新的酶

15、切位點-用限制性內(nèi)切酶消化PCR擴增出來的DNA片段 -檢測其酶切片段長度的差異3.變性梯度凝膠電泳法（denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)基本原理 電泳時，不同濃度凝膠溫度不同 DNA鏈中有一個堿基改變 在不同的溫度發(fā)生解鏈 電泳遷移率改變 4. DNA 序列分析（DNA sequencing ） 5. 熒光原位雜交 ( FISH) 6 DNA 芯片技術（DNA chip ）（三）腫瘤的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性分析微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability , MI）, 是指簡單重復序列的增加或丟失 檢測方法 PCR +

16、 DNA 序列凝膠電泳（四）腫瘤易感性檢測 遺傳癌癥綜合征與易感性 癌癥綜合征 易感基因視網(wǎng)膜母細胞瘤 Rb1Wilms 瘤 WT1Li-Fraumeni 綜合征 p53家族性腺瘤性息肉（FAP） APC遺傳性非息肉性結腸癌（HNPCC） hMSH2, hMSH1乳腺癌 BRCA1卵巢癌 BRCA1 采用相應基因變異方法進行檢測（五）腫瘤相關病毒 核酸雜交技術與PCR技術 (六) 基因重組技術 主要目的是獲得某一基因或DNA片段的大 量拷貝 (七) 基因轉染（gene transfection）技術（八）RNA干涉(RNA interference） 核酸雜交/PCR技術與免疫組化/熒光、WB方法結合